抗炎蛋白tipe2在制備治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了新型抗炎蛋白（免疫調(diào)控分子）TIPE2在制備治療動(dòng)脈粥樣硬化性相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還公開了一種表達(dá)TIPE2的重組腺病毒。本發(fā)明利用TIPE2的重組腺病毒實(shí)現(xiàn)在ApoE-/-小鼠體內(nèi)高效穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)TIPE2抗炎蛋白，發(fā)揮抑制動(dòng)脈粥樣斑塊的形成作用，對(duì)以動(dòng)脈粥樣硬化為病理學(xué)基礎(chǔ)的急性冠脈綜合征、心絞痛、腦中風(fēng)、血栓形成、血管閉塞、腦缺血等疾病起到有效的預(yù)防與治療作用，有效改善患者的生存質(zhì)量及疾病預(yù)后，為臨床上有效防治動(dòng)脈粥樣硬化的形成及相關(guān)性疾病開辟了一條前景非常廣闊的新途徑，同時(shí)為以動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成為病理學(xué)基礎(chǔ)的相關(guān)疾病的新藥開發(fā)提供了新的方向及依據(jù)。
【專利說明】抗炎蛋白TIPE2在制備治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物中的應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高表達(dá)新型抗炎蛋白TIPE2的重組腺病毒及其應(yīng)用，特別是涉及TIPE2作為新型的防治動(dòng)脈粥樣硬化治療藥物的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 急性心肌梗死、心源性粹死等急性冠脈綜合癥(acute coronary syndromes, ACS)是嚴(yán)重危害人類生命健康的世界性疾病，且發(fā)病率逐年增高，其病理生理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)斑塊的形成與破裂。動(dòng)脈粥樣硬化是一種病因復(fù)雜、病變發(fā)展緩慢、以局部或全身性炎癥和免疫反應(yīng)為特點(diǎn)的慢性疾病。包括單核/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等在內(nèi)的大量與免疫相關(guān)的細(xì)胞參與并形成了一系列免疫反應(yīng)機(jī)制，破壞了免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生【參見:1.[Peter Libby, Paul M.Ridkerand Attilio Maser1.1nflammation and Atherosclerosis.Circulation.2002;105:1135-1143.2.Guido Stoll and Martin Bendszus.1nflammation and Atherosclerosis:NovelInsights Into Plaque Formation and Destabilization.Stroke.2006;37:1923-1932.3.Goran K.Hansson.1nflammation，Atherosclerosis, and Coronary Artery Disease.NEngl J Med.2005;352:1685-1695.】。因而目前研究認(rèn)為，炎癥反應(yīng)貫穿于動(dòng)脈粥樣硬化的整個(gè)病變過程，包括動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成、發(fā)展及破裂【參見LibbyP，OkamotoYj RochaVZj Folco E.1nflammation in atherosclerosis: transition from theory to practice.Circulation Journal.2010;74 (2):213 - 220.van Leuven SI，F(xiàn)ranssen R，KasteleinJJj Levi M，Stroes ESGj Tak PP.Systemic inflammation as a risk factor foratherothrombosis.Rheumatology.2008; 47 (I): 3 - 7.】。針對(duì)免疫反應(yīng)的抗炎策略是防治動(dòng)脈硬化形成與發(fā)展、干預(yù)疾病轉(zhuǎn)歸的有效方案。
