一種提高植物抗逆境能力的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種提高植物抗逆境能力的方法。揭示一種對于提高植物抗逆境能力有用的方法，通過將楊樹CBL10多肽的編碼基因轉(zhuǎn)入植物中，進而提高植物的耐鹽性、耐熱性、耐干旱性，并促進植物生長、提高植物生物量。本發(fā)明的方法可應(yīng)用于植物品種的改良。
【專利說明】一種提高植物抗逆境能力的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因技術(shù)和植物學領(lǐng)域，更特別地，本發(fā)明涉及鈣調(diào)神經(jīng)素 B亞基類 似蛋白家族基因在植物中提高抗逆境能力的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 土壤的鹽漬化是一個世界性的資源問題和生態(tài)問題，它嚴重制約了現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā) 展。在我國所有的耕地中，鹽堿地面積約有1億畝，而中低產(chǎn)田高達10億畝，另外還有3億 畝鹽堿荒地可供人們開發(fā)和利用。大部分農(nóng)作物與林木的耐鹽閾值低于0. 6%的鹽濃度，而 我國大面積的鹽堿地的含鹽量在1.0%左右。隨著現(xiàn)代社會的快速發(fā)展，人口不斷膨脹，環(huán) 境污染和生態(tài)惡化日益加劇，灌溉地區(qū)的次生鹽漬化土地面積也在逐年上升，造成農(nóng)作物 產(chǎn)量銳減，引起了全世界的高度關(guān)注。長期以來人們一直在尋找解決的良策。隨著植物耐 鹽生理生化、分子生物學和基因組學研究的深入開展，科學家們逐漸確定了一部分植物在 耐鹽抗旱過程中起重要作用的蛋白，克隆了編碼它們的基因序列，并利用轉(zhuǎn)基因的手段使 某些耐鹽相關(guān)基因在植物體內(nèi)過量表達，以使其獲得一定的耐鹽性。
[0003] 植物的耐鹽性是一個多基因控制的復(fù)雜性狀，其中涉及多種機制與信號通路共同 參與。涉及鹽脅迫的信號轉(zhuǎn)導過程比較復(fù)雜，往往還與干旱，冷凍以及氧化脅迫的信號途徑 相互交叉，因此對于非生物脅迫信號轉(zhuǎn)導途徑的解析一直是植物逆境研究領(lǐng)域中的熱點問 題。模式植物擬南芥中的SOS信號通路是植物響應(yīng)鹽脅迫信號轉(zhuǎn)導方面的開創(chuàng)性工作。在 鹽脅迫下，過量的Na +使細胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+濃度增加，激活了鈣結(jié)合蛋白S0S3, S0S3于是與 S0S2結(jié)合使其轉(zhuǎn)為活性狀態(tài)，暴露出催化部位而發(fā)揮激酶的功能，S0S2還被S0S3招募到質(zhì) 膜附近，通過磷酸化作用激活了下游Na+/H +逆向轉(zhuǎn)運蛋白S0S1，從而提高了質(zhì)膜Na+/H+逆 向轉(zhuǎn)運的能力，防止了 Na+在植物細胞內(nèi)的過量積累。最近的研究表明，在單子葉禾本科的 水稻中也存在非常類似的SOS信號轉(zhuǎn)導途徑參與了水稻響應(yīng)鹽脅迫反應(yīng)過程。
[0004] 木本植物株型高大（涉及離子和營養(yǎng)物質(zhì)長距離運輸），且一般是多年生（涉及次 生生長）。目前，人們對木本植物的耐鹽機理還知之甚少。另一方面，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高 林木耐鹽抗旱等抗逆性一直也是植物基因工程研究的難點之一，目前國內(nèi)外成功的實例并 不多。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種提高植物耐鹽性的方法。
[0006] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種提高植物抗逆境能力或制備抗逆境能力增強的轉(zhuǎn) 基因植物的方法，包括：將楊樹CBLlO多肽的編碼基因轉(zhuǎn)入到植物中。
[0007] 在一個優(yōu)選例中，所述的楊樹CBLlO多肽選自：楊樹CBLlOA或楊樹PtCBLIOB。
[0008] 在另一優(yōu)選例中，所述的楊樹CBLlOA包括：（a)如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列 的多肽；(b)將SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個（如1-20個；較佳地1-10 個；更佳地1-5個；更佳地1-3個）氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有（a) 所述多肽的功能的由（a)衍生的多肽；（c)與SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列同源性高于 70%(較佳地高于80%;更佳地高于90%;如95%，98%，99%)且具有（a)所述多肽的功能的由 (a)衍生的多肽；或
