一種鯉皰疹病毒II型的dsRNA及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種鯉皰疹病毒II型的dsRNA及其應(yīng)用，屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)在近代得到了迅速發(fā)展，其中淡水魚養(yǎng)殖產(chǎn)量增長最快。鯉科魚 類鯽魚作為我國淡水養(yǎng)殖的優(yōu)良品種，除西部高原外，在全國各地均有分布，具有悠久的養(yǎng) 殖和生長歷史以及極為豐富的資源。近十年來，我國鯽魚養(yǎng)殖的規(guī)模和潛力發(fā)展迅速，其年 總產(chǎn)量現(xiàn)已達(dá)250萬噸，并呈穩(wěn)步上漲趨勢，在淡水養(yǎng)殖中占據(jù)十分重要的地位。而由鯽魚 進(jìn)化而成的金魚，因其易于飼養(yǎng)、身姿奇異、色彩絢麗，深受人們的喜愛。
[0003] 然而1992年秋和1993年春，日本西部養(yǎng)殖金魚發(fā)生皰疹病毒性造血器官壞死病大 流行，死亡率幾乎達(dá)到100%，這是有關(guān)鯉皰疹病毒II型（CYHV-II)的首次報道(Jung SJ etc，1995)。隨后在美國（GroffJ M etc，1998)、澳洲、新西蘭、歐洲等世界各國也陸續(xù)有該 病發(fā)生。1995年我國臺灣進(jìn)口的親本金魚導(dǎo)致繁殖金魚魚苗爆發(fā)性疾病，死亡率高達(dá)95 % (Chang P Η 6化，1999)。2011年0￥!^-11首次在匈牙利養(yǎng)殖的銀鯽體內(nèi)被檢測到后，感染異 育銀鯽的報道陸續(xù)增多。我國在2012年首次報道了異育銀鯽感染病例，隨后陸續(xù)在江蘇、北 京、廣州、武漢等地養(yǎng)殖的異育銀鯽中也檢測到了 CYHV-II，證實(shí)該病毒在我國已有較廣泛 的分布(李剛娟等，2013)。異育銀鯽是江蘇水產(chǎn)養(yǎng)殖的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)，該病自射陽部分水產(chǎn)養(yǎng)殖 場出現(xiàn)后，蔓延至大豐、鹽城、揚(yáng)州等主要水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)域，僅2012年全省鯽魚受災(zāi)面積約45 萬畝，其中絕收塘口面積約2.38萬畝，由此造成的水產(chǎn)品損失約2.96萬噸，直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá) 4億元人民幣，給江蘇鯽魚養(yǎng)殖業(yè)帶來沉重打擊。2014年，CYHV-II導(dǎo)致僅江蘇省異育銀鯽主 養(yǎng)殖區(qū)的經(jīng)濟(jì)損失就高達(dá)30億元以上。
[0004] 雖然CYHV-II僅感染金魚、鯽魚及其普通變種，但其具有較高的傳染性，魚卵、魚 苗、成魚和親魚均可感染（Hedrik等，2006)，但更易于引起小于1齡幼魚的爆發(fā)性死亡 (Groffet al，1998)，且被證實(shí)有垂直傳播的現(xiàn)象(Goodwin,2009)。該病主要發(fā)生在春秋季 節(jié)，水溫15-25°C易發(fā)?。↗ung etc，1995 ;Groffetc，1998)。目前對CYHV-II相關(guān)研究較少， 且大多集中于流行病學(xué)和分子生物學(xué)診斷方法，缺乏有效的防治手段。
[0005] 雙鏈核糖核酸(dsRNA)能夠高效特異性地抑制目的基因的表達(dá)，且抑制效率遠(yuǎn)高 于單鏈RNA，這種效應(yīng)稱之為RNAinterference(RNAi)?？茖W(xué)家在不同物種里面均發(fā)現(xiàn)RNAi 效應(yīng)表明RNAi是在大部分真核生物里都存在的一種保守作用機(jī)制。目前RNAi技術(shù)已被廣泛 應(yīng)用于基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的治療領(lǐng)域，在人類病毒性疾病領(lǐng)域的研究證 實(shí)，RNAi能夠勝任許多病毒病的基因治療，未來或?qū)⒊蔀橐环N有效的抗病毒治療手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種CYHV-II的dsRNA，能夠防止CYHV-II侵害鯽(金)魚。 [0007]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供的dsRNA的單鏈核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所 不。
[0008] 本發(fā)明還提供一種獲得所述dsRNA的方法，是以CYHV-II基因組為模板，設(shè)計引物 擴(kuò)增得到SEQ ID N0.2所示的核苷酸，并通過構(gòu)建基因工程菌表達(dá)SEQ ID N0.2所示的核苷 酸，再從基因工程菌中提取得到所述dsRNA。
[0009] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，以Escherichia coli HT115(DE3)為宿主表達(dá)得到 所述dsRNA。
