一種快速篩選高產(chǎn)乙醇酵母菌的方法
【專利摘要】一種快速篩選高產(chǎn)乙醇酵母菌的方法，首先繪制菌株的生長曲線，據(jù)此判斷其延遲期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期；配制并分裝若干試管液體培養(yǎng)基，其中一半倒置放入裝滿液體培養(yǎng)基的發(fā)酵小管，將兩種試管培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌，取出冷卻；在未放發(fā)酵小管的試管液體培養(yǎng)基中接入菌種，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長末期，取出待用；在菌液培養(yǎng)期間，配制抗生素母液，過濾除菌；無菌操作將發(fā)酵小管從試管液體培養(yǎng)基中取出，倒置放入上述培養(yǎng)至對數(shù)生長末期的培養(yǎng)液中，保證小管內(nèi)無氣泡進(jìn)入，并加入適量抗生素溶液，將其轉(zhuǎn)而進(jìn)行靜止發(fā)酵培養(yǎng)；待培養(yǎng)至一個周期后，取出上述試管液體，觀察發(fā)酵小管內(nèi)氣柱大小，氣柱越大，乙醇產(chǎn)量越高，從而能夠快速篩選出目的菌株。
【專利說明】一種快速篩選高產(chǎn)乙醇酵母菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及快速初步篩選微生物高產(chǎn)菌株，特別是在無氧條件下能利用葡萄糖高產(chǎn)乙醇的微生物的快速篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]菌種篩選一直是微生物學(xué)領(lǐng)域的重要研究內(nèi)容之一，也是相關(guān)科研工作中需要重點解決的難點之一。對于微生物的定向篩選如定向誘變而言，其目的突變株的篩選工作復(fù)雜而重要，而如果沒有篩選標(biāo)記，目的菌株的篩選將更加盲目、繁重。關(guān)于目的菌株的篩選方法，國內(nèi)外的科研工作者做了大量研究探討，也提出了許多不同思路。這些思路減輕了一些研究任務(wù)，目的和方向性也更明確，但仍然工作量巨大。因此有必要對目的菌株的篩選方法做進(jìn)一步探討。
[0003]另一方面，當(dāng)能源危機迫使人類開發(fā)利用新能源時，篩選高產(chǎn)乙醇的酵母菌菌種就成為轉(zhuǎn)化纖維素或半纖維素生成乙醇的關(guān)鍵影響因素之一。
[0004]對于酵母菌，其利用葡萄糖的代謝機理如下:
在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基(如YEro培養(yǎng)基)或可轉(zhuǎn)化為葡萄糖的培養(yǎng)基(如PDA培養(yǎng)基)中，酵母菌如釀酒酵母在有氧和無氧條件下都能利用葡萄糖進(jìn)行代謝。當(dāng)環(huán)境中有氧時，酵母菌能將部分葡萄糖徹底氧化獲得生長繁殖所需要的能量，同時產(chǎn)生CO2 ;當(dāng)環(huán)境中無氧時，酵母菌也能夠發(fā)酵葡萄糖，進(jìn)行低效率的產(chǎn)能代謝，同時生成乙醇和co2。
[0005]有氧時:
【權(quán)利要求】
1.一種快速篩選高產(chǎn)乙醇酵母菌的方法，其特征在于:該方法的步驟是: 第I步、首先繪制菌株的生長曲線，據(jù)此判斷其延遲期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期； 第2步、配制并分裝若干試管液體培養(yǎng)基，其中一半倒置放入裝滿液體培養(yǎng)基的發(fā)酵小管，將兩種試管培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌，取出冷卻； 第3步、在未放發(fā)酵小管的試管液體培養(yǎng)基中接入菌種，振蕩培養(yǎng)恰好至對數(shù)生長末期，取出待用； 第4步、在菌液培養(yǎng)期間，配制抗生素母液，過濾除菌； 第5步、無菌操作將第2步中的發(fā)酵小管從試管液體培養(yǎng)基中取出，倒置放入上述第3步培養(yǎng)至對數(shù)生長末期的培養(yǎng)液中，保證小管內(nèi)無氣泡進(jìn)入，并加入適量第4步配制的抗生素溶液，將其轉(zhuǎn)而進(jìn)行靜止發(fā)酵培養(yǎng)； 