[0009] 所述的楊樹CBLlOB包括：（a'）如SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列的多肽；(b'） 將SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個（如1-20個；較佳地1-10個；更佳地 1-5個；更佳地1-3個）氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有（a'）所述多肽的 功能的由（a'）衍生的多肽；（c'）與SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列同源性高于70%(較 佳地高于80% ;更佳地高于90% ;如95%，98%，99%)且具有（a，）所述多肽的功能的由（a，） 衍生的多肽。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述的植物包括：木本植物或草本植物。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述的木本植物包括：楊柳科植物（如楊屬植物），?？浦参?，桃 金娘科植物（如桉屬植物），松科植物，柏科植物，胡桃科植物，樺科植物，懸鈴木科，錦葵科 植物，鍛樹科植物，梧桐科植物，薔薇科植物，蝶形花科植物，黃楊科植物，漆樹科植物；或
[0012] 所述的草本植物包括：禾本科植物（如水稻、玉米、小麥），十字花科植物（如擬南 芥），茄科植物（如番茄）和豆科植物（如大豆）。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的方法包括：
[0014] (1)將外源的楊樹CBLlO多肽的編碼基因轉(zhuǎn)入木本植物組織、器官或種子，獲得轉(zhuǎn) 化入所述基因的植物組織、器官或種子；和
[0015] (2)將步驟（1)獲得的轉(zhuǎn)入了所述基因的植物組織、器官或種子再生成植物。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的方法包括：
[0017] (si)提供攜帶表達載體的農(nóng)桿菌，所述的表達載體含有外源的楊樹CBLlO多肽的 編碼基因；
[0018] (s2)將植物組織、器官或種子與步驟（si)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使外源的楊樹 CBLlO多肽的編碼基因轉(zhuǎn)入植物。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括：（S3)選擇出轉(zhuǎn)入了外源的楊樹CBLlO多肽 的編碼基因的植物組織、器官或種子；以及（s4)將步驟（s3)中的植物組織、器官或種子再 生成植物。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的逆境包括：高鹽環(huán)境、熱環(huán)境、干旱環(huán)境、氧化環(huán)境、滲透 環(huán)境。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的提高植物抗逆境能力包括：
[0022] 提高植物存活率；
[0023] 增加植物株高；
[0024] 增加植物生物量；
[0025] 促進植物生長。
[0026] 在本發(fā)明的另一方面，提供楊樹CBLlO多肽或其編碼基因的用途，用于提高植物 抗逆境能力。
[0027] 在一個優(yōu)選例中，所述的楊樹CBLlO多肽選自：楊樹CBLlOA或楊樹PtCBLIOB。
[0028] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1、楊樹中兩個PtCBLlO核苷酸和氨基酸序列。
[0030] 圖2、楊樹中兩個PtCBLlO蛋白與PtSOS的序列比對。
[0031] 圖3、楊樹PtCBLlOA與PtCBLlOB的基因表達模式分析。⑷毛果楊中PtCBLlOA 與PtCBLlOB的基因表達；（B)銀中楊中PtCBLlOA與PtCBLlOB的基因表達；（C)PtCBLlOA 與PtCBLlOB基因在根部與地上部分的相對表達量，設(shè)定根中表達量的為l，Pt代表毛果楊， Pab代表銀中楊；(D)PtCBLlOA與PtCBLlOB受鹽誘導表達情況。
[0032] 圖4、楊樹PtCBLlOA與PtCBLlOB可以互補擬南芥突變體cbl 10地上部分鹽敏感表 型。擬南芥野生型植株、CbllO突變體與不同的互補植株在MSO(A)與含有60mM NaCl (B)、 120mM NaCl(C)三種培養(yǎng)基上的生長情況；(D)根長的統(tǒng)計結(jié)果；(E)鮮重的統(tǒng)計結(jié)果；D、E 兩圖為三次獨立試驗統(tǒng)計結(jié)果，誤差線代表SE ; (F)轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR分子鑒定
[0033] 圖5、PtCBLlOA與PtCBLlOB的亞細胞定位。（A)楊樹原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化的結(jié)果； (B)農(nóng)桿菌注射煙草葉片瞬時表達的結(jié)果
