由[→5)β-D-Galf(1→]糖基組成的半乳寡糖的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種由[→5)β-D-Galf(1→]糖基組成的半乳寡糖的制備方法，制備步驟為：將以[→5)β-D-Galf(1→]糖基為側(cè)鏈，以甘露聚糖為主鏈的多糖配制成質(zhì)量濃度為1.0%~15%的水溶液，在攪拌狀態(tài)下加入0.1-1.0mol/L酸溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH值到1.5-3.5，20-90°C恒溫水浴下水解1-6小時(shí)；堿中和，醇沉，去除未降解的甘露糖主鏈；2000g-6000g離心10-30分鐘，上清液除醇并濃縮至原體積的五分之一；用低壓柱色譜進(jìn)行分離，用示差折光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，按洗脫峰合并收集，去除流動(dòng)相，冷凍干燥即可。本發(fā)明簡(jiǎn)化了工藝操作并提高了寡糖的制備效率。
【專利說明】由[→5) β-D-Ga lf(1→]糖基組成的半乳寡糖的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及由[—5) β -D-Galf (1→]糖基組成的半乳寡糖的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]糖類化合物廣泛存在于自然界，具有非常重要的生物活性，在許多生理和病理過程中扮演著十分重要的角色。在自然界發(fā)現(xiàn)的糖類化合物中，吡喃型寡糖分布廣泛，其生物學(xué)研究及合成制備發(fā)展十分迅速。相對(duì)于吡喃型寡糖，呋喃型寡糖的研究滯后許多。有關(guān)呋喃型寡糖的生物合成過程和新陳代謝機(jī)制尚未得到完全的闡釋；而有關(guān)呋喃型寡糖的制備則更為少見，且不成熟。
[0003]含呋喃型結(jié)構(gòu)的寡糖主要來源于細(xì)菌、真菌、植物和原生動(dòng)物等。這類寡糖是構(gòu)成上述生命體的細(xì)胞壁糖肽、糖脂、糖蛋白等的重要生物分子，起到結(jié)構(gòu)支撐和信息傳遞作用。呋喃型半乳糖最主要的存在形式是D-半乳糖，具有兩種糖苷鍵構(gòu)型，即α-和β-;其中，β -D-呋喃型半乳糖(β -D-Gal/)分布于許多致病和非致病性的微生物以及一些多細(xì)胞生物中。
[0004]研究顯示，分支桿菌的存活能力和致病性與β-D-Gal/糖基密切相關(guān)；半乳呋喃糖基轉(zhuǎn)移酶，有望成為治療細(xì)菌感染的新靶點(diǎn)。含有β-D-Gal/糖基的糖類化合物在革蘭氏陰性菌中比較常見，這些糖基存在形式包括[→) β -D-Gal/d → ]、[ → 3)β -D-Gal/(I→ ]、[→ 5) β -D-Gal/(I→]和[→6) β -D-Gal/(I →]。研究表明，曲霉屬和青霉屬真菌的胞外多糖中主要存在[—5) β -D-Gal/(I →]連接的糖基側(cè)鏈，而糖基主鏈一般由[→2) a -D-Man/? (I→]和[→6) a -D- Manp(I→]構(gòu)成。此外,一些微型藻類中也含有β-D-Gal/糖基的糖化合物。綜上所述，β-D-Gal/糖基寡糖的制備十分必要和有意義。
[0005]近些年，呋喃型寡糖的合成研究也有了一定的突破。一般是采用糖苷化反應(yīng)將糖基片段連接起來，在采用選擇性脫除保護(hù)基，進(jìn)行下一步連接，即逐步增加糖鏈的長度。目前，有機(jī)合成的[→5) β -D-Gal/(1 →]寡糖的最大聚合度僅為4。在寡糖合成的過程中，因涉及羥基的保護(hù)和脫保護(hù)、糖殘基間的選擇性連接以及因定位修飾遇到的立體構(gòu)型等系列問題，其技術(shù)難度較大、得率低、合成成本高、安全性差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明針對(duì)以上不足之處，提供了一種由[→5) β-D-Galf(l→]糖基組成的半乳寡糖的制備方法，簡(jiǎn)化了工藝操作并提高了寡糖的制備效率。
[0007]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
由[→5) β -D-Gal/(1→]糖基組成的半乳寡糖的制備方法，包含有如下步驟:
A、多糖降解:將以[―5) β-D-Galf (I→ ]糖基為側(cè)鏈，以甘露聚糖為主鏈的多糖配制成質(zhì)量濃度為1.0%-15%的水溶液，在攪拌狀態(tài)下加入0.1-1.0 mol/L酸溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH值到L 5-3.5，20-90 ° C恒溫水浴下水解1-6小時(shí)；
B、中和、濃縮:將上述溶液用堿中和至pH值到7.0，將中和后的溶液濃縮至糖的質(zhì)量濃度為10.0% ；
C、醇沉:將上述濃縮后的溶液加入濃縮后溶液4倍體積的醇，在4°C —25° C下醇沉12小時(shí)，去除未降解的甘露糖主鏈；
D、離心、濃縮:將上述醇沉后的溶液在2000-6000g的條件下離心10-30分鐘，將離心獲得的上清液除醇并濃縮至原體積的五分之一；
E、分離、檢測(cè)、收集:將上述濃縮后的溶液用低壓柱色譜進(jìn)行分離，用示差折光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，按洗脫峰合并收集，去除流動(dòng)相，冷凍干燥即可。
[0008]進(jìn)一步的所述低壓柱色譜分離以0.1-0.5mol/L的碳酸氫銨水溶液為流動(dòng)相，用Bio-Gel P4、Bio-Gel P6 或 Superdex 30 為色譜柱填料。
[0009]進(jìn)一步的所述酸為鹽酸、硫酸、亞硫酸、硝酸、亞硝酸、甲酸、乙酸、抗壞血酸、草酸、檸檬酸、氯乙酸、三氯乙酸和三氟乙酸中的任一種；所述堿是氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨或碳酸氫氨中的任一種；所述醇是甲醇、乙醇或異丙醇中的任一種。
[0010]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明采用酸降解法，得到具有不同聚合度的且性能結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的[—5)i3-D-Gal/(l —]糖基組成的半乳寡糖，此法只需要采用簡(jiǎn)單的無機(jī)酸或者有機(jī)酸降解即可得到系列寡糖混合物，該混合物再經(jīng)簡(jiǎn)單的低壓柱色譜分離，便可得到純品寡糖單體，操作簡(jiǎn)單，大大簡(jiǎn)化了寡糖的制備工.藝，且該法無三廢污染，制備效率高；
本發(fā)明采用Bio-Gel P4、Bio-Gel P6或Superdex 30填料進(jìn)行寡糖混合物分離,一次分離即可得到聚合度為2-10的[—5) β -D-Gal/(I —]糖基組成的半乳寡糖；
本發(fā)明采用碳酸氫銨作為流動(dòng)相，克服了寡糖單體制備中后續(xù)除鹽的困難，縮短了時(shí)間并提聞了廣品的品質(zhì)和得率；
本發(fā)明克服了現(xiàn)有合成技術(shù)難以快速制備大量[—5) β -D-Gal/(1 —]寡糖的困難，且所得寡糖的聚合度(2-10)較現(xiàn)有報(bào)道的合成的該類型的寡糖的聚合度(2-4)提高了一倍有余，為進(jìn)一步開展寡糖及其衍生物的構(gòu)效關(guān)系和分子機(jī)制研究、尤其是指導(dǎo)寡糖類新藥的研究與開發(fā)方面，都具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為本發(fā)明制備[—5) β -D-Gal/(1 —]半乳寡糖的低壓柱色譜分離圖；
圖2為本發(fā)明制備所得四聚糖鈉鹽的電噴霧離子化質(zhì)譜圖及碎片歸屬；
圖3為本發(fā)明制備所得五聚糖的一維核磁共振波譜圖；
圖4為本發(fā)明制備所得五聚糖的二維核磁共振波譜圖；
圖5為本發(fā)明制備所得半乳寡糖的結(jié)構(gòu)通式；
圖6所示是NMR實(shí)驗(yàn)得出A4的結(jié)構(gòu)式。
【具體實(shí)施方式】
[0012]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述:
實(shí)施例1由[—5) β -D-Gal/(1 —]糖基組成的半乳寡糖的制備方法，包含有如下步驟:
(1)多糖降解:將以[—5)β -D-Galfd —]糖基為側(cè)鏈，以甘露聚糖為主鏈的多糖配制成質(zhì)量濃度為1.0%的水溶液，在攪拌狀態(tài)下加入0.lmol/L鹽酸溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH值到1.5，20 ° C恒溫水浴下水解6小時(shí)；
