一種快速無模板的細胞圖形化方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新型的細胞圖形化技術，具體是一種基于光誘導介電泳（ODEP）技術的細胞圖形化方法。利用光誘導介電泳技術在氫化非晶硅上形成圖案可控的水凝膠并用于控制細胞生長的方法。由光斑誘導出的非均勻電場在溶液中可以在誘導微米粒子的運動及溶液的運動，產生介電泳和電滲流的現(xiàn)象。利用這種微圖形制作方法，可以不需要物理模板，直接根據所需形狀設計光斑即可得到所需的PEGDA水凝膠微圖形，并且可以動態(tài)化的控制PEGDA水凝膠微圖形的大小和位置。通過本發(fā)明這種方法，可以控制細胞的生長位置，生長圖形，并且可以通過改變PEGDA水凝膠微圖形的形狀和和尺寸調節(jié)細胞的形狀，研究微觀環(huán)境對細胞行為的影響。
【專利說明】一種快速無模板的細胞圖形化方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種新型的細胞圖形化技術，具體是一種基于光誘導介電泳(ODEP)技術的細胞圖形化方法。

【背景技術】
[0002]細胞生物學(Cell B1logy)是在顯微、亞顯微和分子水平三個層次上，研究細胞的結構、功能和各種生命規(guī)律的一門科學。細胞生物學是生命科學重要的基礎學科之一，是分子生物學與個體生物學之間承上啟下的學科。在我國基礎學科發(fā)展規(guī)劃中，細胞生物學與分子生物學，神經生物學和生態(tài)學并列為生命科學的四大基礎學科，其中由于細胞生物學與生命活動基本規(guī)律最為相關，因而成為全球生命科學界關注的熱點。從上個世紀50年代開始，細胞生物學研究就成為獲頒諾貝爾獎最多的領域，以本世紀前十年為例，已經有美國的 Leland Hartwel1、英國的 Sydney Brenner、盧森堡的 Jules A.Hoffmann 等 16 位科學家因為在細胞周期調控、程序性死亡、免疫機理等方面的研究獲得諾貝爾獎，這也見證了細胞生物學研究對于人類了解生命本質過程的重要意義。
[0003]細胞生物學的研究主要對象是細胞，數(shù)以萬計的細胞組成形態(tài)和功能各異的組織與器官，支撐著生命的基本功能與運行。然而復雜多樣的信號如何在正確的時間和空間調控細胞的生長、分化和發(fā)育，使得細胞具有特定組織器官所要求的功能，是細胞生物學新的前沿分支——細胞行為學的主要研究內容。通過對細胞差別生長、細胞遷移、區(qū)別粘附、細胞連接和細胞融合等細胞行為的研究，不僅可以揭示生命活動的本質和細節(jié)，同時也能夠在細胞水平上對生命科學領域內重大疾病(如癌癥等)的診治、個性化治療以及新藥研發(fā)提供依據和驗證手段。然而在生物活體內直接研究細胞行為是非常困難的，因為生物活體內的細胞微環(huán)境時刻變化，每一時刻都有不同的因素誘導細胞行為的變化，無法直接獲得單一因素對細胞行為的影響，并且在生物活體內直接觀察細胞行為是非常昂貴的。所以一種能夠在體外模擬體內微環(huán)境用于研究細胞微環(huán)境對細胞行為影響的方法對細胞行為學的研究乃至整個細胞生物學都有重大的意義。
[0004]目前，細胞圖形化方法已經被證實是一種用于研究細胞行為的有效方法。傳統(tǒng)利用微納技術實現(xiàn)細胞圖形化一般有兩種方案，一種是通過對表面進行修飾，形成細胞貼附生長的圖形化的區(qū)域，使細胞選擇性地貼附生長形成細胞圖形；另一種方法是通過可移除的物理阻隔層將細胞限制在圖形化區(qū)域生長，形成細胞圖形?；谏鲜鰞煞N原理，結合微系統(tǒng)技術，發(fā)展出了很多細胞圖形化技術。如光刻、軟光刻、模板輔助構圖、掩膜輔助的表面等離子體處理、特殊界面材料激光處理等。缺點大部分的方法都需要掩膜版校準，復雜的化學表面修飾。


