Isl1基因或蛋白在竇房結(jié)異常相關(guān)疾病中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了Isl1基因或蛋白在竇房結(jié)異常相關(guān)疾病中的應(yīng)用。具體地，本發(fā)明提供了一種LIM同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子(Isl1)基因或其蛋白的用途，用于制備檢測(cè)或預(yù)測(cè)竇房結(jié)(SAN）異常相關(guān)疾病的試劑或試劑盒。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)或預(yù)測(cè)竇房結(jié)異常相關(guān)疾病的方法。本發(fā)明可用于以心律不齊為主要癥狀的各種先天性心臟病的產(chǎn)前篩查和診斷，從而有利于優(yōu)生優(yōu)育。
【專利說(shuō)明】Isl1基因或蛋白在竇房結(jié)異常相關(guān)疾病中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及先天性心臟病診斷治療領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及Isll基因、蛋白在 診斷竇房結(jié)異常相關(guān)疾病中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 心臟起搏傳導(dǎo)系統(tǒng)是一種特殊的心肌組織，其產(chǎn)生和傳播電脈沖，在調(diào)控心臟的 節(jié)律性收縮中起重要作用。起搏傳導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)育和功能的異?？蓪?dǎo)致心律失常及心源性猝 死。
[0003] 在中國(guó)，每年有超過(guò)50萬(wàn)例發(fā)生心源性猝死。而心律失常是心源性猝死的首要原 因。
[0004] 心臟起搏傳導(dǎo)系統(tǒng)由起搏器（竇房結(jié)/SAN)、房室節(jié)（AVN)和浦肯野纖維組成。在 小鼠，在胚胎第8天（E8. 0)心臟流入道開(kāi)始記錄到心臟起搏信號(hào)。在胚胎第9. 5天（E9. 5)， 心臟流入道的靜脈竇（sinusvenosus)為原始起搏區(qū)域。而形態(tài)學(xué)上的起搏器在E11. 5形 成，其后進(jìn)一步成熟，形成為一個(gè)功能完整的起搏器。起搏器的形成是一個(gè)復(fù)雜的、精細(xì)調(diào) 節(jié)的過(guò)程，涉及多種不同來(lái)源的心臟譜系。
[0005] 近年來(lái)，對(duì)心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)形成的分子調(diào)控機(jī)制的研究取得了顯著進(jìn)展。研究表明， 來(lái)源于心室內(nèi)膜和冠狀動(dòng)脈的Endothelin-1在浦肯野纖維的誘導(dǎo)分化中起著關(guān)鍵性的作 用。Notch和Neuregulin信號(hào)通路在斑馬魚的AV(房-室)傳導(dǎo)系統(tǒng)的形成中發(fā)揮重要作 用。在心臟和心肌細(xì)胞體外培養(yǎng)中，Neuregulin-1和Endothelin-1能夠誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì) 胞分化為起搏傳導(dǎo)系統(tǒng)細(xì)胞。轉(zhuǎn)錄因子Nkx2. 5、Tbx5和GATA4相互作用，形成一個(gè)重要的 心臟轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在心臟的發(fā)育，包括AV傳導(dǎo)系統(tǒng)的形成和功能中起重要作用。這些因 子的變異導(dǎo)致了人類先天性心臟病，伴有AV傳導(dǎo)系統(tǒng)異常。
[0006] 但相對(duì)而言，由于已知與起搏相關(guān)基因的缺失會(huì)造成胚胎大量早期死亡，起搏器 細(xì)胞在組織結(jié)構(gòu)上也難以分辨，且起搏細(xì)胞數(shù)量有限，難以分離純化，造成了現(xiàn)有技術(shù)中對(duì) 心臟起搏傳導(dǎo)系統(tǒng)，特別是對(duì)心臟起搏細(xì)胞形成和功能調(diào)節(jié)機(jī)制的了解非常有限。
[0007] 因此，為了深入了解人類心律失常發(fā)生機(jī)理，有助于優(yōu)生優(yōu)育以及提供治療手段， 本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)與心臟系統(tǒng)發(fā)育和功能相關(guān)的基因及其調(diào)控通路。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的就是提供一種與心臟系統(tǒng)發(fā)育和功能相關(guān)的基因及其調(diào)控通路和 應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明公開(kāi)了一種LIM同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子（LIMhomeodomaintranscription factor，Isletl，Isll)基因或其蛋白的用途，用于制備檢測(cè)或預(yù)測(cè)竇房結(jié)（SAN)異常相關(guān) 疾病的試劑或試劑盒。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述的Isll基因包括Isll基因組序列、CDNA序列或mRNA序 列。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述的Isll基因或蛋白來(lái)自于哺乳動(dòng)物，更佳地來(lái)源于嚙齒動(dòng) 物（如小鼠、大鼠）或靈長(zhǎng)類動(dòng)物(如人)。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的Isll基因或蛋白來(lái)源于人。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的Isll基因的核苷酸序列如SEQIDN0. :1所示，其編碼的 蛋白序列如SEQIDN0. : 2所示：