(2)中和、濃縮:將上述溶液用氫氧化鈉堿中和至pH值到7.0，將中和后的溶液濃縮至糖的質(zhì)量濃度為10.0% ；
(3)醇沉:將上述濃縮后的溶液加入濃縮后溶液4倍體積的醇，在4°C下醇沉12小時(shí)，去除未降解的甘露糖主鏈；
(4)離心、濃縮:將上述醇沉后的溶液在2000g的條件下離心30分鐘，將離心獲得的上清液除醇并濃縮至原體積的五分之一；
(5 )分離、檢測(cè)、收集:將上述濃縮后的溶液用低壓柱色譜進(jìn)行分離，所述色譜柱的規(guī)格為1.6cmX 90cm，所述低壓柱色譜分離以0.lmol/L的碳酸氫銨水溶液為流動(dòng)相，用Bio-GelP4為色譜柱填料，用示差折光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，按洗脫峰合并收集，去除流動(dòng)相，冷凍干燥即得九種[—5) β -D-Galfd —]寡糖的理論分子量依次為342.1,504.2,666.3,828.4、990.5,1152.6、1314.7,1476.8 和 1638.9 道爾頓。
[0013]實(shí)施例2
由[—5) β -D-Gal/(1 —]糖基組成的半乳寡糖的制備方法，包含有如下步驟:
(1)多糖降解:將以[—5)β -D-Galfd —]糖基為側(cè)鏈，以甘露聚糖為主鏈的多糖配制成質(zhì)量濃度為7.0%的水溶液，在攪拌狀態(tài)下加入0.55 mol/L硫酸溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH值到2.5，55° C恒溫水浴下水解.3.5小時(shí)；
(2)中和、濃縮:將上述溶液用氫氧化鉀堿中和至pH值到7.0，將中和后的溶液濃縮至糖的質(zhì)量濃度為10.0% ；
(3)醇沉:將上述濃縮后的溶液加入濃縮后溶液4倍體積的乙醇，在14°C下醇沉12小時(shí)；
(4)離心、濃縮::將上述醇沉后的溶液在3000g的條件下離心20分鐘，將離心獲得的上清液除醇并濃縮至原體積的五分之一；
(5 )分離、檢測(cè)、收集:將上述濃縮后的溶液用低壓柱色譜進(jìn)行分離，所述色譜柱的規(guī)格為1.6cmX 90cm，所述低壓柱色譜分離以0.3mol/L的碳酸氫銨水溶液為流動(dòng)相，用Bio-GelP6為色譜柱填料，用示差折光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，按洗脫峰合并收集，去除流動(dòng)相，冷凍干燥即得九種[—5) β -D-Galfd —]寡糖的理論分子量依次為342.1,504.2,666.3,828.4、990.5,1152.6、1314.7,1476.8 和 1638.9 道爾頓。
[0014]實(shí)施例3
由[—5) β -D-Gal/(1 —]糖基組成的半乳寡糖的制備方法，包含有如下步驟:
(1)多糖降解:將以[—5)β -D-Galfd —]糖基為側(cè)鏈，以甘露聚糖為主鏈的多糖配制成質(zhì)量濃度為15%的水溶液，在攪拌狀態(tài)下加入1.0 mol/L亞硫酸溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH值到3.5，90° C恒溫水浴下水解I小時(shí)；
(2)中和、濃縮:將上述溶液用氫氧化銨堿中和至pH值到7.0，將中和后的溶液濃縮至糖的質(zhì)量濃度為10.0% ；
(3)醇沉:將上述濃縮后的溶液加入濃縮后溶液4倍體積的異丙醇，在25°C下下醇沉12小時(shí)；
(4)離心、濃縮:將上述醇沉后的溶液在4000g的條件下離心15分鐘，將離心獲得的上清液除醇并濃縮至原體積的五分之一；
(5)分離、檢測(cè)、收集:將上述濃縮后的溶液用低壓柱色譜進(jìn)行分離，所述色譜柱的規(guī)格為1.6cmX 90cm,所述低壓柱色譜分離以0.5mol/L的碳酸氫銨水溶液為流動(dòng)相，用Superdex 30為色譜柱填料，用示差折光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，按洗脫峰合并收集，去除流動(dòng)相，冷凍干燥即得九種[—5) β -D-Galfd —]寡糖的理論分子量依次為342.1,504.2,666.3、828.4,990.5,1152.6、1314.7,1476.8 和 1638.9 道爾頓。