[0003]TIPE2，即腫瘤壞死因子 α 誘導(dǎo)蛋白 8-2 (Tumor Necrosis Factor- a InducedProtein-8-like 2，TNFAIP8L-2)，2002 年從實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎(ExperimentalAutoimmune Encephalomyelitis, EAE)小鼠模型的異常表達(dá)基因中篩選而出，并由本申請(qǐng)發(fā)明人所在課題組主要研究人員、以及長期合作伙伴賓西法尼亞大學(xué)的陳有海教授實(shí)驗(yàn)室于2008年研究鑒定其為新型免疫負(fù)調(diào)控分子【1.Carmodyj R.J.，etal.Genomic scaleprofiling of autoimmune inflammation in the central nervous system:the nervousresponse to inf lammation[J].J Neuroimmuno1.2002，133 (1-2):95-107.2.Sun, H.，eta1.TIPE2，a negative regulator of innate and adaptive immunity that maintainsimmune homeostasis [J].Cell.2008，133(3):415-26.】。研究發(fā)現(xiàn)，TIPE2 屬于腫瘤壞死因子 α 誘導(dǎo)蛋白 8 (Tumor necrosis factor- a -1nduced protein-8，TNFAIP8，ΤΙΡΕ)家族，選擇性表達(dá)于胸腺、脾臟、淋巴結(jié)等淋巴組織及炎癥組織，及具有分泌功能的組織細(xì)胞、泌尿生殖細(xì)胞等【參見:Zhang，G.，et al.Tissue-specific expression of TIPE2 providesinsights into its function [J].Mol Immunol.2010，47 (15): 2435-42.】。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TIPE2 通過抑制 MAPK (Mitogen-activated protein kinase)和 NF-κ B (Nuclearfactor-kappa B)信號(hào)通路的活化發(fā)揮負(fù)性調(diào)控固有免疫和適應(yīng)性免疫，是一個(gè)新型的抗炎蛋白[參見:Sun, H.，et al.TIPE2, a negative regulator of innate and adaptiveimmunity that maintains immune homeostasis[J].Cell.2008，133(3):415-26.】。TIPE2基因缺失在小鼠表現(xiàn)為漸進(jìn)性多器官炎癥【參見:Sun，H.，et al.TIPE2, a negativeregulator of innate and adaptive immunity that maintains immune homeostasis[J].Cell.2008, 133(3):415-26.】，在人類組織細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)異常與乙型肝炎病毒(HBV)的慢性感染、自身免疫性疾病有關(guān)【參見1:Xi，W.，et al.Roles of TIPE2 in Hepatitis BVirus-1nduced Hepatic Inflammation in Humans and Mice.Mol Immunol, 2011;48 (9-10):1203-1208.2:LiD.，et al.Down-regulation of TIPE2 mRNA expression in peripheralblood mononuclear cells from patients with systemic lupus erythematosus.Clinical Immunology 2009;133:422-427.】。本發(fā)明以炎癥為切入點(diǎn)，以動(dòng)物模型、細(xì)胞模型系統(tǒng)地研究了 TIPE2在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生中的作用與機(jī)制，發(fā)現(xiàn)TIPE2通過抑制巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣斑塊形成作用，繼而采用高表達(dá)TIPE2的重組腺病毒研究了 TIPE2對(duì)動(dòng)脈斑塊形成的治療作用。 [0004]腺病毒載體應(yīng)用于基因治療的載體，具有明顯的優(yōu)越性:宿主范圍廣，不整合到宿主基因組中，無插入突變，只感染分裂期細(xì)胞，對(duì)人的安全性高；能進(jìn)行有效增殖，體外擴(kuò)增可以獲得高滴度的重組病毒，是目前基因治療的最佳工具。本發(fā)明經(jīng)過研究證實(shí)，炎癥反應(yīng)貫穿于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成、發(fā)展與破裂的整個(gè)過程，而TIPE2作為一種新型抗炎蛋白，具有抑制動(dòng)脈粥樣斑塊形成的作用，因此本研究利用重組腺病毒實(shí)現(xiàn)TIPE2蛋白在體內(nèi)的持續(xù)高表達(dá)表達(dá)，從而發(fā)揮抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，針對(duì)炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化形成中的重要作用，本發(fā)明要解決的主要問題是提供一種能夠有效抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的重組腺病毒介導(dǎo)的TIPE2抗炎蛋白，并且進(jìn)一步提供了該抗炎蛋白作為有效防治動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的治療藥物的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]免疫負(fù)調(diào)控分子(抗炎蛋白)TIPE2,即TNFAIP8L2 (tumor necrosis factoralpha-1nduced protein 8_like2, GeneID:69769),其 CDS 序列[NM-027206]如下所不:
[0008]Atggctggtcggtccgtggcgcatctctttatcgacgagaccagcagcgaggtgctagacgagctttaccgcgtgtccaaagaatacacgcacagccggcccaaggcacagcgggtgatcaaagacctcatcaaggtagcggttaaagtggctgtgctgcaccgcagtggctgctttggccctggggagctggctctggctacacgatttcgtcagaagctacggcagggcgccatgaccgcacttagcttcggtgaggtggacttcacctttgaggctgccgtgctagcaggtctgctcgtcgagtgccgggacattctgctggagctggtggagcaccacctcacacccaagtcacatgaccgcatcaggcacgtgtttgatcactactctgaccccgacctgctggctgccctctatgggcctgacttcactcagcaccttggcaagatctgtgatgggctccggaagctgctggacgagggcaagctctga,如序列表中序列 I 所示。
[0009]本發(fā)明所述的TIPE2基因編碼翻譯的氨基酸序列[NP-081482]如下:
[0010]MesfsskslalqaekkllskmagrsvahlfidetssevldelyrvskeythsrpkaqrvikdlikvavkvavlhrsgcfgpgeIalatrfrqklrqgamtalsfgevdftfeaavlaglIvecrdi IIelvehhltpkshdrirhvfdhysdpdllaalygpdftqhlgkicdglrklIdegkl,如序列表中序列 2 所不。
[0011]構(gòu)建TIPE2重組腺病毒的詳細(xì)描述:
[0012]根據(jù)GeneID:69769提供的基因序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增TIPE2全長cDNA，兩端設(shè)計(jì)BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)，回收載體和目的片段，酶連獲得pRK5_TIPE2質(zhì)粒，測序證實(shí)連接正確(測序結(jié)果圖2)。
[0013]BamHI 和 XhoI 雙酶切 pRK5_TIPE2 質(zhì)粒及 pShuttle_GFP_CMV 穿梭質(zhì)粒(該質(zhì)粒是現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)質(zhì)粒)，回收TIPE2目的片段及穿梭載體，酶連獲得pShuttle-GFP-CMV-TIPE2質(zhì)粒；之后用限制性內(nèi)切酶1-Ceu I和1-Sce I雙酶切pADxsi骨架質(zhì)粒(該質(zhì)粒是現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)質(zhì)粒)與pShuttle-GFP-CMV-TIPE2質(zhì)粒，并將目的片段與PADxsi酶連，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5CI進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)同源重組，篩選后的陽性克隆大量擴(kuò)增獲得pADxs1-GFP-CMV-TIPE2重組腺病毒質(zhì)粒。
[0014]PacI酶切線性化重組腺病毒質(zhì)粒后，用Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染覆蓋率80%左右的包裝細(xì)胞HEK293細(xì)胞，3-5d后，出現(xiàn)明顯噬斑。待大約90%的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)，收集細(xì)胞，反復(fù)凍融3次后離心收集上清，繼續(xù)感染HEK293細(xì)胞，擴(kuò)增病毒，收集病毒液純化后于液氮保存。TCID 50法測定病毒滴度【參見=Vedtofte L，Bodvarsdottir T B, Karlsen A E, et al.Developmental biology of the Psammomysobesus pancreas: cloning and expression of the Neurogenin-3 gene [J].JHistochemCytochem，2007，55(l):97 — 104.】。
[0015]上述TIPE2重組腺病毒具有雙CMV啟動(dòng)子，可同時(shí)獨(dú)立高效表達(dá)TIPE2蛋白和GFP,既可以通過檢測GFP熒光強(qiáng)度評(píng)判TIPE2的表達(dá)情況及觀察療效，又不影響TIPE2蛋白的生物學(xué)活性。
