一種昆蟲干標(biāo)本基因組提取方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種昆蟲干標(biāo)本基因組DNA提取方法，為改進(jìn)的飽和NaCl法，包括以下步驟：(1)昆蟲干標(biāo)本的預(yù)處理(2)研磨預(yù)處理的材料至粉狀，將研磨產(chǎn)物轉(zhuǎn)入1.5mlEP管，(3)加入溶液1溶解，除RNA，(4)加入消化液2消化，離心，轉(zhuǎn)移上清至另一EP管，(5)蛋白質(zhì)沉淀，(6)洗滌。本發(fā)明的方法適用于膜翅目、蜻蜒目、直翅目、鞘翅目等多種昆蟲干標(biāo)本不同部位DNA提取，提取效率高，所提DNA質(zhì)量和純度可供昆蟲分子系統(tǒng)進(jìn)化分析，為研究、探索最合適部位、最小量材料、最小損壞標(biāo)本提取昆蟲干標(biāo)本基因組DNA提供了基礎(chǔ)方法，操作簡單易行，便于實(shí)驗(yàn)室開展。
【專利說明】一種昆蟲干標(biāo)本基因組提取方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種昆蟲標(biāo)本基因組DNA提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]DNA是遺傳信息的載體，是分子生物學(xué)研究的主要對象。由于DNA序列中含有豐富的生物學(xué)信息，記載了生物進(jìn)化的歷史。在活體細(xì)胞中，DNA存在完整的修復(fù)機(jī)制，使DNA完整無損。但DNA化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定，在干標(biāo)本中可以通過水解或氧化作用自發(fā)地降解。在標(biāo)本館中的干標(biāo)本是一個巨大的遺傳基因信息庫，現(xiàn)代分子生物學(xué)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)技術(shù)、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)技術(shù)DNA指紋技術(shù)、以及對12srRNA，16srRNA, 18SrRNA,ND5等序列的測定，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于昆蟲分類的研究。應(yīng)用DNA序列研究生物的系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化規(guī)律成為當(dāng)前分子系統(tǒng)學(xué)研究的熱點(diǎn)。而這些技術(shù)的應(yīng)用，首先最基本的問題是基因組DNA的提取.技術(shù)的迅速發(fā)展使我們得以在分子水平上揭示和利用這個巨大的遺傳信息庫變得可能，這為生物分類、系統(tǒng)發(fā)育、生態(tài)和進(jìn)化提供了新的科學(xué)依據(jù)和發(fā)展機(jī)會。許多研究者介紹的基因組DNA的提取方法中所采用的材料基本上是新鮮樣品或超低溫冷凍標(biāo)本(Blin&Stafford, 1976 ；Bowtell, 1987 ；Gross-Bellardd el al., 1972 ；Kupiec el al.，1987 ;王文和施立明，1993)，但是分子系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化研究中經(jīng)常出現(xiàn)所研究的類群，特別是稀有類群難以得到新鮮材料的問題，因此往往需要利用自然博物館或標(biāo)本館的干標(biāo)本提取基因組DNA，但干標(biāo)本保存時間越長基因組DNA的降解也越嚴(yán)重。因此，如何從干標(biāo)本中提取基因組DNA的方法對系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化研究至關(guān)重要。