[0015]實(shí)施例4
由[—5) β -D-Gal/(1 —]糖基組成的半乳寡糖的制備方法，包含有如下步驟:
(1)多糖降解:將以[—5)β -D-Galfd —]糖基為側(cè)鏈，以甘露聚糖為主鏈的多糖配制成質(zhì)量濃度為1.0%的水溶液，在攪拌狀態(tài)下加入0.lmol/L硝酸溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH值到1.5，20 ° C恒溫水浴下水解6小時(shí)；
(2)中和、濃縮:將上述溶液用碳酸氫氨堿中和至pH值到7.0，將中和后的溶液濃縮至糖的質(zhì)量濃度為10.0% ；
(3)醇沉:將上述濃縮后的溶液加入濃縮后溶液4倍體積的甲醇，在4°C下醇沉12小
時(shí)；
(4)離心、濃縮:將上述醇沉后的溶液在6000g的條件下離心10分鐘，將離心獲得的上清液除醇并濃縮至原體積的五分之一；`
(5 )分離、檢測(cè)、收集:將上述濃縮后的溶液用低壓柱色譜進(jìn)行分離，所述色譜柱的規(guī)格為1.6cmX 90cm，所述低壓柱色譜分離以0.lmol/L的碳酸氫銨水溶液為流動(dòng)相，用Bio-GelP4為色譜柱填料，用示差折光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，按洗脫峰合并收集，去除流動(dòng)相，冷凍干燥即得九種[—5) β -D-Galfd —]寡糖的理論分子量依次為342.1,504.2,666.3,828.4、990.5,1152.6、1314.7,1476.8 和 1638.9 道爾頓。
[0016]實(shí)施例5
由[—5) β -D-Gal/(1 —]糖基組成的半乳寡糖的制備方法，包含有如下步驟:
(1)多糖降解:將以[—5)β-D-Galf(l —]糖基為側(cè)鏈，以甘露聚糖為主鏈的多糖配制成質(zhì)量濃度為15%的水溶液，在攪拌狀態(tài)下加入1.0 mol/L亞硝酸溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH值到2.5，90 ° C恒溫水浴下水解I小時(shí)；
(2)中和、濃縮:將上述溶液用氫氧化鉀堿中和至pH值到7.0，將中和后的溶液濃縮至糖的質(zhì)量濃度為10.0% ；
(3)醇沉:將上述濃縮后的溶液加入濃縮后溶液4倍體積的乙醇，在4°C下醇沉12小
時(shí)；
(4)離心、濃縮:將上述醇沉后的溶液在2000g的條件下離心30分鐘，將離心獲得的上清液除醇并濃縮至原體積的五分之一；
(5 )分離、檢測(cè)、收集:將上述濃縮后的溶液用低壓柱色譜進(jìn)行分離，所述色譜柱的規(guī)格為1.6cmX 90cm，所述低壓柱色譜分離以0.5mol/L的碳酸氫銨水溶液為流動(dòng)相，用Bio-GelP6為色譜柱填料，用示差折光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，按洗脫峰合并收集，去除流動(dòng)相，冷凍干燥即得九種[—5) β -D-Galfd —]寡糖的理論分子量依次為342.1,504.2,666.3,828.4、990.5,1152.6、1314.7,1476.8 和 1638.9 道爾頓。
[0017]實(shí)施例6
由[—5) β -D-Gal/(1 —]糖基組成的半乳寡糖的制備方法，包含有如下步驟:
(1)多糖降解:將以[—5)β -D-Galfd —]糖基為側(cè)鏈，以甘露聚糖為主鏈的多糖配制成質(zhì)量濃度為7.0%的水溶液，在攪拌狀態(tài)下加入0.55mol/L甲酸溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH值到1.5，60 ° C恒溫水浴下水解5小時(shí)；
(2)中和、濃縮:將上述溶液用氫氧化鈉堿中和至pH值到7.0，將中和后的溶液濃縮至糖的質(zhì)量濃度為10.0% ；
(3)醇沉:將上述濃縮后的溶液加入濃縮后溶液4倍體積的異丙醇，在室溫下醇沉12小
時(shí)；
(4)離心、濃縮:將上述醇沉后的溶液在6000g的條件下離心10分鐘，將離心獲得的上清液除醇并濃縮至原體積的五分之一；