[0016]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，上述高表達(dá)TIPE2蛋白的重組腺病毒能夠有效抑制小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成并對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化起到有效治療作用。因此，免疫調(diào)控分子TIPE2有望開發(fā)為防治動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成并在斑塊形成后發(fā)揮治療作用的新藥物。
[0017]上述高表達(dá)TIPE2蛋白的重組腺病毒作為其它以動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成為病理學(xué)基礎(chǔ)的心腦血管疾病的預(yù)防和治療性藥物應(yīng)用，如急性冠脈綜合征、心絞痛、腦中風(fēng)、血栓形成、血管閉塞、腦缺血等疾病。
[0018]進(jìn)一步地，本發(fā)明推廣到TIPE2蛋白、由TIPE2衍生的肽等一切與TIPE2相關(guān)的產(chǎn)物在上述所述疾病中的應(yīng)用。
[0019]藥理實(shí)驗(yàn)及結(jié)果證明:
[0020]實(shí)驗(yàn)用小鼠為SPF級(jí)ApoE+，8-10周齡，體重18_22g，飼養(yǎng)環(huán)境嚴(yán)格按照SPF級(jí)執(zhí)行。
[0021]治療實(shí)驗(yàn)方案1.TIPE2預(yù)防ApoE+小鼠模型動(dòng)脈粥樣斑塊形成的實(shí)驗(yàn)
[0022]8-10周齡的ApoE+先高脂喂養(yǎng)I周后，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組:實(shí)驗(yàn)組每只小鼠尾靜脈注射I X IO9Pfu重組TIPE2腺病毒，對(duì)照組則注射表達(dá)GPF的對(duì)照腺病毒，每間隔2周重復(fù)一次給藥，連續(xù)給藥4次，整個(gè)過程中均高脂喂養(yǎng)，即高脂喂養(yǎng)9周后，過量戊巴比妥鈉麻醉處死小鼠，灌洗固定后分離主動(dòng)脈 根部及腹主動(dòng)脈。主動(dòng)脈根部用于制作5 μ m冰凍切片進(jìn)行HE染色、油紅O染色，腹主動(dòng)脈用于大體油紅O染色，以檢測TIPE2對(duì)動(dòng)脈粥樣斑塊形成的抑制作用。[0023]治療實(shí)驗(yàn)方案2.TIPE2重組腺病毒對(duì)已形成的ApoE+小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊的抑制作用
[0024]8-10周齡的ApoE+先高脂喂養(yǎng)I周后，0.8%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，取仰臥位固定小鼠四肢及頭部，碘伏消毒后頸正中矢狀切口，小心分離頜下腺，暴露出左側(cè)頸動(dòng)脈。用玻璃針小心分離附著其上的迷走神經(jīng)，之后取左側(cè)頸動(dòng)脈外放置外鞘管(外鞘管以硅膠管為原料，置于75%酒精中消毒滅菌，內(nèi)徑0.30mm，長約3mm)，手術(shù)線扎住防止外鞘管脫落。頜下腺復(fù)位后縫合切口。小鼠于SPF級(jí)環(huán)境繼續(xù)飼養(yǎng)，并持續(xù)高脂喂養(yǎng)。
[0025]構(gòu)建小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成模型6周(高脂喂養(yǎng)第7周)后，將小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組:向?qū)嶒?yàn)組小鼠尾靜脈注射I X IO9Pfu的TIPE2重組腺病毒，對(duì)照組則注射表達(dá)GPF的對(duì)照腺病毒，并在2周后(高脂喂養(yǎng)第9周)加強(qiáng)給藥一次，高脂喂養(yǎng)第10周處理小鼠取材:過量戊巴比妥鈉處死小鼠，灌洗固定后分離左側(cè)頸動(dòng)脈、主動(dòng)脈根部及腹主動(dòng)脈。頸動(dòng)脈及主動(dòng)脈根部制作5 μπι冰凍切片進(jìn)行HE染色、油紅O染色，腹主動(dòng)脈進(jìn)行大體油紅O染色以檢測ΤΙΡΕ2對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的治療效果。
[0026]利用本發(fā)明所述的高表達(dá)ΤΙΡΕ2的重組腺病毒及治療實(shí)驗(yàn)方案I的結(jié)果表明:本發(fā)明所述的ΤΙΡΕ2重組腺病毒可以在小鼠體內(nèi)高表達(dá)(見圖7，圖13)，并能有效抑制ApoE+小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，延緩脂質(zhì)在主動(dòng)脈根部、主動(dòng)脈弓、腹主動(dòng)脈的堆積，即對(duì)斑塊的形成有很好的預(yù)防效果；治療實(shí)驗(yàn)方案2的結(jié)果表明:本發(fā)明所述的ΤΙΡΕ2重組腺病毒不僅可以有效預(yù)防斑塊的形成，而且能夠有效抑制已形成的粥樣斑塊的進(jìn)一步發(fā)展，從而抑制血管閉塞及動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)一步惡化。因此，抗炎蛋白ΤΙΡΕ2將在制備防治臨床上抑制并治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物中有重大的應(yīng)用價(jià)值，具有極其廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。