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的竇房結(jié)異常相關(guān)疾病包括：病竇綜合征或心臟傳導(dǎo)系統(tǒng) 相關(guān)心律失常。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述的心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)心律失常包括房顫、房撲、房早、室早、 預(yù)激綜合征、竇性心律不齊。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑包括Isll特異性引物、特異性抗體、探針和/或芯 片。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)包括酶聯(lián)免疫反應(yīng)法（ELISA法）檢測(cè)或時(shí)間分辨免 疫熒光法（TRFIA法）檢測(cè)。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述的Isll蛋白或其特異性抗體偶聯(lián)有或帶有可檢測(cè)標(biāo)記。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述可檢測(cè)標(biāo)記選自下組：生色團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、熒光團(tuán)、同位 素或酶。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述Isll的特異性抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)是測(cè)定羊水樣品、組織樣品、血液樣品、血清樣品或體 液樣品。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)是測(cè)定羊水樣品。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的羊水樣品來(lái)自小鼠E8-E14或人類12周20周的胚胎。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述的羊水樣品來(lái)自小鼠E9. 5-E11. 5或人類4周12周的胚胎。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑包括：
[0026] (a)檢測(cè)Isll的核酸芯片；
[0027] (b)抗Isll蛋白的特異性抗體；和/或
[0028] (c)特異性擴(kuò)增Isll的基因組DNA、mRNA或cDNA的特異性引物。
[0029] 本發(fā)明第二方面，提供了一種用于檢測(cè)或預(yù)測(cè)竇房結(jié)異常相關(guān)疾病的試劑盒，所 述的試劑盒包括檢測(cè)Isll的核酸芯片或特異性擴(kuò)增Isll核苷酸序列的特異性引物、以及 說(shuō)明書；其中所述的說(shuō)明書包括以下內(nèi)容：通過(guò)測(cè)定Isll基因或蛋白的表達(dá)和/或活性來(lái) 檢測(cè)或預(yù)測(cè)竇房結(jié)（SAN)異常相關(guān)疾病。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，Isl1核苷酸序列包括基因組序列、mRNA序列或cDNA序列。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)是測(cè)定羊水樣品、組織樣品、血液樣品、血清樣品或 體液樣品。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)是測(cè)定羊水樣品。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述的說(shuō)明書還記載以下內(nèi)容：羊水樣品來(lái)自小鼠E9. 5-E10. 5 或人類4周-12周的胚胎羊水。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述的說(shuō)明書還記載以下內(nèi)容：檢測(cè)所需對(duì)象的Isll基因或蛋 白的表達(dá)和/或活性，若顯著低于正常人群，則說(shuō)明，該檢測(cè)對(duì)象患有竇房結(jié)異常相關(guān)疾病 的概率高于正常人群。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有選自下組的一種或多種試劑：
[0036] (i)用于提取羊水或樣品中細(xì)胞基因組DNA或RNA的試劑；
[0037] (ii)用于反轉(zhuǎn)錄的引物；
[0038] (iii)用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄酶；
[0039] (iv)用于PCR反應(yīng)的聚合酶。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)是實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)是測(cè)定羊水樣品。
[0042] 本發(fā)明第三方面，提供了一種檢測(cè)或預(yù)測(cè)竇房結(jié)異常相關(guān)疾病的方法，包括步 驟：
[0043] (a)測(cè)定所需對(duì)象的Isll基因或蛋白的表達(dá)和/或活性；
[0044] (b)將（a沖獲得的測(cè)定結(jié)果與正常人群的Isll基因或蛋白的表達(dá)和/或活性相 比較；
[0045] 其中，若所需對(duì)象的Isll基因或蛋白的表達(dá)和/或活性顯著低于正常人群，則說(shuō) 明，該檢測(cè)對(duì)象患有竇房結(jié)異常相關(guān)疾病的概率高于正常人群。
[0046] 本發(fā)明第四方面，提供了一種制備動(dòng)物模型的方法，包括步驟：