(5)分離、檢測(cè)、收集:將上述濃縮后的溶液用低壓柱色譜進(jìn)行分離，所述色譜柱的規(guī)格為1.6cmX 90cm,所述低壓柱色譜分離以0.4mol/L的碳酸氫銨水溶液為流動(dòng)相，用Superdex 30為色譜柱填料，用示差折光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，按洗脫峰合并收集，去除流動(dòng)相，冷凍干燥即得九種[—5) β -D-Galfd —]寡糖的理論分子量依次為342.1,504.2,666.3、828.4,990.5,1152.6、1314.7,1476.8 和 1638.9 道爾頓。
[0018]實(shí)施例7. 由[—5) β -D-Gal/(1 —]糖基組成的半乳寡糖的制備方法，包含有如下步驟:
(1)多糖降解:將以[—5)β -D-Galfd —]糖基為側(cè)鏈，以甘露聚糖為主鏈的多糖配制成質(zhì)量濃度為6%的水溶液，在攪拌狀態(tài)下加入1.0 mol/L乙酸溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH值到
1.5,50° C恒溫水浴下水解3小時(shí)；
(2)中和、濃縮:將上述溶液用氫氧化鉀堿中和至pH值到7.0，將中和后的溶液濃縮至糖的質(zhì)量濃度為10.0% ；
(3)醇沉:將上述濃縮后的溶液加入濃縮后溶液4倍體積的甲醇，在10°C下醇沉12小時(shí)；
(4)離心、濃縮:將上述醇沉后的溶液在4000g的條件下離心15分鐘，將離心獲得的上清液除醇并濃縮至原體積的五分之一；
(5 )分離、檢測(cè)、收集:將上述濃縮后的溶液用低壓柱色譜進(jìn)行分離，所述色譜柱的規(guī)格為1.6cmX 90cm，所述低壓柱色譜分離以0.5mol/L的碳酸氫銨水溶液為流動(dòng)相，用Bio-GelP4為色譜柱填料，用示差折光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，按洗脫峰合并收集，去除流動(dòng)相，冷凍干燥即得九種[—5) β -D-Galfd —]寡糖的理論分子量依次為342.1,504.2,666.3,828.4、990.5,1152.6、1314.7,1476.8 和 1638.9 道爾頓。
[0019]實(shí)施例8
由[—5) β -D-Gal/(1 —]糖基組成的半乳寡糖的制備方法，包含有如下步驟:
(1)多糖降解:將以[—5)β-D-Galf(l —]糖基為側(cè)鏈，以甘露聚糖為主鏈的多糖配制成質(zhì)量濃度為1.0%的水溶液，在攪拌狀態(tài)下加入0.lmol/L抗壞血酸溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH值到3.5，20 ° C恒溫水浴下水解6小時(shí)；
(2)中和、濃縮:將上述溶液用氫氧化鈉堿中和至pH值到7.0，將中和后的溶液濃縮至糖的質(zhì)量濃度為10.0% ；
(3)醇沉:將上述濃縮后的溶液加入濃縮后溶液4倍體積的甲醇，在4°C下醇沉12小
時(shí)；
(4)離心、濃縮:將上述醇沉后的溶液在3000g的條件下離心20分鐘，將離心獲得的上清液除醇并濃縮至原體積的五分之一；
(5 )分離、檢測(cè)、收集:將上述濃縮后的溶液用低壓柱色譜進(jìn)行分離，所述色譜柱的規(guī)格為2.6cmX 90cm，所述低壓柱色譜分離以0.lmol/L的碳酸氫銨水溶液為流動(dòng)相，用Bio-GelP4為色譜柱填料，用示差折光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，按洗脫峰合并收集，去除流動(dòng)相，冷凍干燥即得九種[—5) β -D-Galfd —]寡糖的理論分子量依次為342.1,504.2,666.3,828.4、990.5,1152.6、1314.7,1476.8 和 1638.9 道爾頓。
[0020]實(shí)施例9
由[—5) β -D-Gal/(1 —]糖基組成的半乳寡糖的制備方法，包含有如下步驟:
(1)多糖降解:將以[—5)β-D-Galf(l —]糖基為側(cè)鏈，以甘露聚糖為主鏈的多糖配制成質(zhì)量濃度7.0%的水溶液，在攪拌狀態(tài)下加入0.55 mol/L草酸溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH值到2.5，55 ° C恒溫水浴下水解3.5小時(shí)；
(2)中和、濃縮:將上述溶液用氫氧化鉀堿中和至pH值到7.0，將中和后的溶液濃縮至糖的質(zhì)量濃度為10.0% ；
(3)醇沉:將上述濃縮后的溶液加入濃縮后溶液4倍體積的乙醇，在14°C下醇沉12小時(shí)；` (4)離心、濃縮:將上述醇沉后的溶液在6000g的條件下離心10分鐘，將離心獲得的上清液除醇并濃縮至原體積的五分之一；