[0027]本發(fā)明利用ΤΙΡΕ2的重組腺病毒實(shí)現(xiàn)體內(nèi)持續(xù)高表達(dá)ΤΙΡΕ2抗炎蛋白，發(fā)揮抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的作用(圖4-圖9)，同時(shí)對(duì)已形成的粥樣斑塊起到有效治療作用(圖10-圖17)。本發(fā)明為 臨床上有效防治動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病開辟了一條前景非常廣闊的新途徑，為新型藥物的開發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1:質(zhì)粒pRK5的物理圖譜。
[0029]圖2:小鼠TIPE2基因pRK5表達(dá)載體測序圖譜，箭頭所指為TIPE2序列。
[0030]圖3:實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線圖。
[0031]圖4:治療實(shí)驗(yàn)方案I主動(dòng)脈根部HE染色結(jié)果，其中A為對(duì)照組斑塊，B為TIPE2治療后的斑塊。
[0032]圖5:治療實(shí)驗(yàn)方案I主動(dòng)脈根部斑塊大小統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析。
[0033]圖6:治療實(shí)驗(yàn)方案I主動(dòng)脈根部油紅O染色結(jié)果，其中A為對(duì)照組斑塊，B為TIPE2治療后的斑塊。
[0034]圖7:治療實(shí)驗(yàn)方案I主動(dòng)脈根部自發(fā)熒光示TIPE2或GFP的表達(dá)，其中A為對(duì)照組GFP的表達(dá)，B為TIPE2治療組。
[0035]圖8:治療實(shí)驗(yàn)方案I主動(dòng)脈弓、腹主動(dòng)脈大體油紅O染色結(jié)果，其中A為對(duì)照組斑塊，B為TIPE2治療后的斑塊。[0036]圖9:治療實(shí)驗(yàn)方案I主動(dòng)脈弓、腹主動(dòng)脈大體油紅O染色結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析。
[0037]圖10:治療實(shí)驗(yàn)方案2主動(dòng)脈根部HE染色結(jié)果，其中A為對(duì)照組斑塊，B為TIPE2治療后的斑塊。
[0038]圖11:治療實(shí)驗(yàn)方案2主動(dòng)脈根部斑塊大小統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析。
[0039]圖12:治療實(shí)驗(yàn)方案2主動(dòng)脈根部油紅O染色結(jié)果，其中A為對(duì)照組斑塊，B為TIPE2治療后的斑塊。
[0040]圖13:治療實(shí)驗(yàn)方案2主動(dòng)脈根部自發(fā)熒光示TIPE2或GFP的表達(dá)，其中A為對(duì)照組，B為TIPE2治療組。
[0041]圖14:治療實(shí)驗(yàn)方案2主動(dòng)脈弓、腹主動(dòng)脈大體油紅O染色結(jié)果，其中A為對(duì)照組斑塊，B為TIPE2治療后的斑塊。
[0042]圖15:治療實(shí)驗(yàn)方案2主動(dòng)脈弓、腹主動(dòng)脈大體油紅O染色結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析
[0043]圖16:治療實(shí)驗(yàn)方案2頸動(dòng)脈HE染色結(jié)果，其中A為對(duì)照組斑塊，B為TIPE2治療后的斑塊。
[0044]圖17:治療實(shí)驗(yàn)方案2頸動(dòng)脈自發(fā)熒光情況，其中A為對(duì)照組，B為TIPE2治療組?！揪唧w實(shí)施方式】
[0045]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0046]實(shí)施例1:小鼠TIPE2基因pRK5表達(dá)載體構(gòu)建
[0047](I)小鼠TIPE2基因CDS區(qū)獲取
[0048]PCR引物設(shè)計(jì):
[0049]根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)了小鼠TIPE2基因CDS區(qū)擴(kuò)增引物，并分別在引物上下游分別加上BamHl及Xhol的酶切位點(diǎn)，以方便后續(xù)質(zhì)粒構(gòu)建。另外，在上游引物酶切位點(diǎn)與起始密碼子ATG之間添加利于轉(zhuǎn)錄的Kozak’ s序列。具體引物序列如下:
[0050]mTIPE2BamHlF:5’ -ATTATTGGATCCGCCACCATGGAGTCCTTCAGCTCAAAGA-3’ ；
[0051]mTIPE2XholR: 5’ -ATTATTCTCGAGTCAGAGCTTGCCCTCGTCCAGC-3’ ；如序列表中序列 3、4所示。
[0052](2)小鼠TIPE2基因CDS區(qū)序列擴(kuò)增