[0003]目前，國內(nèi)外提取昆蟲干標(biāo)本的主要方法有:CTAB法，SDS法，蛋白酶K法，飽和NaCl法，酚仿抽提法等。酚仿抽提法是提取核酸的經(jīng)典方法，主要原理是利用核酸、蛋白等雜質(zhì)在水相和有機(jī)相中溶解度不同而重新分配，實(shí)質(zhì)上為使用蛋白酶K消化后用酚/氯仿去除蛋白質(zhì)的抽提方法。CTAB法為Murray和Thompson發(fā)明的,其原理為CTAB是一種離子型去垢劑，能使核酸和酸性多糖從低離子強(qiáng)度的溶液中沉淀出來，同時，蛋白質(zhì)和中性多糖等雜質(zhì)留在溶液中。CTAB法常用于新鮮植物組織的DNA提取。SDS法由Dellaporta等發(fā)明，利用SDS-Tris-Cl-EDTA等直接裂解細(xì)胞釋放DNA，用酚/氯仿反復(fù)抽提后乙醇沉淀出DNA。
[0004]傳統(tǒng)DNA提取方法，如SDS法、CTAB法、蛋白酶K法經(jīng)不少專家學(xué)者改進(jìn)后，僅可提取出某個目或某些昆蟲的干標(biāo)本DNA。蛋白酶K法中蛋白酶K的用量與最終DNA的得率成正比(Kosel&Grae2ber, 1994 ;Diaz2Cano&Brady, 1997),在消化過程中加入還原劑(巰基乙醇或二硫蘇糖醇DDT)似乎可以提高DNA的得率(Paabo，1989)。一般用乙醇沉淀DNA。然而，Kosel&Grae2ber (1994)認(rèn)為用這種方法提取標(biāo)本DNA，PCR抑制劑會與DNA —起被抽提出來，影響后面的PCR反應(yīng)。劉波等(1999)用CTAB法分別對稻蝗(Oxya)的干標(biāo)本和酒精浸泡標(biāo)本的DNA進(jìn)行提取并獲得了滿意結(jié)果。張晟銘等利用SDS法提取了鞘翅目小蠹科的干標(biāo)本DNA。由此可知:上述各種昆蟲干標(biāo)本DNA提取方法適用范圍極其狹窄，僅僅適合于某一種或某一昆蟲目干標(biāo)本基因組DNA的提取，對其他類別的昆蟲干標(biāo)本DNA的提取并未取得良好的效果，而且酚仿抽提法提取DNA含有較多雜質(zhì)，對于微量組織和多年保存的干標(biāo)本，此3種方法提取效果較差，不能進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增等后續(xù)研究。國內(nèi)外以昆蟲干標(biāo)本基因組DNA為研究的僅僅集中在膜翅目、鱗翅目、鞘翅目等少數(shù)幾個目，而且昆蟲干標(biāo)本DNA的提取方法各自不同。然而，由于昆蟲種類之多，體系龐大，發(fā)育階段存在差異，未涉及研究的昆蟲仍不能快速有效地確定提取方法，使得昆蟲標(biāo)本館中的所蘊(yùn)藏的巨大的遺傳基因信息庫不能得以利用，嚴(yán)重阻礙了昆蟲的分子系統(tǒng)進(jìn)化的研究進(jìn)程。昆蟲分子系統(tǒng)學(xué)研究領(lǐng)域迫切需要一種可適用于多個類目昆蟲干標(biāo)本的基因組DNA提取方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種適用于多個目昆蟲的干標(biāo)本基因組DNA提取方法。
[0006]為實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案:
[0007]一種昆蟲干標(biāo)本基因組DNA提取方法，為改進(jìn)的飽和NaCl法，包括以下步驟
[0008](I)昆蟲干標(biāo)本樣品的獲取和預(yù)處理，研磨預(yù)處理材料至粉狀，將研磨產(chǎn)物轉(zhuǎn)入Ep管，
[0009](2)加入溶液(I)溶解，除RNA，
[0010](3加入消化液(2)消化，離心，轉(zhuǎn)移上清至另一 Ep管，
[0011](4)蛋白質(zhì)沉淀，
[0012](5)洗滌，
[0013](6)干燥，
[0014](7)TE溶解，-2(rC保存?zhèn)溆谩?br> [0015]步驟(1)所述的昆蟲干標(biāo)本樣品的用于提取基因組DNA，獲取方法為:從昆蟲標(biāo)本胸部和足部、頭部剪取肌肉0.03g，于STE緩沖液(0.1mmol/LNaCI, pH8.010mmol/L Trisbuffer, pH8.0lmmol/L EDTA, dsH20)中室溫浸泡預(yù)處理5h，取出后在消毒的濾紙上干燥。