[0047] 將Isllhypo/+基因型的嚙齒動(dòng)物與Isll+/nLacZ基因型的嚙齒動(dòng)物進(jìn)行交配、 或?qū)sllhypo/+基因型的嚙齒動(dòng)物與Isllhypo/+基因型的嚙齒動(dòng)物進(jìn)行交配，從而獲得 Isll復(fù)合低表達(dá)（Isllhypo/nLacZ)變異嚙齒動(dòng)物子代。
[0048] 在另一優(yōu)選例中，所述的嚙齒動(dòng)物包括小鼠和大鼠。
[0049] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例)中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0050] 圖1顯示了小鼠胚胎發(fā)育和出生后Isll在竇房結(jié)（SAN)起搏細(xì)胞中的表達(dá)
[0051]E9.5天，Isll和HCN4同時(shí)表達(dá)于靜脈竇（SV)心肌層中（圖1A)，在E10.5到P7 天則主要表達(dá)于SAN細(xì)胞中（圖1B-E，圖II)。在E10. 5天，Tbx3和Isll共表達(dá)于SV，包 括SAN的頭尾區(qū)域和靜脈瓣（vv)(圖1F，G)。Cx40表達(dá)于心房心肌層，與Isll共表達(dá)（圖 1H，J)。在圖中方框區(qū)域內(nèi)的K值如圖II和圖1J所示。Isll的表達(dá)在小鼠胚胎發(fā)育和出 生后的過(guò)程中是逐漸降低的（圖1L)。
[0052] 圖2顯示了Isll的表達(dá)降低導(dǎo)致胚胎心律失常和SAN細(xì)胞的減少
[0053]Isll-nLacZ表達(dá)于SV心肌層，包括SAN區(qū)域（紅箭頭)，E9.5(圖2A，A'）和E11.5 (圖2D，D'）背中胚層和心系膜。Isll和HCN4在ISL1突變鼠SV中的表達(dá)顯著降低（圖2C， C'）。Isll的表達(dá)和Isll陽(yáng)性細(xì)胞在ISL1突變鼠E9. 5(圖2B，B'）和E11.5(圖2E，E'）胚 胎SV心肌層，包括SAN(紅色箭頭)，心房心肌層和心系膜中顯著降低。BrdU染色顯示ISL1 突變鼠E9. 5胚胎SV心肌層細(xì)胞增殖顯著降低（圖2F，F(xiàn)'）。TUNEL染色顯示ISL1突變鼠 E10. 5胚胎SV細(xì)胞凋亡顯著增加（圖2G，G'）。超聲心動(dòng)圖結(jié)果表明ISL1突變鼠E9. 5和 E11. 5胚胎心率顯著降低（圖2H)。
[0054] 圖3顯示了ISL1突變鼠胚胎SAN的HCN4,Tbx3和Shox2表達(dá)降低
[0055]HCN4和Shox2表達(dá)于小鼠胚胎E9. 5天SV，包括SAN(圖3A，A'，B，B'，紅箭頭)。 Tbx3表達(dá)于SV周圍的間葉細(xì)胞（圖3C，C'，箭頭)。在Isl1突變鼠胚胎，SV和SAN中HCN4， Shox2和Tbx3的表達(dá)都明顯的降低（圖3F，F(xiàn)'，G，G'，H，H'，紅箭頭）。Cx40和Nkx2. 5在心 肌層表達(dá)，不表達(dá)于SAN中（圖3D，D'，E，E'，紅箭頭)。在Isll突變鼠胚胎，Cx40和Nkx2.5 在心房心肌層中顯著降低，但是Cx40和Nkx2. 5在SAN中并無(wú)異位表達(dá)（圖31，I'，J，J'， 紅箭頭)。
[0056] 圖4顯示了胚胎早期使用HCN4_CreERT2在SAN中敲除Isll可導(dǎo)致心律失常和 SAN細(xì)胞數(shù)量減少
[0057]Isll突變鼠（HCN4-CreERT2 ;Isllf/f)和對(duì)照組（HCH4-CreERT2 ;Isllf/+or+/+) 胚胎在E9. 5灌胃給予他莫昔芬，在給藥后32小時(shí)和48小時(shí)分析胚胎表型。心臟超聲心 動(dòng)圖顯示Isll突變鼠胚胎在E11天比E11. 5天心率降低更為明顯（圖4A)。整體和切片 X-gal染色顯示在E11.5天Isll突變鼠胚胎SAN中X-gal陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量（圖4C，cl，c2， 紅箭頭和D)少于對(duì)照組（圖4B，bl，b2,紅箭頭)。而HCN4陽(yáng)性細(xì)胞在Ell天突變鼠胚胎 SAN區(qū)域中的數(shù)量無(wú)明顯改變（圖4E，F(xiàn)，紅色箭頭)。Isll突變鼠（E11)中，Isll，HCN4和 Tbx3在SV的表達(dá)，包括SAN區(qū)域（紅箭頭)。Isll突變鼠（圖4H，J，L)相對(duì)對(duì)照組（圖 4G，I，K)有明顯的減弱但是Isll在咽部和背心系膜區(qū)域的表達(dá)量是正常的。
[0058] 圖5顯示了在SAN形態(tài)發(fā)育晚期敲除Isll可導(dǎo)致心動(dòng)過(guò)緩，Tbx3和HCN4在SAN 中表達(dá)降低
[0059] 在E11. 5天敲除Isll可導(dǎo)致突變體小鼠在E12. 5和E14. 5出現(xiàn)心率降低（圖5A)。 在胚胎發(fā)育中，胚胎心率隨胚胎發(fā)育逐漸增加（圖5B)。當(dāng)Isll在E13. 5胚胎敲除后，使用 心臟超聲監(jiān)測(cè)突變小鼠心率，在最初24小時(shí)突變小鼠心率未見(jiàn)明顯改變，但24h后Isll突 變小鼠出現(xiàn)心率逐漸降低。整體和切片X-gal染色顯示Isll突變胚胎SAN中X-gal陽(yáng)性 細(xì)胞（圖OT，D'）較對(duì)照組胚胎（圖5C，C'）稍有減少。定量分析表明，Isll突變胚胎SAN 區(qū)域中X-gal陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量（175. 5± 11. 7/切片，每個(gè)SAN計(jì)數(shù)10個(gè)切片）（D'）較對(duì)照 組（205.6±17.6/切片）（圖5C'）減少15%(圖5E-H)。Isll，HCN4和Tbx3在Isll突變胚 胎中的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組胚胎（圖5E-G)顯著降低（圖5F，H)。
[0060] 圖6顯示了敲除Isll導(dǎo)致細(xì)胞周期相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄因子和離子通道的表達(dá)的降 低。