[0034] 圖6、植物表達載體圖。
[0035] 圖7、轉(zhuǎn)基因楊樹的PCR檢測和⑶S染色檢測。（A) RT-PCR分析；(B)⑶S染色。LA 是PtCBLlOA轉(zhuǎn)基因植株的簡稱；LB是PtCBLlOB轉(zhuǎn)基因植株的簡稱。
[0036] 圖8、轉(zhuǎn)基因楊樹的耐鹽表型。WT為未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗?，其余為轉(zhuǎn)基因株系。分別 用OmM NaCl (A)和IOOmM NaCl⑶處理六周大的楊樹，三周后拍照；（C)轉(zhuǎn)PtCBLlOA基因 的轉(zhuǎn)基因株系的相對表達量分析；(D)轉(zhuǎn)PtCBLlOB基因的轉(zhuǎn)基因株系的相對表達量分析； (E)株高的統(tǒng)計結(jié)果；(F)地上部鮮重的統(tǒng)計結(jié)果；E、F兩圖為三次獨立試驗統(tǒng)計結(jié)果，誤差 線代表SE，*表示在相同的處理條件下與對照株系相比t-test差異顯著（P〈0. 05)。
[0037] 圖9、將PtCBLlOA在番爺（moneymaker)中組成型表達，顯著提高番爺?shù)目果}性。 其中a，c，e為處理組，b，d為對照組。（a，b)處理前2苗齡大的番茄；（c) 200mM NaCl處理 1周；（d)為B的對照；（e) c中用淡水沖洗后恢復(fù)1周。WT為野生型，L19, LI, L2為三個不 同的轉(zhuǎn)基因株系。
[0038] 圖10、將PtCBLlOA在番爺（moneymaker)中組成型表達，顯著提高番爺?shù)目购敌浴?其中b，c為處理組，a，d為對照組。（a)處理前2周苗齡大的番茄；(b)控水9天后的表型； (c)為B中處理復(fù)水2天的表型；（d)為相當于C的苗齡的未控水處理的正對照（2周苗+9 天+2天）。WT為野生型，L19, LI, L2為三個不同的轉(zhuǎn)基因株系。
[0039] 圖11、將PtCBLlOA在番爺（moneymaker)中組成型表達，顯著提高番爺?shù)目篃嵝浴?其中b，c為處理組，a，d為對照組。（a)處理前2周苗齡大的番茄；(b)42°C高溫處理6小 時后在26°C恢復(fù)1天后的表型；（c)恢復(fù)2天后的表型；（d)為相當于C的苗齡的未控水處 理的正對照（2周苗+2天）。WT為野生型，L19, LI, L2為三個不同的轉(zhuǎn)基因株系。

【具體實施方式】
[0040] 本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究，揭示一種對于提高植物抗逆境能力有用的方法，通過 將楊樹CBLlO多肽的編碼基因轉(zhuǎn)入植物中，進而提高植物的耐鹽性、耐熱性、耐干旱性。本 發(fā)明的方法可極好地應(yīng)用于植物品種的改良，為運用轉(zhuǎn)基因等分子育種技術(shù)培育植物新品 種提供了非常有價值的基因資源。
[0041] 本發(fā)明中，所述的植物（或作物）是適合進行基因轉(zhuǎn)化操作的植物，如各種農(nóng)作 物、花卉植物、或林業(yè)植物等。所述的植物比如可以是（不限于）：雙子葉植物、單子葉植物、 或裸子植物。較佳地，所述的植物是木本植物或草本植物。
[0042] 本發(fā)明中，所述的"木本植物"指根和莖因增粗生長形成大量的木質(zhì)部、而細胞 壁也多數(shù)木質(zhì)化的堅固的植物；且所述的木本植物天然基因組中含有CBLlO多肽的編碼 基因。例如，所述的"木本植物"可以是：楊柳科（Salicaceae)、?？疲∕oraceae)、桃金娘 科（Myrtaceae)、石松科（Lycopodiaceae)、（Selaginellaceae)、銀杏科（Ginkgoaceae)、 松科（Pinaceae)、蘇鐵科（Cycadaceae)、天南星科（Araceae)、毛莫科（Ranunculaceae)、 懸鈴木科（Platanaceae)、愉科（Ulmaceae)、胡桃科（Juglandaceae)、禪科（Betulaceae)、 稱猴桃科（Actinidiaceae)、錦奏科（Malvaceae)、梧桐科（Sterculiaceae)、鍛樹科 (Tiliaceae)、徑柳科（Tamaricaceae)、舊薇科（Rosaceae)、景天科（Crassulaceae)、 蘇木科（Caesalpinaceae)、蝶形花科（Fabaceae)、石植科（Punicaceae)、拱桐科 (Nyssaceae)、山萊英科（Cornaceae)、八角諷科（Alangiaceae)、衛(wèi)矛科（Celastraceae)、 冬青科（Aquifoliaceae)、黃楊科（Buxaceae)、大戟科（Euphorbiaceae)、小盤木科 (Pandaceae)、鼠李科（Rhamnaceae)、葡萄科（Vitaceae)、漆樹科（Anacardiaceae)， 撤攬科（Burseraceae)、梧?？疲–ampanulaceae)、紅樹科（Rhizophoraceae)、檀香科 (Santalaceae)、木渾科（Oleaceae)或玄參科（Scrophulariaceae)的植物。