[0016]步驟(1)所述的研磨放入Ep管中采用滅菌的玻棒研在Ep管中磨碎所述研磨得到的粉末用含0.4ml TE溶解懸浮。
[0017]步驟⑵所述溶液I用量為300~400 μ 1，所述溶液(I)為包含0.1 %的RNase的0.4ml TE，步驟(3)所述去除RNA的溫度為35~37°C，時間為45~60min，室溫離心12000rpmlmino
[0018]步驟(3)所述消化液I用量為300~400 μ 1，所述消化液⑵包括成為:2~8%SDS’ 100~300 μ g/ml的蛋白酶K ，所述消化液⑵的PH為8.0,步驟(4)所述消化溫度為25~37°C，時間為，16~30h。
[0019]步驟(4)所述蛋白質(zhì)沉淀包括:
[0020]I)加1/4體積飽和NaCl,潤旋s或靜置5~8min, 12000r/min離心20min,將上清轉(zhuǎn)移到另一支離心管，
[0021]2)加等體積的氯仿,充分混勻后離心12000r/min離心15min,
[0022]3)吸取水相至另一新管內(nèi)，加入1/10體積的3M NaAc (pH5.2)混勻后，加入等體積的異丙醇并輕輕混勻，12000rpm離心5min離心,去除上清液。
[0023]步驟(5)所述洗滌是加入70%乙醇0.6ml，可見乳白色絮狀DNA團(tuán)塊，充分洗滌
DNA沉淀。[0024]步驟(6)所述干燥選自空氣中自然干燥或置37 °C溫箱中干燥3min。
[0025]步驟(7)所述TE溶解為加入TE (pH8.0) 30~45 μ I溶解DNA。
[0026]所述的0.1%是指100mg/ml,所述的2~8%是指2~8g/100ml,所述的70%乙醇是指70ml純酒精用滅菌的三蒸水定容到100ml的酒精溶液。
[0027]本發(fā)明的TE 成分為:10mM Tris-HCl,0.1Mm EDTA，ρΗ8.0。
[0028]本發(fā)明改進(jìn)的NaCl法提取干標(biāo)本基因組DNA的工作原理是:
[0029]預(yù)處理用于提取DNA的干標(biāo)本材料，研磨待提取材料至粉狀，使待提取DNA的標(biāo)本樣品可充分吸收下一步加入的溶液(I)。加入的溶液(I)含RNAse，去除RNA，這比常規(guī)DNA提取方法在提取之后的DNA保存步驟再去除RNA，更加簡便；之后用含SDS和蛋白酶K的消化液(2)消化，再用飽和NaCl、氯仿沉淀除去蛋白質(zhì)，異丙醇沉淀目標(biāo)DNA，70%乙醇洗滌目標(biāo)DNA之后干燥，[0030]最后TE溶解-20 V保存。
[0031 ] 2.提取的目標(biāo)基因組DNA的鑒定
[0032]用本方法提取的多種類目昆蟲干標(biāo)本基因組DNA，可經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳和PCR檢測其濃度和質(zhì)量。
[0033]PCR檢測可選取拷貝數(shù)多的線粒體COI基因?qū)\(yùn)用飽和NaCl法提取的膜翅目不同科干標(biāo)本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0034]3.本方法的用途
[0035]本方法可應(yīng)用于從蜻蜓目Odonata、櫝翅目Plecoptera、直翅目Orthoptera、同翅目 Homoptera、半翅目 Hemiptera、銷翅目 Coleoptera、廣翅目 Megaloptera、雙翅目 Diptera、毛翅目 Trichoptera、膜翅目 Hymenopteral、鱗翅目 Lepidoptera、賠贈目Ephemeroptera、幢螂目Mantodea、長翅目Mecoptera、脈翅目Neuroptera的任一種干標(biāo)本提取基因組DNA，提取得到的DNA含量可滿足分子生物學(xué)后續(xù)實(shí)驗(yàn)對DNA濃度和質(zhì)量的要求。本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)和積極效果:
[0036]1、本發(fā)明具有廣泛的昆蟲種類適用范圍，能夠?qū)崿F(xiàn)大部分昆蟲目干標(biāo)本DNA的提取。能夠提取蜻蜓目Odonata、櫝翅目Plecoptera、直翅目Orthoptera、同翅目Homoptera、半翅目Hemiptera、銷翅目Coleoptera、廣翅目Megaloptera、雙翅目Diptera、毛翅目Trichoptera、膜翅目 Hymenopteral、鱗翅目 Lepidoptera、輕蝣目 Ephemeroptera、幢螂目Mantodea、長翅目Mecoptera、脈翅目Neuroptera昆蟲干標(biāo)本DNA。
[0037]2、提取效率高，所提DNA的量較高，線粒體COI基因的成功擴(kuò)增說明本發(fā)明所提取的干標(biāo)本DNA質(zhì)量和純度能夠應(yīng)用于昆蟲分子系統(tǒng)進(jìn)化分析。
[0038]3.能夠用于昆蟲干標(biāo)本不同部位DNA的提取，為研究、探索最合適部位、最小量材料、最小損壞標(biāo)本提取昆蟲干標(biāo)本基因組DNA提供了基礎(chǔ)方法。
[0039]4、操作簡單易行，可在一般實(shí)驗(yàn)室開展，十分方便。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1.四種方法提取膜翅目姬蜂干標(biāo)本基因組DNA的電泳結(jié)果(1.飽和氯化鈉法；
2.SDS法；3.CTAB法；4.蛋白酶K法)
[0041]圖2.飽和氯化鈉法提取膜翅目不同科干標(biāo)本基因組DNA電泳結(jié)果[0042](I,姬蜂科 Ichneumonidae ;2，蜜蜂科 Apidae ;3，胡蜂科 Vespidae ;4，葉蜂科Tenthredinidae ;5，熊蜂科 Bombidae AJj^AFormicidae ;7，木蜂科 Xylocopidae.M.分子量標(biāo)準(zhǔn))
[0043]圖3.飽和NaCl法提取不同目昆蟲干標(biāo)本基因組DNA結(jié)果
[0044](I，直翅目幢科Acrididae ;2，雙翅目蛇科Acrididaee ;3，半翅目緣蝽科Coreidae ;4，同翅目[il單科；Cicadidae ;5,靖艇目媳科Coenagrionidae ;6，銷翅目步甲科Carabidae ;7，櫝翅目原櫝科Placoptera ;8,毛翅目石蛾科Phryganeidae ;9，廣翅目魚蛉科Corydalidae ;10，膜翅目胡蜂科Vespidae ;Μ.分子量標(biāo)準(zhǔn))
[0045]圖4.膜翅目不同科提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖
[0046]I, Vespidae 胡蜂科；2, Tenthredinidae 葉蜂科；3, Apidae 蜜蜂科；4，Ichneumonidae 姬蜂科；5, Formicidae 蟻科；6, Bombidae 熊蜂科.Μ.分子量標(biāo)準(zhǔn))
【具體實(shí)施方式】
[0047]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明:
[0048]實(shí)施例1改進(jìn)的飽 和氯化鈉法提取不同目昆蟲干標(biāo)本基因組DNA及其檢測
[0049]1.DNA 提取
[0050](I)從昆蟲干標(biāo)本頭、胸、足獲取用于提取基因組DNA的樣品0.03g，在STE緩沖液(0.lmmol/L NaCl,pH8.0 IOmmoI/L Tris buffer,pH8.0 lmmol/LEDTA, dsH20)中室溫浸泡預(yù)處理5h，取出后在消毒的濾紙上干燥，
[0051](2)將干燥的預(yù)處理材料放入Ep管中用滅菌的玻棒研磨碎至粉狀，將研磨產(chǎn)物轉(zhuǎn)入Ep管,
[0052](3)加入溶液 I (包含 0.1 % 的 RNase 的 0.4ml TE) 350 μ I 溶解，去除 RNA ；
[0053](4)加入消化液2包括2~8% SDS, 100~300 μ g/ml的蛋白酶K，PH為8.0)消化溫度為25~37°C消化lOmin，離心，轉(zhuǎn)移上清至另一 1.5ml Ep管，
[0054](5)蛋白質(zhì)沉淀:
[0055]I)加1/4體積飽和NaCl,潤旋30s或靜置5~8min, 12000r/min離心20 min,將
上清轉(zhuǎn)移到另一支離心管，
[0056]2)加等體積的氯仿,充分混勻后離心12000r/min離心15min,