【發(fā)明內容】

[0005]為克服以上的不足，我們研究開發(fā)出一套利用ODEP技術的無掩模板，動態(tài)化不需要任何表面修飾的細胞圖形化方法。
[0006]本發(fā)明的技術方案是:
[0007]—種快速無模板的細胞圖形化方法，利用光誘導介電泳技術在氫化非晶硅上形成圖案可控的水凝膠并用于控制細胞生長的方法。
[0008]具體步驟為:
[0009]①將聚乙二醇雙丙烯酸酯(PEGDA)溶液注入光誘導介電泳(ODEP)芯片，利用外接交流電源和光斑照射的雙重作用，使得聚乙二醇雙丙烯酸酯在非晶硅玻璃上有光照的地方發(fā)生交聯(lián)固化反應形成PEGDA水凝膠，固化的水凝膠形狀與光斑形狀一致，②將修飾好水凝膠的氫化非晶硅玻璃放入細胞培養(yǎng)皿，加入培養(yǎng)液和細胞懸浮液，將細胞培養(yǎng)皿放入細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0010]所述光誘導介電泳芯片主要分為可拆卸的三層結構，從上到下依次為ITO玻璃、溶液層、氫化非晶硅玻璃，其中，氫化非晶硅玻璃為三層結構組成，從上到下依次氫化非晶硅層、ITO玻璃層，玻璃層。
[0011 ] 所述聚乙二醇雙丙烯酸酯溶液注入光誘導介電泳芯片，是將聚乙二醇雙丙烯酸酯溶液注入光誘導介電泳芯片的溶液層，使固化后的PEGDA水凝膠粘附在氫化非晶硅玻璃的氫化非晶硅層上。
[0012]所述外接交流電源施加在光誘導介電泳芯片上，利用信號發(fā)生器在光誘導介電泳芯片兩端施加一個正弦交流信號，信號頻率為l_5kHz，幅值為20Vpp。
[0013]所述光斑照射是利用電腦畫圖后，通過投影儀射出。
[0014]所述細胞培養(yǎng)液為RPM1-1640，加入量為6_8ml ;所述細胞懸浮液為10ul乳腺癌細胞(MCF-7)濃度為2X 16細胞懸浮液。
[0015]利用光誘導介電泳芯片，光誘導介電泳芯片具有以下特點(如圖1所示):
[0016]I =ODEP芯片主要分為可拆卸的三層結構，從上到下依次為ITO玻璃(包括:玻璃層、ITO玻璃層)、溶液層、氫化非晶硅玻璃(包括:氫化非晶硅層、ITO玻璃層，玻璃層)。其厚度為=ITO玻璃(厚約1mm，大小3cmX 3cm)，溶液層(厚60 μ m)，氫化非晶硅(a_S1:H)玻璃(厚Imm,大小3cmX 3cm)組成一個漢堡結構。
[0017]2:氫化非晶娃玻璃由一層I μ m厚的氫化非晶娃,250nm厚的ITO玻璃。氫化非晶硅層在一定強度的光照下會由于電子空穴對的產生使得光照區(qū)域的電阻大大減小，有光照的其電導率會從10_9S/m增加到10_5S/m。由于光照區(qū)域的電導率升高使得其電阻降低，使得外加電壓大部分轉移到溶液層兩端，也就是說在外加交流信號的作用下，可以把光照區(qū)域看成一個微電極，會在溶液層產生非均勻電場如圖1所示。
[0018]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0019]本發(fā)明可實現(xiàn)動態(tài)化，程序化的細胞圖形化方法，并且不需要任何物理模板及化學表面修飾。具體具有以下特點:
[0020]1:由光斑誘導出的非均勻電場在溶液中可以在誘導微米粒子的運動及溶液的運動，產生介電泳和電滲流的現(xiàn)象。