[0043] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的木本植物是指楊柳科（如楊屬，更特別如楊樹）或 ?？疲ㄈ鐦?gòu)樹屬，更特別如光葉楮）、桃金娘科（如桉屬，更特別如桉樹）的木本植物。
[0044] 本發(fā)明中，所述的"草本植物"是一類植物的總稱，其植物體木質(zhì)部較不發(fā)達 至不發(fā)達，莖多汁，較柔軟。例如，所述的"草本植物"可以是：禾本科（Gramineae)， 露兜樹科（Pandanaceae)，黑三棱科（Sparganiaceae)，水雍科（Aponogetonaceae)， 眼子菜科（Potamogetonaceae)，茨藻科（Najadaceae，冰沼草科（Scheuchzeriaceae)， 澤瀉科（Alismataceae)花蔚科（Butomaceae)，水瞥科（Hydrocharitaceae)，霉草 科（Triuridaceae)，莎草科（Cyperaceae)，掠桐科（模柳科）（Palmae (Arecaceae))， 天南星科（Araceae)，浮萍科（Lemnaceae)，須葉藤科（Flagellariaceae)，帚燈草 科（Restionaceae)，刺鱗草科（Centrolepidaceae)，黃眼草科（Xyridaceae)，谷精 草科（Eriocaulaceae)，鳳梨科（Bromeliaceae)，鴨妬草科（Co_elinaceae)，雨久 花科（Pontederiaceae)，田蔥科（Philydraceae)，燈心草科（Juncaceae)，百部科 (Stemonaceae)，百合科（Liliaceae)，石蒜科（Amaryllidaceae)，茜 If 薯科（箭根薯 科）（Taccaceae)，暮葡科（Dioscoreaceae)，鸞尾科（Iridaceae)，色蓮科（Musaceae)， 姜科（Zingiberaceae)，美人蓮科（annaceae)，竹芋科（Marantaceae)，水玉替科 (Burmanniaceae)或蘭科的植物。
[0045] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的草本植物是：茄科植物，例如茄科茄屬的番茄。
[0046] 本發(fā)明中，"轉(zhuǎn)基因"，系指通過任何方法導入植物個體一段外源的雙鏈脫氧核糖 核苷酸（DNA)片段，可以是游離在染色體外，也可以整合到受體植物染色體的基因組上；可 以通過生殖過程傳遞到后代，也可以不傳遞到后代。外源基因可以從生物基因組中克隆，也 可以人工合成或用PCR在體外擴增。
[0047] 本發(fā)明還包括楊樹CBLlO多肽的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語"片 段"、"衍生物"和"類似物"是指基本上保持本發(fā)明的楊樹CBLlO多肽相同的生物學功能或 活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是（i)有一個或多個保守或非保守 性氨基酸殘基（優(yōu)選保守性氨基酸殘基）被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以 是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或（ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多 肽，或（iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽（如前導序列或分泌序列 或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白）。根據(jù)本文的定義這些片段、衍生物 和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
[0048] 在本發(fā)明中，術(shù)語"楊樹CBLlO多肽"指具有提高植物抗逆境能力的SEQ ID NO:2 序列（楊樹CBL10A)或SEQ ID N0:4序列（楊樹CBL10B)的多肽。該術(shù)語還包括具有提高 植物抗逆境能力的、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4序列的變異形式。這些變異形式包括（但 并不限于）：若干個（通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個，還更 佳如1-8個或1-5個）氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或 缺失一個或數(shù)個（通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi)）氨基酸。例 如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又 比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù) 語還包括楊樹CBLlO多肽的活性片段和活性衍生物。