[0061]qPCR顯示（圖6A)敲除Isll導(dǎo)致細(xì)胞周期相關(guān)基因和Bcl-2的表達(dá)降低；Shox2， Mef2C，Tbx3和Nkx2. 5表達(dá)降低（圖6B); -系列的離子通道，connexins和Myh6的表達(dá) 改變（圖6C)。小鼠及人類Tbx3和HCN4基因組區(qū)域?qū)Ρ葓D（E1-7:外顯子為藍(lán)色；未編碼 區(qū)為黃色；保守區(qū)域?yàn)榧t色和粉紅色）（圖6D，E)。Nano-ChIP法檢測(cè)出2個(gè)Isll分別在 Tbx3(Tbxl-l，-2)和HCN4 (HCN4-1，-2)的可能的結(jié)合位點(diǎn)。qPCR分析驗(yàn)證Nano-ChIP法 檢測(cè)得2個(gè)Isll分別在Tbx3(Tbxl-l，-2)和HCN4 (HCN4-1，-2)的結(jié)合位點(diǎn)（圖6F)。
[0062] 圖7顯示了cTnT-Cre敲除Isll小鼠（cTnT-Cre;Isll小鼠系）和Isll復(fù)合型突 變鼠的表現(xiàn)型類似，該突變鼠在胚胎期早期即E9. 5-E11. 5死亡，突變胚胎表現(xiàn)出明顯的心 率變慢和早搏。
[0063] 圖8A-圖81顯示了在HCN4表達(dá)的SAN區(qū)域中，TUNEL標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量顯著增加， 而BrdU標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量減少（箭頭處）。

【具體實(shí)施方式】
[0064] 本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，首次克服了胚胎發(fā)育早期Isll基因缺失造成 動(dòng)物模型大量死亡的技術(shù)難題，建立了Isletl低表達(dá)和條件敲除的小鼠模型，經(jīng)過(guò)對(duì)該 表達(dá)模型的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育中晚期，Isletl的低表達(dá)可導(dǎo)致了嚴(yán)重的心率減慢 或心律不齊，這類胚胎大多可以存活至出生。
[0065] 實(shí)驗(yàn)證明，即使Isll基因廣泛表達(dá)于胚胎發(fā)育期間，但其早期表達(dá)與中晚期表達(dá) 所起的調(diào)控作用不同，胚胎中晚期低表達(dá)Isll會(huì)造成出生子代嚴(yán)重的先天性心律失常，這 種后果較早期Isll低表達(dá)或缺失造成的胚胎死亡，會(huì)為家庭和社會(huì)帶來(lái)更大的痛苦和負(fù) 擔(dān)。
[0066] 此外，本發(fā)明還證實(shí)了，Isll基因作為HCN4通路的上游基因，在起搏細(xì)胞的中晚 期發(fā)育中，起到了重要的調(diào)控作用。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。
[0067] 術(shù)語(yǔ)
[0068] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"第二心臟領(lǐng)域"指心臟的形成和發(fā)育過(guò)程中，有部分心臟前體 細(xì)胞來(lái)源于前背側(cè)中胚層，并將這一區(qū)域定義為第二心臟領(lǐng)域。
[0069] 術(shù)語(yǔ)"第二心臟領(lǐng)域前體細(xì)胞"指來(lái)源于第二心臟領(lǐng)域可以進(jìn)一步分化發(fā)育成為 成熟心臟細(xì)胞的細(xì)胞群。
[0070] 術(shù)語(yǔ)"起搏器前體細(xì)胞"指的是能進(jìn)一步分化發(fā)育成為成熟起搏器細(xì)胞的細(xì)胞群。
[0071] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"竇房結(jié)異常"指在病理或生理因素下，竇房結(jié)細(xì)胞的起搏自主 性和節(jié)律性受到影響導(dǎo)致的竇房結(jié)功能不全，并引起相關(guān)病理癥狀的情況。竇房結(jié)異常通 常由先天性因素以及自主神經(jīng)影響因素等造成。
[0072] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"竇房結(jié)異常相關(guān)疾病"指在與竇房結(jié)起搏及傳導(dǎo)相關(guān)的心律失 常。通常竇房結(jié)異常相關(guān)疾病包括病竇綜合征、或心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)心律失常。
[0073] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)心律失常"指直接或間接由于竇房結(jié)異?；?功能不全而影響心臟節(jié)律以及傳導(dǎo)并引起心律失常的病理疾病，包括房顫、房撲、房早、室 早、預(yù)激綜合征、竇性心律不齊。
[0074] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"Cre"、"Cre酶"可互換使用，均指Cre重組酶，為細(xì)菌噬菌體P1 的I型拓?fù)洚悩?gòu)酶，用于催化loxP位點(diǎn)間的DNA進(jìn)行位點(diǎn)特異性重組。本發(fā)明中，主要用 于敲除LoxP位點(diǎn)之間的特定基因。
[0075] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"胚胎發(fā)育早期"指早期胚胎發(fā)育包括受精、卵裂、囊胚和植入、 原腸胚和胚層形成、胚層分化與胚體雛型形成等若干階段。對(duì)應(yīng)的嚙齒類動(dòng)物胚胎發(fā)育早 期即E7. 5-E11. 5,對(duì)應(yīng)的人類胚胎發(fā)育早期為1-3月。
[0076] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"胚胎發(fā)育中晚期"是指幾乎全部組織器官形成和成熟直至出生 的時(shí)期。對(duì)應(yīng)的嚙齒類動(dòng)物胚胎發(fā)育中晚期即E12. 5-E21，對(duì)應(yīng)的人類胚胎發(fā)育中晚期為 4-9 月。