[0010] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，在SEQ ID NO.2所示的核苷酸片段的兩端分別連接 T7啟動子，連接L4440質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化Escherichia coli HT115(DE3)菌株，構(gòu)建得到表達(dá)所述 dsRNA的基因工程菌。
[0011] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，在SEQ ID N0.2所示的核苷酸片段的兩端分別連接 T7啟動子，連接L4440質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化Escherichia coli HT115(DE3)菌株，構(gòu)建得到表達(dá)所述 dsRNA的基因工程菌;將活化培養(yǎng)后的基因工程菌接種到LB培養(yǎng)基中，37°C、200rpm振蕩培 養(yǎng)至0D6QQ = 0.5，加入IPTG終濃度至0.5mM，繼續(xù)培養(yǎng)6h;采用Tr i zol法提取菌體總RNA，并使 用RNaseA消化掉單鏈RNA。
[0012] 本發(fā)明還提供一種防治CYHV-II感染的疫苗，所述疫苗的有效成分包括核苷酸序 列如SEQ ID NO. 1所示的dsRNA。
[0013] 將本發(fā)明提供的dsRNA通過腹腔注射途徑免疫接種鯽魚，對鯽魚的免疫保護(hù)率是 100% ;dsRNA注射鯽魚免疫后10天進(jìn)行攻毒，攻毒CYHV-II的免疫保護(hù)率為63.9% ;dsRNA免 疫金魚后3天攻毒，免疫保護(hù)率為55% ;可見本發(fā)明提供的dsRNA確實(shí)能起到抵抗CYHV-II侵 害的作用，且免疫保護(hù)能力優(yōu)秀，具有很大的應(yīng)用潛力。
【附圖說明】
[0014] 圖1為dsRNA表達(dá)菌株誘導(dǎo)表達(dá)后提取的RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；泳道M:Marker 泳道1:提取的RNA。
[0015] 圖2為dsRNA免疫鯽魚后立即攻毒的免疫保護(hù)率。
[0016]圖3為dsRNA免疫鯽魚10天后攻毒的免疫保護(hù)率。
[0017]圖4為dsRNA免疫金魚后3天攻毒的免疫保護(hù)率。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 實(shí)施例1: dsRNA表達(dá)菌株的構(gòu)建
[0019] 1、SEQ ID N0:2基因片段的獲得和表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0020]病毒核酸提取試劑盒(TAKARA)提取病料病毒基因組(病料樣品采集于江蘇省大豐 漁場），-20°C凍存?zhèn)溆?。以病毒基因組為模板，以序列分別SEQIDN0.3、SEQIDN0.4的引 物，PCR合成SEQIDN0.2所示的序列。
[0021] TIANGEN公司膠回收試劑盒回收上述基因片段，HindIII、XholI對片段和質(zhì)粒 L4440進(jìn)行雙酶切，酶切片段T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ToplO中，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒 并進(jìn)彳丁測序鑒定，重組質(zhì)粒命名為L_23a。
[0022] 2、dsRNA表達(dá)菌株的構(gòu)建
[0023]制備HT115(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，具體方法同常規(guī)大腸桿菌感受態(tài)制備方法。表達(dá)質(zhì) 粒L-23a采用CaCl2法轉(zhuǎn)入HT115(DE3)中，PCR篩選得到表達(dá)菌株htL23a。同時構(gòu)建空載體對 照表達(dá)菌株htL4440。
[0024] 實(shí)施例2:dsRNA的表達(dá)和提取
[0025] 活化菌株htL23a 1:100加入LB培養(yǎng)基中（150ng/ml Amp)，37°C200rpm振蕩培養(yǎng) OD600 = 0 · 5，加入IPTG終濃度至0 · 5mM，繼續(xù)培養(yǎng)6h。測定0D_后，采用Trizol法提取菌體總 RNA(見圖1)，提取的總RNA使用RNaseA消化掉單鏈RNA。對照組htL4440dsRNA提取方法同上。
[0026] 實(shí)施例3: dsRNA免疫鯽魚后立即攻毒的免疫保護(hù)率
[0027] 體長15cm的健康鯽魚配以循環(huán)水處理和凈化系統(tǒng)，養(yǎng)殖水溫維持23_25°C。暫養(yǎng)10 天后，隨機(jī)分組，每組15尾，設(shè)置2個平行水槽。將制備的dsRNA和CYHV-II病毒混合后采用腹 腔注射的方法免疫。注射dsRNA劑量為1. Oyg/尾，其來源的原始菌量為5 X 107CFU。陰性對照 組注射無菌PBS(磷酸緩沖鹽溶液）。觀察統(tǒng)計各組死亡數(shù)(見圖2)，待各組累計死亡率穩(wěn)定 后，計算每組免疫保護(hù)率(見表1)。