[0049] 多肽的變異形式包括：同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突 變體、在高或低的嚴緊度條件下能與楊樹CBLlO多肽DNA雜交的DNA所編碼的蛋白。本發(fā) 明還提供了其他多肽，如包含楊樹CBLlO多肽或其片段的融合蛋白。
[0050] "楊樹CBLlO多肽保守性變異多肽"指與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:4的氨基酸序 列相比，有至多20個，較佳地至多10個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相 似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換 而產(chǎn)生。
[0051] 表 1
[0052]

【權(quán)利要求】
1. 一種提高植物抗逆境能力或制備抗逆境能力增強的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在 于，包括：將楊樹CBL10多肽的編碼基因轉(zhuǎn)入到植物中。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的楊樹CBL10多肽選自：楊樹CBL10A或 楊樹 PtCBLIOB。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的楊樹CBL10A包括：（a)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨 基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有（a)所述多肽的功能的由（a)衍生的多肽； (c)與SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列同源性高于70%且具有（a)所述多肽的功能的由（a) 衍生的多肽；或 所述的楊樹CBL10B包括：(a'）如SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列的多肽；(b'）將SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具 有（a'）所述多肽的功能的由（a'）衍生的多肽；（c'）與SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列 同源性高于70%且具有（a'）所述多肽的功能的由（a'）衍生的多肽。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物包括：木本植物或草本植物。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的木本植物包括：楊柳科植物，?？浦?物，桃金娘科植物，松科植物，柏科植物，胡桃科植物，樺科植物，懸鈴木科，錦葵科植物，椴 樹科植物，梧桐科植物，薔薇科植物，蝶形花科植物，黃楊科植物，漆樹科植物；或 所述的草本植物包括：禾本科植物，十字花科植物，茄科植物和豆科植物。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括： (1) 將外源的楊樹CBL10多肽的編碼基因轉(zhuǎn)入木本植物組織、器官或種子，獲得轉(zhuǎn)化入 所述基因的植物組織、器官或種子；和 (2) 將步驟（1)獲得的轉(zhuǎn)入了所述基因的植物組織、器官或種子再生成植物。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，包括： (si)提供攜帶表達載體的農(nóng)桿菌，所述的表達載體含有外源的楊樹CBL10多肽的編碼 基因； (s2)將植物組織、器官或種子與步驟（si)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使外源的楊樹CBL10 多肽的編碼基因轉(zhuǎn)入植物。
8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的逆境包括：高鹽環(huán)境、熱環(huán)境、干旱環(huán) 境、氧化環(huán)境、滲透環(huán)境。
9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的提高植物抗逆境能力包括： 提高植物存活率； 增加植物株高； 增加植物生物量； 促進植物生長。
10. 楊樹CBL10多肽或其編碼基因的用途，其特征在于，用于提高植物抗逆境能力。
11. 如權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于，所述的楊樹CBL10多肽選自：楊樹CBL10A 或楊樹PtCBLIOB。
【文檔編號】C12N15/29GK104278040SQ201310293835
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月12日
【發(fā)明者】張洪霞, 唐仁杰, 楊陽 申請人:中國科學院上海生命科學研究院