[0077] 術(shù)語(yǔ)"Tbxl8譜系" ：Tbxl8轉(zhuǎn)錄因子在前心外膜細(xì)胞及心外膜細(xì)胞中表達(dá)，對(duì)心 臟的發(fā)育形成起重要的調(diào)節(jié)作用，因此可以特異性標(biāo)志心臟的，并將心臟的前心外膜細(xì)胞 及心外膜細(xì)胞譜系定義為Tbxl8譜系。
[0078] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"Isll復(fù)合型突變小鼠"指Isll復(fù)合型突變鼠（IsllnLacZ/ fne°)，即通過(guò)將IsllfNe°/+鼠系和IsllnLacZ/+鼠系雜交獲得的小鼠模型。
[0079] "他莫昔芬"（他莫昔芬)是一種外源性雌激素類似物，可以與嵌合重組酶中的雌激 素受體相結(jié)合使Cre進(jìn)入細(xì)胞核和LoxP位點(diǎn)結(jié)合以敲除特定基因。
[0080] 術(shù)語(yǔ)"Tbxl8譜系" ：Tbxl8轉(zhuǎn)錄因子在前心外膜細(xì)胞及心外膜細(xì)胞中表達(dá)，對(duì)心臟 的發(fā)育形成起重要的調(diào)節(jié)作用，因此可以特異性標(biāo)志心臟的，并將心臟的前心外膜細(xì)胞及 心外膜細(xì)胞譜系定義為Tbxl8譜系。
[0081]Isletl
[0082]Isll基因來(lái)源于第5號(hào)染色體長(zhǎng)臂，全長(zhǎng)大約2. 4kb，編碼349個(gè)氨基酸、來(lái)源于 編碼序列（Genbank登錄號(hào)BC132609. 1)、蛋白信息（Genbank登錄號(hào)AAI32610. 1)
[0083]Isletl是一個(gè)同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子，全身敲除Isletl導(dǎo)致來(lái)源于Isletl前體細(xì) 胞的心臟結(jié)構(gòu)的完全缺失和胚胎早期死亡（E9. 5-10. 5)，這阻礙了對(duì)Isletl在起搏器中作 用的進(jìn)一步研究。
[0084] 本發(fā)明Isll在多物種中有著高度的同源性，可用于本發(fā)明的Isll可來(lái)自于任何 哺乳動(dòng)物，包括（但并不限于）：人、嚙齒動(dòng)物（如小鼠、大鼠)、黑猩猩、牛、犬、貓等。此外， Isll包括野生型Isll和突變型Isll及其活性片段。
[0085]HCN4
[0086]HCN4 (超極化激活性環(huán)核苷酸門控性通道4，hyperpolarization-activated cyclicnucleotide-gatedchannel4)基因來(lái)源于第 9 號(hào)染色體，mRNA全長(zhǎng) 3. 7kb，編碼 1201個(gè)氨基酸，其核苷酸序列如SEQIDN0. :3所示（geneIDNM_001081192.)，其編碼的 蛋白序列如SEQIDNO. :4 所示（NP_001074661. 1)。
[0087] 在心臟新月期（CardiacCrescent)HCN4就已表達(dá)。在發(fā)育期及成人的心臟中， HCN4特異性地標(biāo)志竇房結(jié)。
[0088] 在人類，HCN4的變異導(dǎo)致心率過(guò)緩。在小鼠等模型動(dòng)物中，完全敲除HCN4導(dǎo)致 嚴(yán)重的頻發(fā)性竇性心跳停搏，以及胚胎早期死亡（E9. 5-10. 5)。然而在成年小鼠心臟敲除 HCN4并不導(dǎo)致小鼠死亡，變異小鼠的基礎(chǔ)心率/律正常，但有間歇性心跳驟停。這些研究表 明HCN4對(duì)早期的心臟起搏功能是必需的。HCN4和鈣流時(shí)鐘（Calciumclock)決定了起搏 細(xì)胞的高自主節(jié)律性，在心臟的竇性自主節(jié)律的產(chǎn)生和心跳速率的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。 在成年期，其他的機(jī)制包括鈣流鐘及其相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白可能共同發(fā)揮作用。
[0089] 檢測(cè)方法和試劑盒
[0090] 本發(fā)明還涉及定量和定性檢測(cè)人Isll蛋白水平或mRNA水平的診斷試驗(yàn)方法。這 些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的。試驗(yàn)中所檢測(cè)的人Isll蛋白水平，可以用于檢測(cè)或預(yù)測(cè)竇房結(jié) 異常相關(guān)疾病。
[0091] 一種檢測(cè)樣品中是否存在Isll蛋白的方法是利用Isll蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢 測(cè)，它包括：將樣品與Isll蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù) 合物就表不樣品中存在Isl1蛋白。
[0092]Isll蛋白或其多核苷酸可用于Isll蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。本發(fā)明的多核 苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列或DNA芯片上，用于分析組織中基因的差異 表達(dá)分析和基因診斷?？笽sll的抗體可以固定在蛋白質(zhì)芯片上，用于檢測(cè)樣品中的Isll 蛋白。
[0093] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)竇房結(jié)異常相關(guān)疾病的試劑盒，它含有特異性擴(kuò)增Isll 的引物對(duì)和/或Isll特異性抗體以及標(biāo)簽或說(shuō)明書。
[0094] 其中，所述的標(biāo)簽或說(shuō)明書注明以下內(nèi)容：Isll基因或蛋白的表達(dá)和/或活性顯 著低于正常人群，則說(shuō)明，該檢測(cè)對(duì)象患有竇房結(jié)異常相關(guān)疾病的概率高于正常人群。