第6步、待培養(yǎng)至一個周期后，取出上述第5步中的試管液體，觀察發(fā)酵小管內(nèi)氣柱大小，氣柱越大，乙醇產(chǎn)量越高，從而能夠快速篩選出目的菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于該方法具體操作如下: (1)酵母菌生長曲線的繪制 在前期試驗中已確定的、包括培養(yǎng)基成分及含量、培養(yǎng)溫度、pH、培養(yǎng)周期、振蕩速率在內(nèi)的最佳培養(yǎng)條件下，接種酵母菌于液體培養(yǎng)基中并培養(yǎng)，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)、以菌液的吸光度值A(chǔ)6tltl為縱坐標(biāo)，繪制酵母菌培養(yǎng)液的吸光度值A(chǔ)6tltl隨培養(yǎng)時間變化的生長曲線，據(jù)此判斷菌株生長的延遲期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期； (2)試管液體培養(yǎng)基配制及滅菌 配制含葡萄糖的培養(yǎng)基YEH)或可轉(zhuǎn)化成葡萄糖的培養(yǎng)基PDA或豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基或麥芽汁葡萄糖培養(yǎng)基lOOOmL，分裝成100個試管液體，每個9.5nT9.8mL,取其中的50個試管液體，向其中倒置放入充滿上述液體培養(yǎng)基0.2mL^0.5mL的發(fā)酵小管，小心操作以免小管內(nèi)進(jìn)入氣泡，將裝有發(fā)酵小管的試管液體培養(yǎng)基，記為a，和另外50個未裝發(fā)酵小管的試管液體培養(yǎng)基，記為b,同時在112°C、0.5Mpa濕熱蒸汽下滅菌20min,取出冷卻至室溫； (3)接種與培養(yǎng) 以0.5%的接種量在未裝發(fā)酵小管的試管液體培養(yǎng)基b中接入酵母菌菌株，在30°C下`150 r/min振蕩培養(yǎng)恰好至對數(shù)生長期末期，取出待用，記為c ； (4)抗生素母液配制 分別配制卡那霉素溶液母液和氯霉素溶液母液，濃度均為0.5g/100mL，兩種抗生素母液分別在無菌操作下過濾除菌；抗生素母液的配制在接種后菌液培養(yǎng)時期進(jìn)行； (5)乙醇發(fā)酵 在無菌操作下，將a中的發(fā)酵小管從試管液體中取出，迅速倒置放入培養(yǎng)至對數(shù)生長期末期的培養(yǎng)液c中，小心操作以使發(fā)酵小管中不進(jìn)入氣泡，然后迅速向同一培養(yǎng)液中分別加入終濃度為50 μ g/mL的卡那霉素溶液和終濃度為25 μ g/mL的氯霉素溶液，以上操作完成后，將裝有發(fā)酵小管的試管培養(yǎng)液c繼續(xù)在30°C下靜置培養(yǎng)至一個培養(yǎng)周期； 一個培養(yǎng)周期包括不產(chǎn)乙醇的菌體生長階段和菌體發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)乙醇和CO2階段； (6)乙醇高產(chǎn)菌株的初篩 將上述完成一個培養(yǎng)周期的培養(yǎng)液c取出，觀察試管液體中發(fā)酵小管內(nèi)的氣泡產(chǎn)生情況及排出液體情況，根據(jù)發(fā)酵小管內(nèi)氣柱大小即能初步判斷出酵母菌產(chǎn)乙醇的多少，氣柱越大，間接說明乙醇產(chǎn)量越高，這樣能夠很迅速地篩選出高產(chǎn)乙醇的目的菌株；產(chǎn)乙醇的多少通過進(jìn)一步定量檢測來確定。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于該方法還包括: (7)初篩結(jié)果驗證 將上述初篩得到的高產(chǎn)菌株進(jìn)行產(chǎn)乙醇發(fā)酵，然后取樣，適當(dāng)稀釋，運用生物傳感分析儀法或液相色譜法進(jìn)行產(chǎn)乙醇分析，以驗證本方法初篩結(jié)果的準(zhǔn)確性。
【文檔編號】C12Q1/04GK103789396SQ201310324826
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2013年7月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月30日
【發(fā)明者】吳新世, 董曉惠, 李羚, 孫景峰 申請人:天津理工大學(xué)