[0028] 按照下列公式計算免疫保護(hù)率:免疫保護(hù)率(RPS) % =(對照組死亡率-免疫組死 亡率)/對照組死亡率X 100%。
[0029] 表1 dsRNA混合CYHV-II注射鯽魚后的免疫保護(hù)率
[0030]
[0031] 從上表可以看出，對免疫后立即攻毒的鯽魚來說，實(shí)施例2獲得的dsRNA(htL23a) 對鯽魚的免疫保護(hù)率是100%，證明dsRNA確實(shí)能起到抵抗CYHV-II侵害的作用，且免疫保護(hù) 能力優(yōu)秀，具有很大的應(yīng)用潛力。
[0032] 實(shí)施例4: dsRNA免疫鯽魚后10天攻毒的免疫保護(hù)率
[0033] 鯽魚的分組和飼養(yǎng)，dsRNA注射劑量均同實(shí)例3 dsRNA注射免疫后10天進(jìn)行攻毒， 觀察統(tǒng)計各組死亡數(shù)(見圖3)，待各組累計死亡率穩(wěn)定后，計算每組免疫保護(hù)率(見表2)。 [0034] 表2 dsRNA注射鯽魚10天后攻毒的免疫保護(hù)率
[0035]
[0036] 從工衣κι 以有qq，頭刪 yijz撕守丄嘆，口，攻毒CYHV-II的 免疫保護(hù)率為63.9%。雖然對比免疫后立即攻毒的免疫保護(hù)率有所下降，但對CYHV-II仍有 較好的抵抗能力，可以明顯降低鯽魚的死亡率。并且在以后改進(jìn)免疫程序后，存在很大的可 能進(jìn)一步提升免疫保護(hù)率。
[0037] 實(shí)施例5: dsRNA免疫金魚后3天攻毒的免疫保護(hù)率
[0038]健康金魚配以循環(huán)水處理和凈化系統(tǒng)，養(yǎng)殖水溫維持23-25°C。暫養(yǎng)10天后，隨機(jī) 分組，每組10尾，設(shè)置2個平行水槽。免疫注射dsRNA劑量為200ng/尾，陰性對照組注射無菌 PBS。觀察統(tǒng)計各組死亡數(shù)17天(見圖4)，計算每組免疫保護(hù)率(見表3)。
[0039] 表3 dsRNA注射金魚3天后攻毒的免疫保護(hù)率
[0040]
[0041] 雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種dsRNA，其特征在于，單鏈核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。2. -種編碼權(quán)利要求1所述dsRNA的DNA。3. 含有權(quán)利要求2所述DNA的載體或重組細(xì)胞。4. 一種表達(dá)權(quán)利要求1所述dsRNA的基因工程菌，其特征在于，以Escherichia col i HT115(DE3)為宿主，以L4440質(zhì)粒為表達(dá)載體。5. -種獲得權(quán)利要求1所述dsRNA的方法，其特征在于，是通過構(gòu)建基因工程菌表達(dá)SEQ ID NO.2所示的核苷酸，再從基因工程菌中提取得到所述dsRNA。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所的方法，其特征在于，以Escherichia coli HT115(DE3)為宿主。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所的方法，其特征在于，在SEQ ID NO. 2所示的核苷酸片段的兩端分 別連接T7啟動子，連接L4440質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化Escherichia coli HT115(DE3)菌株，構(gòu)建得到表 達(dá)所述dsRNA的基因工程菌。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所的方法，其特征在于，將活化培養(yǎng)后的基因工程菌接種到LB培養(yǎng)基 中，37°C、200rpm振蕩培養(yǎng)至0D_ = 0.5，加入IPTG終濃度至0.5mM，繼續(xù)培養(yǎng)6h;采用Trizol 法提取菌體總RNA，并使用RNaseA消化掉單鏈RNA。9. 權(quán)利要求1所述dsRNA在制備用于治療或預(yù)防鯉皰疹病毒II型感染的藥物中的應(yīng)用。10. -種疫苗，其特征在于，有效成分包括核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的dsRNA。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鯉皰疹病毒II型的dsRNA及其應(yīng)用，屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明從CYHV-II基因組中篩選得到了一段核苷酸序列，通過構(gòu)建基因工程菌，表達(dá)得到相應(yīng)的dsRNA，以所得dsRNA免疫鯽魚、金魚，能夠有效保護(hù)魚免受CYHV-II的侵害；具有巨大的市場應(yīng)用價值。
【IPC分類】A61K31/713, A61K48/00, C12N15/113, A61P31/22, C12N15/70
【公開號】CN105567693
【申請?zhí)枴緾N201610109702
【發(fā)明人】不公告發(fā)明人
【申請人】江蘇海健前沿生物科技有限公司
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年2月26日