(5 )分離、檢測(cè)、收集:將上述濃縮后的溶液用低壓柱色譜進(jìn)行分離，所述色譜柱的規(guī)格為1.6cmX 90cm，所述低壓柱色譜分離以0.3mol/L的碳酸氫銨水溶液為流動(dòng)相，用Bio-GelP6為色譜柱填料，用示差折光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，按洗脫峰合并收集，去除流動(dòng)相，冷凍干燥即得九種[—5) β -D-Galfd —]寡糖的理論分子量依次為342.1,504.2,666.3,828.4、990.5,1152.6、1314.7,1476.8 和 1638.9 道爾頓。
[0021]實(shí)施例10
由[—5) β -D-Gal/(1 —]糖基組成的半乳寡糖的制備方法，包含有如下步驟:
(1)多糖降解:將以[—5)β-D-Galf(l —]糖基為側(cè)鏈，以甘露聚糖為主鏈的多糖配制成質(zhì)量濃度為15%的水溶液，在攪拌狀態(tài)下加入1.0 mol/L檸檬酸溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH值到3.5，90 ° C恒溫水浴下水解I小時(shí)；
(2)中和、濃縮:將上述溶液用氫氧化銨堿中和至pH值到7.0，將中和后的溶液濃縮至糖的質(zhì)量濃度為10.0% ；
(3)醇沉:將上述濃縮后的溶液加入濃縮后溶液4倍體積的異丙醇，在25°C下醇沉12小時(shí)；
(4)離心、濃縮:將上述醇沉后的溶液在2000g的條件下離心30分鐘，將離心獲得的上清液除醇并濃縮至原體積的五分之一；
(5)分離、檢測(cè)、收集:將上述濃縮后的溶液用低壓柱色譜進(jìn)行分離，所述色譜柱的規(guī)格為1.6cmX 90cm,所述低壓柱色譜分離以0.5mol/L的碳酸氫銨水溶液為流動(dòng)相，用Superdex 30為色譜柱填料，用示差折光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，按洗脫峰合并收集，去除流動(dòng)相，冷凍干燥即得九種[—5) β -D-Galfd —]寡糖的理論分子量依次為342.1,504.2,666.3、828.4,990.5,1152.6、1314.7,1476.8 和 1638.9 道爾頓。
[0022]實(shí)施例11
由[—5) β -D-Gal/(1 —]糖基組成的半乳寡糖的制備方法，包含有如下步驟:
(1)多糖降解:將以[—5)β-D-Galf(l —]糖基為側(cè)鏈，以甘露聚糖為主鏈的多糖配制成質(zhì)量濃度為1.0%的水溶液，在攪拌狀態(tài)下加入0.lmol/L氯乙酸溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH值到1.5，20 ° C恒溫水浴下水解6小時(shí)；
(2)中和、濃縮:將上述溶液用碳酸氫氨堿中和至pH值到7.0，將中和后的溶液濃縮至糖的質(zhì)量濃度為10.0% ；
(3)醇沉:將上述濃縮后的溶液加入濃縮后溶液4倍體積的甲醇，在4°C下醇沉12小
時(shí)；
(4)離心、濃縮:將上述醇沉后的溶液在6000g的條件下離心10分鐘，將離心獲得的上清液除醇并濃縮至原體積的五分之一；
(5 )分離、檢測(cè)、收集:將上述濃縮后的溶液用低壓柱色譜進(jìn)行分離，所述色譜柱的規(guī)格為1.6cmX 90cm，所述低壓柱色譜分離以0.lmol/L的碳酸氫銨水溶液為流動(dòng)相，用Bio-GelP4為色譜柱填料，用示差折光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，按洗脫峰合并收集，去除流動(dòng)相，冷凍干燥即得九種[—5) β -D-Galfd —]寡糖的理論分子量依次為342.1,504.2,666.3,828.4、990.5,1152.6、1314.7,1476.8 和 1638.9 道爾頓。
.[0023]實(shí)施例12
由[—5) β -D-Gal/(1 —]糖基組成的半乳寡糖的制備方法，包含有如下步驟:
(1)多糖降解:將[—5)β -D-Galfd —]糖基為側(cè)鏈，以甘露聚糖為主鏈的多糖配制成質(zhì)量濃度為15%的水溶液，在攪拌狀態(tài)下加入1.0 mol/L三氯乙酸溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH值到1.5，90 ° C恒溫水浴下水解I小時(shí)；