[0021]2:利用聚乙二醇雙丙烯酸酯(PEGDA)在光能和電能的作用下會交聯(lián)固化形成PEGDA水凝膠的特點，可以通過控制照在非晶硅層光斑的形狀控制PEGDA鉸鏈固化的形狀，制作出各種圖案。利用這種微圖形制作方法，可以不需要物理模板，直接根據所需形狀設計光斑即可得到所需的PEGDA水凝膠微圖形，并且可以動態(tài)化的控制PEGDA水凝膠微圖形的大小和位置。
[0022]3:由于水凝膠是一種良好的生物材料，具有很好的防蛋白質粘附，防細胞粘附的作用。而氫化非晶硅層由于其表面親水性及剛度強的物理性質有益于細胞在其表面的粘附培養(yǎng)。通過上述這種方法，可以控制細胞的生長位置，生長圖形，并且可以通過改變PEGDA水凝膠微圖形的形狀和和尺寸調節(jié)細胞的形狀，研究微觀環(huán)境對細胞行為的影響。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為本發(fā)明的過程示意圖。圖1 (A)芯片連接外部電源后的電路原理示意圖。圖1(B為原理圖)，ITO的電阻很小，所以在電路中其電阻可以忽略不計，溶液層(solut1n)與氫化非晶硅(a-S1:H)層均可以看成一個電阻與電容并聯(lián)作用。在光照下，氫化非晶硅局部電阻變小，使得與之串聯(lián)的溶液層局部分壓變大，形成一個非均勻電場。
[0024]圖2為光學顯微圖片。圖2㈧為固化后PEGDA水凝膠后的結果圖，圖2(B)為細胞圖形化后的結果圖。

【具體實施方式】
[0025]本發(fā)明基于OEDP的細胞圖形化方法:通過ODEP技術控制，即當光誘導介電泳芯片兩端施加有交流電壓時，照射在氫化非晶娃表面的光斑會形成一個電極的作用，并在溶液中產生非均勻電場，當施加的正弦信號頻率為l_5kHz，信號的電壓峰峰值為20V時，溶液中的PEGDA分子會在有光的地方發(fā)生交聯(lián)反應，形成固化的水凝膠微結構，而PEGDA水凝膠的形狀與照射的光斑形狀的大小和形狀一致，因此通過控制光斑的位置和形狀，就能在氫化非晶硅表面的任意位置形成任意形狀的水凝膠微結構。因此，利用細胞不在水凝膠上生長，而在氫化非晶硅表面生長的特點，可以通過控制細PEGDA微結構形狀的位置和圖形來控制細胞生長位置和形狀。
[0026]實施例一
[0027]1.將一片ITO玻璃和一片氫化非晶硅玻璃利用99%濃的的乙醇超聲清洗兩次，每次15分鐘。利用氮氣將芯片吹干待用。
[0028]2.將洗凈后的ITO玻璃和氫化非晶硅玻璃，利用兩條2cmX ImmX60 μ m的雙面膠貼在一起，形成如圖1(A).所示的結構。由于雙面膠的存在，在ITO玻璃和氫化非晶硅玻璃之前具有60 μ m高的空間可用于容納溶液，所以該層被稱為溶液層。組裝好后形成光誘導介電泳(ODEP)芯片。
[0029]3.利用微移液器將聚乙二醇雙丙烯酸酯(PEGDA)溶液注入光誘導介電泳芯片溶液層待用。并且在ITO玻璃上的ITO層與氫化非晶硅上的ITO層接上導線，以便跟信號發(fā)生器的正負極連接。
[0030]4.將ODEP芯片放置在架子上，在電腦中繪制需要的圖片形狀(五角星圖形如圖2 (A)右下角的光斑)，通過投影儀照射在ODEP芯片上，同時將信號發(fā)生器的正負極于步驟3所述的兩導線連接，就可以實現(xiàn)對ODEP芯片施加外接交流電源(利用信號發(fā)生器在ODEP芯片兩端施加一個正弦交流信號，信號頻率為l_5kHz，幅值為20Vpp，作用時間為3-5秒)，PEGDA分子會在氫化非晶娃表面有光照的地方發(fā)生交聯(lián)固化反應(固化時間為3-5秒),在外加交流信號的作用下，投影儀射到氫化非晶硅玻璃上的圖形會誘導聚乙二醇雙丙烯酸酯固化形成PEGDA水凝膠固化的水凝膠黏附在氫化非晶硅玻璃上的氫化非晶硅層，形成具有三維網絡結構的水凝膠，而水凝膠的形狀與投射的光斑形狀一致。如圖2.(A)所示，在圖2.(A)中，灰色區(qū)域為PEGDA水凝膠，黑色區(qū)域為裸露的氫化非晶硅基底。