[0053]用2 X TaqPCRMix產(chǎn)品，以逆轉(zhuǎn)錄自C57BL/6J小鼠腹腔巨噬細(xì)胞總RNA的cDNA為模板，采用PCR擴(kuò)增法獲取小鼠TIPE2基因⑶S區(qū)片段，反應(yīng)體系為50 μ L，如表1所示。
[0054]表1
[0055]
【權(quán)利要求】
1.抗炎蛋白TIPE2在制備治療動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述動(dòng)脈粥樣硬化性疾病是以動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成為病理學(xué)基礎(chǔ)的心腦血管疾病。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述動(dòng)脈粥樣硬化性疾病包括急性冠脈綜合征、心絞痛、腦中風(fēng)、血栓形成、血管閉塞、腦缺血等疾病。
4.一種表達(dá)TIPE2的重組腺病毒，其特征在于:是通過以下制備方法得到的: BamH I and Xho I 雙酶切 pRK5_TIPE2 質(zhì)粒及 pShuttle_GFP_CMV 穿梭質(zhì)粒，回收TIPE2目的片段及穿梭載體，酶連獲得pShuttle-GFP-CMV-TIPE2質(zhì)粒；之后用限制性內(nèi)切酶1-Ceu I和1-Sce I雙酶切pADxsi骨架質(zhì)粒與pShuttle-GFP-CMV_TIPE2質(zhì)粒，并將目的片段與PADxsi酶連，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)同源重組，篩選后的陽性克隆大量擴(kuò)增獲得pADxs1-GFP-CMV-TIPE2重組腺病毒質(zhì)粒； Pac I酶切線性化重組腺病毒質(zhì)粒后，用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染覆蓋率80%的包裝細(xì)胞HEK293細(xì)胞，3-5d后，出現(xiàn)明顯噬斑；待90%的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)，收集細(xì)胞上清，反復(fù)凍融3次以后離心收集上清，繼續(xù)感染HEK293細(xì)胞，擴(kuò)增病毒，收集病毒液純化后于液氮保存。
5.權(quán)利要求以4所述的表達(dá)TIPE2的重組腺病毒的制備方法，其特征在于:步驟如下: BamH I and Xho I 雙酶切 pRK5_TIPE2 質(zhì)粒及 pShuttle_GFP_CMV 穿梭質(zhì)粒，回收TIPE2目的片段及穿梭載體，酶連獲得pShuttle-GFP-CMV-TIPE2質(zhì)粒；之后用限制性內(nèi)切酶1-Ceu I和1-Sce I雙酶切pADxsi骨架質(zhì)粒與pShuttle-GFP-CMV_TIPE2質(zhì)粒，并將目的片段與PADxsi酶連，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)同源重組，篩選后的陽性克隆大量擴(kuò)增獲得pADxs1-GFP-CMV-TIPE2重組腺病毒質(zhì)粒； Pac I酶切線性化重組腺病毒 質(zhì)粒后，用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染覆蓋率80%的包裝細(xì)胞HEK 293細(xì)胞，3-5d后，出現(xiàn)明顯噬斑；待90%的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)，收集細(xì)胞上清，反復(fù)凍融3次以后離心收集上清，繼續(xù)感染HEK 293細(xì)胞，擴(kuò)增病毒，收集病毒液純化后于液氮保存。
6.權(quán)利要求以4所述的表達(dá)TIPE2的重組腺病毒在制備預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的藥物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求以4所述的表達(dá)TIPE2的重組腺病毒在制備治療動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求以4所述的表達(dá)TIPE2的重組腺病毒在制備防治心腦血管疾病的藥物中的應(yīng)用。
9.以權(quán)利要求4所述的表達(dá)TIPE2的重組腺病毒為基礎(chǔ)的TIPE2蛋白、由TIPE2衍生出的一系列肽、基因產(chǎn)物在制備防治心腦血管疾病的藥物中的應(yīng)用。
10.以權(quán)利要求4所述的表達(dá)TIPE2的重組腺病毒為基礎(chǔ)的TIPE2蛋白、由TIPE2衍生出的一系列肽、基因產(chǎn)物在制備治療以動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成為病理學(xué)基礎(chǔ)的心腦血管疾病中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/861GK103463620SQ201310317259
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月25日
【發(fā)明者】劉素俠, 邵潔, 章桂忠 申請(qǐng)人:山東大學(xué)