(2)中和、濃縮:將上述溶液用氫氧化鉀堿中和至pH值到7.0，將中和后的溶液濃縮至糖的質(zhì)量濃度為10.0% ；
(3)醇沉:將上述濃縮后的溶液加入濃縮后溶液4倍體積的乙醇，在4°C下醇沉12小
時(shí)；
(4)離心、濃縮:將上述醇沉后的溶液在2000g的條件下離心30分鐘，將離心獲得的上清液除醇并濃縮至原體積的五分之一；
(5 )分離、檢測(cè)、收集:將上述濃縮后的溶液用低壓柱色譜進(jìn)行分離，所述色譜柱的規(guī)格為2.6cmX 90cm，所述低壓柱色譜分離以0.5mol/L的碳酸氫銨水溶液為流動(dòng)相，用Bio-GelP6為色譜柱填料，用示差折光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，按洗脫峰合并收集，去除流動(dòng)相，冷凍干燥即得九種[—5) β -D-Galfd —]寡糖的理論分子量依次為342.1,504.2,666.3,828.4、990.5,1152.6、1314.7,1476.8 和 1638.9 道爾頓。
[0024]實(shí)施例13
由[—5) β -D-Gal/(1 —]糖基組成的半乳寡糖的制備方法，包含有如下步驟:
(I)多糖降解:將以[—5) β-D-Galf(l —]糖基為側(cè)鏈，以甘露聚糖為主鏈的多糖配制成質(zhì)量濃度為7.0%的水溶液，在攪拌狀態(tài)下加入0.55mol/L三氟乙酸溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH值到3.5，60 ° C恒溫水浴下水解5小時(shí)；
(2)中和、濃縮:將上述溶液用氫氧化鈉堿中和至pH值到7.0，將中和后的溶液濃縮至糖的質(zhì)量濃度為10.0% ；
(3)醇沉:將上述將上述濃縮后的溶液加入將上述濃縮后溶液4倍體積的異丙醇，在室溫下醇沉12小時(shí)；
(4)離心、濃縮:將上述醇沉后的溶液在2000g的條件下離心30分鐘，將離心獲得的上清液除醇并濃縮至原體積的五分之一；
(5)分離、檢測(cè)、收集:將上述濃縮后的溶液用低壓柱色譜進(jìn)行分離，所述色譜柱的規(guī)格為1.6cmX90cm,所述低壓柱色譜分離以0.4mol/L的碳酸氫銨水溶液為流動(dòng)相，用Superdex 30為色譜柱填料，用示差折光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，按洗脫峰合并收集，去除流動(dòng)相，冷凍干燥即得九種[—5) β -D-Galfd —]寡糖的理論分子量依次為342.1,504.2,666.3、828.4,990.5,1152.6、1314.7,1476.8 和 1638.9 道爾頓。
[0025]上述實(shí)施例中所制得的寡糖是一種由[—5) β -D-GaI/(I —]糖基組成的半乳寡糖，所述半乳寡糖的聚合度為2-10，所述分子通式為C6n+12H1(ln+2205n+11，式中n=0-8，結(jié)構(gòu)通式如圖5所示。
[0026] 將上述實(shí)施例中制備的寡糖采用串聯(lián)質(zhì)譜法驗(yàn)證分子量及結(jié)構(gòu)，如圖2所示，可見聚合度為4的寡糖一級(jí)質(zhì)譜顯示[M+Na]+峰(圖2A)，二級(jí)質(zhì)譜碎片如圖2B所示，二級(jí)質(zhì)譜碎片的歸屬如圖2C所示)，該結(jié)果證明所得寡糖的分子量及結(jié)構(gòu)的正確性。
[0027]同時(shí)將上述實(shí)施例中制備的寡糖采用一維核磁共振波譜(1H-NMR，13C-NMR，如圖
3所示)可見在13C-NMR圖譜中端頭碳的化學(xué)位移分別為107.02和105.69，均屬于典型的β -D-呋喃型半乳糖的信號(hào)峰；進(jìn)一步的二維核磁共振波譜(1Η，1H-NMR, HMQC和N0ESY，如圖4所示)驗(yàn)證了所得寡糖的結(jié)構(gòu):在HMQC圖譜中在異頭氫和異頭碳的信號(hào)相關(guān)區(qū)域，A和B的Hl (5.01和4.99 ppm)均與處于107.02 ppm處的信號(hào)相關(guān)，而C的Hl (4.88 ppm)和處于還原端的105.69 ppm處的信號(hào)相關(guān);A和B信號(hào)的H-2 (3.98 