[0057]3)吸取水相至另一新管內(nèi)，加入1/10體積的3M NaAc (pH5.2)混勻后，加入等體積的異丙醇并輕輕混勻，12000rpm離心5min離心,去除上清液。
[0058](6)洗滌:加入70%乙醇0.6ml，可見乳白色絮狀DNA團(tuán)塊，充分洗滌DNA沉淀
[0059](7)自然干燥，
[0060](8)加入 TE (ρΗ8.0) 30 ~45 μ I 溶解 DNA，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0061]2.提取的DNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測
[0062](1.)飽和氯化鈉法提取膜翅目不同科干標(biāo)本基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳
[0063](I,姬蜂科 Ichneumonidae ;2，蜜蜂科 Apidae ;3，胡蜂科 Vespidae ;4，葉蜂科Tenthredinidae ;5，熊蜂科 Bombidae AJj^AFormicidae ;7，木蜂科 Xylocopidae.M.分子量標(biāo)準(zhǔn))
[0064]檢測結(jié)果見圖2[0065](2)飽和NaCl法提取不同目昆蟲干標(biāo)本基因組DNAl %瓊脂糖凝膠電泳檢測
[0066](I，直翅目幢科Acrididae ;2，雙翅目蛇科Acrididaee ;3，半翅目緣蝽科Coreidae ;4，同翅目[il單科；Cicadidae ;5,靖艇目媳科Coenagrionidae ;6，銷翅目步甲科Carabidae ;7，櫝翅目原櫝科Placoptera ;8,毛翅目石蛾科Phryganeidae ;9，廣翅目魚蛉科Corydalidae ;10，膜翅目胡蜂科Vespidae ;Μ.分子量標(biāo)準(zhǔn))
[0067]檢測結(jié)果見圖3
[0068](3)膜翅目不同家族看昆蟲干標(biāo)本基因組DNA飽和氯化鈉法提取產(chǎn)物PCR擴(kuò)增電泳((I, Vespidae 胡蜂科；2, Tenthredinidae 葉蜂科；3, Apidae 蜜蜂科；4, Ichneumonidae姬蜂科；5, Formicidae蟻科；6, Bombidae熊蜂科Μ.分子量標(biāo)準(zhǔn))
[0069]檢測結(jié)果見圖4。
[0070]2.四種方法提取膜翅目姬蜂干標(biāo)本基因組DNA的電泳檢測
[0071](1.)飽和氯化鈉法；(2.) SDS法；(3.) CTAB法；(4).蛋白酶K法
[0072](具體操作步驟按照常規(guī)分子生物學(xué)操作指南)
[0073]檢測結(jié)果見圖1
[0074]以上檢測結(jié)果表明，采用飽和氯化鈉法對不同目的昆蟲干標(biāo)本基因組DNA提取得到的DNA產(chǎn)量可滿足后續(xù)分子系統(tǒng)學(xué)實(shí)驗(yàn)的需求。
[0075]本發(fā)明不局限于上述具體的實(shí)施方式，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員從上述構(gòu)思出發(fā)，不經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動，所作出的種種 變換，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種昆蟲干標(biāo)本基因組DNA提取方法，為改進(jìn)的飽和NaCl法，包括以下步驟: (1)昆蟲干標(biāo)本樣品的獲取和預(yù)處理 (2)加入溶液(I)溶解，除RNA, (3)加入消化液(2)消化， (4)蛋白質(zhì)沉淀， (5)洗滌， (6)干燥， (7)TE溶解，_20°C保存?zhèn)溆茫? 其特征在于，步驟(1)所述的獲取待提取用于提取DNA的材料的方法為:所述昆蟲干標(biāo)本樣品為用于提取DNA的材料的部位，包括足、胸、頭、，重量為0.03g。