[0031]5.將修飾有PEGDA水凝膠微結構的氫化非晶硅玻璃放入細胞培養(yǎng)皿，加入RPM1-1640培養(yǎng)液7ml，并且放入10ul乳腺癌細胞(MCF-7)濃度為2 X 106細胞懸浮液。將細胞培養(yǎng)皿放入細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)(37°C，C02為5%，每天(24小時)更換培養(yǎng)液和觀察，記錄細胞狀態(tài)。因為細胞不生長在水凝膠上而生長在氫化非晶硅表面，所以細胞就長成了特定的形狀，如圖2.(B)所示，MCF-7細胞生長在氫化非晶硅基底上，形成一個五角星圖形。
【權利要求】
1.一種快速無模板的細胞圖形化方法，其特征在于:利用光誘導介電泳技術在氫化非晶硅上形成圖案可控的水凝膠并用于控制細胞生長的方法。
2.按權利要求1所述快速無模板的細胞圖形化方法，其特征在于:具體步驟為: ①將聚乙二醇雙丙烯酸酯(PEGDA)溶液注入光誘導介電泳(ODEP)芯片，利用外接交流電源和光斑照射的雙重作用，使得聚乙二醇雙丙烯酸酯在非晶硅玻璃上有光照的地方發(fā)生交聯(lián)固化反應形成PEGDA水凝膠，固化的水凝膠形狀與光斑形狀一致，②將修飾好水凝膠的氫化非晶硅玻璃放入細胞培養(yǎng)皿，加入培養(yǎng)液和細胞懸浮液，將細胞培養(yǎng)皿放入細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
3.按權利要求2所述快速無模板的細胞圖形化方法，其特征在于:所述光誘導介電泳芯片主要分為可拆卸的三層結構，從上到下依次為ITO玻璃、溶液層、氫化非晶硅玻璃，其中，氫化非晶硅玻璃為三層結構組成，從上到下依次氫化非晶硅層、ITO玻璃層，玻璃層。
4.按權利要求2或3所述快速無模板的細胞圖形化方法，其特征在于:所述聚乙二醇雙丙烯酸酯溶液注入光誘導介電泳芯片，是將聚乙二醇雙丙烯酸酯溶液注入光誘導介電泳芯片的溶液層，使固化后的PEGDA水凝膠粘附在氫化非晶硅玻璃的氫化非晶硅層上。
5.按權利要求2所述快速無模板的細胞圖形化方法，其特征在于:所述外接交流電源施加在光誘導介電泳芯片上，利用信號發(fā)生器在光誘導介電泳芯片兩端施加一個正弦交流信號，信號頻率為l_5kHz，幅值為20Vpp。
6.按權利要求2所述快速無模板的細胞圖形化方法，其特征在于:所述光斑照射是利用電腦畫圖后，通過投影儀射出。
7.按權利要求2所述快速無模板的細胞圖形化方法，其特征在于:所述細胞培養(yǎng)液為RPM1-1640，加入量為6-8ml ;所述細胞懸浮液為10ul乳腺癌細胞(MCF-7)濃度為2 X 16細胞懸浮液。
【文檔編號】C12N5/09GK104328084SQ201310308469
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2013年7月22日 優(yōu)先權日:2013年7月22日
【發(fā)明者】劉連慶, 劉娜, 李文榮, 王越超, 于海波, 董再勵 申請人:中國科學院沈陽自動化研究所