ppm)與其C_2信號(hào)(81.21ppm)相關(guān)，C信號(hào)的H-2 (3.86 ppm)與其C-2信號(hào)(82.58 ppm)相關(guān)；A和B信號(hào)的H-3與其C-3信號(hào)(76.40 ppm)相關(guān)，C信號(hào)的H-3 (3.91 ppm)與其C-3信號(hào)(76.40 ppm)相關(guān)；A 的 Η-4(3.96 ppm)與其 C_4 信號(hào)(81.21 ppm)相關(guān)，B 的 Η_4(3.96 ppm)與其 C_4 信號(hào)(81.21 ppm)相關(guān)，C 的 Η_4(3.86 ppm)與其 C_4 信號(hào)(82.58 ppm)相關(guān)；A 的 H_5 (3.73ppm)與其 C-5 信號(hào)(70.01 ppm)相關(guān)，B 的 Η_5 (3.75 ppm)與其 C-5 信號(hào)(75.56 ppm)相關(guān)，C 的 H-5 (3.68 ppm)與其 C-5 信號(hào)(71.90 ppm)相關(guān);A、B 和 C 的 H-6 (3.59 ppm)都和C-6 (60.94 ppm)相關(guān)。
[0028]NOESY圖譜得出糖環(huán)內(nèi)部的H-H相關(guān)信號(hào)，例如:B的Hl與H2、B的Hl與H3、B的H2與H3、B的H4和H5、B的H3與H6 ;更為重要的是，糖環(huán)之間的相關(guān)信號(hào)A的Hl與B的H5，以及B信號(hào)之間的Hl和H5之間的相關(guān)信號(hào)通過該方法也可得到歸屬。經(jīng)NMR實(shí)驗(yàn)得出A4的結(jié)構(gòu)式如圖6所示。
【權(quán)利要求】
1.由[—5)β -D-Gal/d —]糖基組成的半乳寡糖的制備方法，其特征在于:包含有如下步驟: A、多糖降解:將以[―5)β-D-Galf (I ―]糖基為側(cè)鏈，以甘露聚糖為主鏈的多糖配制成質(zhì)量濃度為1.09-15%的水溶液，在攪拌狀態(tài)下加入0.1-1.0 mol/L酸溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH值到L 5-3.5，20-90 ° C恒溫水浴下水解1-6小時(shí)； B、中和、濃縮:將上述溶液用堿中和至pH值到7.0，將中和后的溶液濃縮至糖的質(zhì)量濃度為10.0% ； C、醇沉:將上述濃縮后的溶液加入濃縮后溶液4倍體積的醇，在4°C —25° C下醇沉12小時(shí)，去除未降解的甘露糖主鏈； D、離心、濃縮:將上述醇沉后的溶液在2000-6000g的條件下離心10-30分鐘，將離心獲得的上清液除醇并濃縮至原體積的五分之一； E、分離、檢測(cè)、收集:將上述濃縮后的溶液用低壓柱色譜進(jìn)行分離，用示差折光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，按洗脫峰合并收集，去除流動(dòng)相，冷凍干燥即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的由[―5)β-D-Galf (I — ]糖基組成的半乳寡糖的制備方法，其特征在于:所述低壓柱色譜分離以0.1-0.5mol/L的碳酸氫銨水溶液為流動(dòng)相，用Bio-Gel P4、Bio-Gel P6 或 Superdex 30 為色譜柱填料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的由[—5)β -D-Galfd —]糖基組成的半乳寡糖的制備方法，其特征在于:所述酸為鹽酸、硫酸、亞硫酸、硝酸、亞硝酸、甲酸、乙酸、抗壞血酸、草酸、檸檬酸、氯乙酸、三氯乙酸和三氟乙酸中的任一種；所述堿是氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨或碳酸氫氨中的任一種；所述醇是甲醇、乙醇或異丙醇中的任一種。
【文檔編號(hào)】C13K13/00GK103436640SQ201310291444
【公開日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年7月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月12日
【發(fā)明者】郭守東 申請(qǐng)人:泰山醫(yī)學(xué)院