[0095] 本發(fā)明方法和試劑盒可用于檢測(cè)人羊水樣品、組織樣品、血液樣品、血清樣品或體 液樣品，用于早期篩查竇房結(jié)異常有關(guān)的先天性心律失常，有利于優(yōu)生優(yōu)育。
[0096] 促進(jìn)劑和藥物組合物
[0097] 利用本發(fā)明蛋白，通過(guò)各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與Isll蛋白發(fā)生相互作用的 物質(zhì)，尤其是促進(jìn)劑等。
[0098] 本發(fā)明Isll蛋白的促進(jìn)劑，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用（給藥）時(shí)，可促進(jìn)Isll蛋白的 表達(dá)和/或活性，進(jìn)而促進(jìn)HCN4基因或蛋白表達(dá)，或激活HCN4的轉(zhuǎn)錄。在另一優(yōu)選例中， 所述的Isll促進(jìn)劑包括的Isll基因表達(dá)產(chǎn)物、促進(jìn)型microRNA、促進(jìn)型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、或 促進(jìn)型靶向小分子化合物。
[0099] 通常，可將這些促進(jìn)劑配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中， 其中pH通常約為5-8,較佳地pH約為6-8,盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的 病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過(guò)常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括（但并不限 于）：肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
[0100] 本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明Isll蛋白或其促 進(jìn)劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括（但并不限于）：鹽水、緩沖液、葡 萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以 被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制 備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶 液、片劑和膠囊宜在無(wú)菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微 克-10毫克/千克體重。
[0101] 通用方法
[0102] 轉(zhuǎn)基因小鼠
[0103]Isll-nLacZ基因敲入小鼠（記為IsllnLacZ/+)的構(gòu)建可通過(guò)常規(guī)方法，小鼠 1對(duì)染色體的其中一條于Isll起始位點(diǎn)插入nLacZ，一種優(yōu)選的構(gòu)建方法可見(jiàn)Song,M. R. ,Sun,Y. ,Bryson,A. ,Gill,G.N. ,Evans,S.M. ,andPfaff,S.L. 2009.Islet-t〇-LM0 stoichiometriescontrolthefunctionoftranscriptioncomplexesthatspecify motorneuronandV2ainterneuronidentity.Developmentl36:2923-2932〇在該小鼠中， 一條染色體的Isll不能正常表達(dá)，另一條染色體可正常表達(dá)Isll。
[0104]TnT-Cre小鼠系（記為cTnT-Cre)、cTnT-Cre通過(guò)定點(diǎn)敲入的方法將小鼠1對(duì)染 色體的其中一條于cTnT的起始位點(diǎn)后插入重組酶基因cre，Cre受cTnT啟動(dòng)子的調(diào)控只在 分化的心肌中表達(dá)。在該小鼠中，一條染色體能表達(dá)重組酶基因ere。此小鼠購(gòu)自上海南方 模式生物科技有限公司。
[0105]Isllfloxed小鼠系的構(gòu)建見(jiàn)Jiao,K.，Kulessa，H.，Tompkins，K.，Zhou，Y.， Batts,L.,Baldwin,H.S. ,andHogan,B.L. 2003.AnessentialroleofBmp4inthe atrioventricularseptationofthemouseheart.Genes&developmentl7:2362-2367?該 鼠系通過(guò)同源重組的方法在小鼠1對(duì)染色體的Isll第四外顯子替換為兩端帶有LoxP位點(diǎn) 的第四外顯子。
[0106]cTnT-Cre;Isll小鼠系：是通過(guò)cTnT-Cre小鼠系和Isllfloxed小鼠系雜交所獲 得。雜交小鼠可以表達(dá)重組酶基因Cre可以識(shí)別插入Isll第四外顯子兩端的loxp位點(diǎn)從 而將Isll第四個(gè)外顯子刪除，使Isll基因無(wú)法正常表達(dá)。這種小鼠是cTnT-Cre小鼠系和 Isllfloxed小鼠系雜交所獲得。
[0107]Isll低表達(dá)（記為IsllfN6°/+)小鼠系的構(gòu)建可通過(guò)同源重組將isll第四個(gè) 外顯子替換為帶有l(wèi)oxp位點(diǎn)以及篩選基因neo的第四外顯子。一種優(yōu)選的構(gòu)建方法可見(jiàn) Sun,Y. ,Dykes,I.M. ,Liang,X. ,Eng,S.R. ,Evans,S.M. ,andTurner,E.E. 2008.Acentral roleforIsletlinsensoryneurondevelopmentlinkingsensoryandspinalgene regulatoryprograms.Natureneurosciencell: 1283-1293?在該小鼠中neo會(huì)干擾neo所 在的Isll等位基因的正常表達(dá)，雜合小鼠中由于另外一條染色體的代償作用Isll表達(dá)正 常；但在純和小鼠中使Isll的表達(dá)水平顯著降低，出生后pi天死亡。