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的昆蟲干標(biāo)本基因組DNA提取方法，其特征在于，步驟(1)所述昆蟲干標(biāo)本的預(yù)處理是將昆蟲干標(biāo)本樣品在STE緩沖液中室溫浸泡預(yù)處理5h，取出后在消毒的濾紙上干燥，放入Ep管中用滅菌的玻棒研磨碎,所述研磨得到的粉末用含0.4ml TE溶解懸浮，所述 STE 緩沖液組成為 0.1mmol /T, NaCl, 10mmol /T, Tris bufferpH8.0, Immol /T, EDTA,dsH20,所述STE緩沖液的PH為8.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的昆蟲干標(biāo)本基因組DNA提取方法，其特征在于，步驟(2)所述溶液I用量為300~400 μ 1，所述溶液(I)為包含2%的RNase的0.4ml TE，步驟(2)所述溶解的溫度為35~37°C，時間為45~`60min，溶解后室溫離心12000rpmlmin。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的昆蟲干標(biāo)本基因組DNA提取方法，其特征在于，步驟(3)所述消化液⑵用量為300~400 μ 1，所述消化液⑵包括成為:2~8% SDS, 100~300 μ g/ml的蛋白酶K，所述消化液(2)的PH為8.0,步驟(4)所述消化溫度為25~37°C，時間為，16~30h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的昆蟲干標(biāo)本基因組DNA提取方法，其特征在于，步驟(4)所述蛋白質(zhì)沉淀包括: 1)加1/4體積飽和NaCl,潤旋30s或靜置5~8min,12000r/min離心IOmin,將上清轉(zhuǎn)移到另一支離心管， 2)加等體積的氯仿，充分混勻后離心12000r/min離心IOmin, 3)吸取水相至另一新管內(nèi)，加入1/10體積的3MNaAc (pH5.2)混勻后，加入等體積的異丙醇并輕輕混勻，12000rpm離心5min離心,去除上清液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的昆蟲干標(biāo)本基因組DNA提取方法，其特征在于，步驟(5)所述洗滌是加入70%乙醇0.6ml，可見乳白色絮狀DNA團(tuán)塊，充分洗滌DNA沉淀。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的昆蟲干標(biāo)本基因組DNA提取方法，其特征在于，步驟(6)所述干燥選自空氣中自然干燥或置37 °C溫箱中干燥3min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的昆蟲干標(biāo)本基因組DNA提取方法，其特征在于，步驟(7)所述TE溶解為加入TE (pH8.0) 30~45 μ I溶解DNA，-20°C保存。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲干標(biāo)本基因組DNA提取方法，其特征在于，可適用于選自靖艇目Odonata、積翅目Plecoptera、直翅目Orthoptera、同翅目Homoptera、半翅目Hemiptera、銷翅目Coleoptera、廣翅目Megaloptera、雙翅目Diptera、毛翅目Trichoptera、膜翅目 Hymenopteral、鱗翅目 Lepidoptera、輕蝣目 Ephemeroptera、幢螂目Mantodea、長翅目Mecoptera`、脈翅目Neuroptera的干標(biāo)本的基因組DNA提取。
【文檔編號】C12N15/10GK103509786SQ201310201634
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年5月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月21日
【發(fā)明者】南小寧, 伏正, 魏琮, 馮繼廣, 周浪, 趙雅瓊, 郭新榮 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)