[0108] 他莫昔芬誘導(dǎo)型HCN4-CreERT2 (記為HCN4-CreERT2)小鼠構(gòu)建可用同源重組技 術(shù)進(jìn)行。一種優(yōu)選的方法是將一個(gè)包含CreERT2序列的cDNA片斷在緊靠HCN4基因起始 密碼子（ATG)的部位插入，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。一種優(yōu)選的構(gòu)建方法可見(jiàn)LiangX，Wang G,LinL,LoweJ,ZhangQ,BuL,ChenYH,ChenJ,SunY,EvansSM.HCN4DynamicallyMarks theFirstHeartFieldandConductionSystemPrecursors.CircRes. 2013Jun6. Epublication此小鼠其中一條染色體可表達(dá)CreERT2,另一條表達(dá)HCN4。
[0109]Isll復(fù)合型突變鼠（記為IsllnLacZ/fNe。）:通過(guò)將IsllfNe7+ 鼠系和IsllnLacZ/+ 鼠系雜交獲得。雜交獲得的小鼠1對(duì)染色體，其中一條在Isll起始位點(diǎn)插入nLacZ，使Isll 不能正常表達(dá)。另一條染色體中Isll基因的內(nèi)含子中插入neo基因，干擾Isll的表達(dá)。
[0110]HCN4-CreERT2/Rosa-LacZ、YFP小鼠：HCN4-CreERT2 小鼠系與具有Rosa-LacZ或 YFP遺傳背景的Isllflox/flox小鼠系雜交，以便得到HCN4-CreERT2/Rosa-YFP或LacZ小 鼠。此小鼠可表達(dá)CreERT2可識(shí)別Rosa-YFP或Rosa-LacZ中間的loxP位點(diǎn)并將其中間基 因序列刪除，是Rosa可啟動(dòng)YFP或LacZ的表達(dá)。
[0111] 為了誘導(dǎo)HCN4-CreERT2小鼠系的Cre酶活性，給不同胚胎期的懷孕母鼠在所需時(shí) 間點(diǎn)口服給予150_300ul他莫昔芬（10mg/ml)。對(duì)胚胎早期，他莫昔芬在小鼠胚胎E9. 5給 藥，胚胎樣品在給藥后32-36小時(shí)，約胚胎期E11天收獲。對(duì)胚胎晚期，他莫昔芬在小鼠胚 胎E11. 5給藥，胚胎樣品在給藥后約胚胎期E14. 5天收獲。轉(zhuǎn)基因小鼠具有的Rosa26-YFP 遺傳背景使能在他莫昔芬誘導(dǎo)Cre表達(dá)后觀察到HCN4-CreERT2的表達(dá)。
[0112] 免疫熒光染色和RNA原位雜交
[0113]X-gal染色，免疫熒光和RNA原位雜交的方法可用常規(guī)方法進(jìn)行，代表性的方法可 見(jiàn)：
[0114]Liang,X. ,Zhou,Q. ,Li,X. ,Sun,Y. ,Lu,M. ,Dalton,N. ,Ross,J. ,Jr. ,and Chen,J. 2005.PINCHlplaysanessentialroleinearlymurineembryonicdevelopment butisdispensableinventricularcardiomyocytes.Molecularandcellular biology25:3056-3062 ；
[0115]Liang,X. ,Sun,Y. ,Schneider,J. ,Ding,J.H. ,Cheng,H. ,Ye,M. ,Bhattacharya,S. ,Rearden,A. ,Evans,S. ,andChen,J. 2007.Pinchlisrequiredfornormaldevelopment ofcranialandcardiacneuralcrest-derivedstructures.CircReslOO:527-535。
[0116]使用一抗如下：小鼠anti-Isletl/2 單克隆抗體（DSHB),兔anti-Isletl(abcam), 大鼠anti_HCN4 (abeam),兔anti_Cx40(SantaCruz),羊anti_Tbx3(SantaCruz),小鼠 anti_Nkx2.5(SantaCruz),大鼠anti-Brdu(abcam)。二抗使用了Alexa488or5941abeled (Invitrogen)。TUNEL染色法使用了試劑盒手冊(cè)（購(gòu)自Roche)。
[0117]BrdU染色法：特定時(shí)間點(diǎn)的懷孕母鼠腹腔注射500ylBrdU(預(yù)混和液，Ambion) 3次，間隔3小時(shí)，BrdU染色可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行，代表性的方法見(jiàn)Sun,Y.，Dykes,I. M. ,Liang,X. ,Eng,S.R. ,Evans,S.M. ,andTurner,E.E. 2008.Acentralrolefor Isletlinsensoryneurondevelopmentlinkingsensoryandspinalgeneregulatory programs.Natureneurosciencell:1283-1293。
[0118] 細(xì)胞計(jì)數(shù)：對(duì)特定發(fā)育期的心臟SAN區(qū)域樣品切片，切片厚度10um，每個(gè)樣品選取 4張連續(xù)切片進(jìn)行染色并計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，對(duì)突變胚胎和對(duì) 照胚胎右側(cè)靜脈竇和SAN區(qū)域的BrdU陽(yáng)性和TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。為了研究Isll在 發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)情況，Isll陽(yáng)性和HCN4陽(yáng)性細(xì)胞被計(jì)數(shù)，用以計(jì)算Isll和HCN4陽(yáng)性細(xì) 胞的比例。對(duì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的不同樣品，每個(gè)樣品最少分析4至6個(gè)相對(duì)應(yīng)的切片，每個(gè)實(shí)驗(yàn) 最少分析3對(duì)樣品。
[0119]Nano-ChIP和實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR):
[0120] 本發(fā)明Nano-ChIP和實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行，代表性的方法如 下：
[0121] 采用FACS-sorted法，分離HCN4-CreERT2 ;Isllf/f突變鼠胚胎和HCN4-CreERT2 ; Isll對(duì)照組胚胎（Rosa-YFP背景）SAN起搏細(xì)胞用于qPCR分析。收獲并手術(shù)分離Ell天 YFP陽(yáng)性的Isll突變和對(duì)照組胚胎SANs,使用collagenase/dispase(lmg/ml，Roche)/ trypsin(0. 1%)混合消化液消化10分鐘。收集起搏消化液中懸濁的起搏細(xì)胞（YFP陽(yáng)性)， FACSsorted(BDFACSAria)分離細(xì)胞并儲(chǔ)存于-80C。RNA使用RNeasyMinikit(Qiagen) 制備。qPCR使用SYBRgreen法。
[0122] Nano-ChIP實(shí)驗(yàn)方法：HCN4-nEGFP胚胎SAN細(xì)胞在胚胎晚期收集（E13. 5to E18. 5)，細(xì)胞收集和FACS-sorted方法如前所述。大約40, 000SAN細(xì)胞使用l%formaldehyde 在室溫交聯(lián)10分鐘。細(xì)胞使用甘氨酸冷淬5分鐘并用冰水預(yù)冷PBS沖洗2遍。Chromatin 使用超聲波碎裂成200-800bp大小片斷，并使用1ygIsll抗體（39. 4D5,DSHB)共沉淀。 隨后反向交聯(lián)并純化，ChIPDNA和輸入的DNA被擴(kuò)增（60)。擴(kuò)增后DNA使用qPCR鑒定，相 關(guān)調(diào)控區(qū)域通過(guò)分析數(shù)據(jù)后確認(rèn)。
[0123] 超聲心動(dòng)儀檢測(cè)：
[0124] 懷孕小鼠使用isoflurane麻醉。所使用超聲心動(dòng)儀型號(hào)為Visualsonics VeV〇770高解析度超聲系統(tǒng)，使用RMV704 (40MHz)探頭。每個(gè)胚胎都單獨(dú)檢測(cè)，并獲得獨(dú)立 的圖像和數(shù)據(jù)。通過(guò)獲得B-mode和脈沖多普勒?qǐng)D像得到心率和各項(xiàng)心臟功能參數(shù)。超聲心 動(dòng)儀檢測(cè)后，解剖出胚胎，分別和超聲心動(dòng)儀檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)，并進(jìn)行基因型和表現(xiàn)型檢測(cè)。
[0125] 統(tǒng)計(jì)分析法
[0126] 所有數(shù)據(jù)使用平均值（mean) 土SEMb表示，t-test使用2組獨(dú)立測(cè)試結(jié)果相互驗(yàn) 證。當(dāng)P〈0. 05時(shí)認(rèn)為實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著性差異.
[0127] 本發(fā)明的有益效果
[0128] 1.本發(fā)明證實(shí)了在胚胎發(fā)育過(guò)程中，Isll基因或蛋白對(duì)竇房結(jié)細(xì)胞整個(gè)發(fā)育周 期中的形成及功能調(diào)節(jié)起到重要作用，尤其是對(duì)于竇房結(jié)細(xì)胞中晚期的形成和功能而言， Isll的缺失或變異不會(huì)造成胚胎死亡，而是造成出生后的胎兒患有以心律不齊為主要癥狀 的各種先天性心臟病。
[0129] 2.本發(fā)明還證實(shí)了作為HCN4的上游基因，Isll對(duì)HCN4的調(diào)控起到重要作用，從 而調(diào)控胚胎竇房結(jié)細(xì)胞的中晚期發(fā)育。
[0130] 3.本發(fā)明可用于先天性心臟病，尤其是以心律不齊為主要癥狀的各種先天性心臟 病的產(chǎn)前篩查和診斷，有利于優(yōu)生優(yōu)育。
[0131] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照 常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（NewYork:ColdSpringHarbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否 則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
[0132] 實(shí)施例llsll和HCN4在心臟SAN細(xì)胞中表達(dá)
[0133] 為了研究Isll在SAN形成和功能中的作用，首先分析了Isll在SAN發(fā)育過(guò)程中 的表達(dá)，并使用數(shù)個(gè)SAN細(xì)胞和心房心肌細(xì)胞抗體（HCN4Tbx3Cx40購(gòu)自abeam公司）作為 記。
[0134]HCN4是起搏細(xì)胞通道蛋白，在心臟發(fā)育早期開(kāi)始表達(dá)，在SAN分化發(fā)育過(guò)程中起 了關(guān)鍵作用。在￡9.5，1811表達(dá)于心肌層的靜脈竇（8；[11118￥61108118(5\0)，早期胚胎的起 搏細(xì)胞生發(fā)區(qū)域高表達(dá)HCN4 (圖1A)。
[0135] 在E10. 5,Isll和HCN4共表達(dá)于胚胎SAN頭部（圖1B)和尾部（圖1C)，靜脈瓣 (vv)，以及圍繞背心系膜的心房心肌層（DM)(圖1A，B，箭頭)。
[0136] 在胚胎發(fā)育晚期和出生后早期，Isll和HCN4共表達(dá)于竇房結(jié)細(xì)胞（圖1D，E，I)。
[0137]Isll在SAN中的表達(dá)隨著年齡逐漸降低。Isll和HNC4共表達(dá)的起搏細(xì)胞數(shù)量比 例在出生后2周顯著降低，并隨著年齡增加逐漸降低（圖1L)。
[0138]Tbx3和CX40共染色可標(biāo)記出SAN和心房心肌層之間的界限。發(fā)現(xiàn)在胚胎E10. 5 天，Tbx3在SAN頭部和尾部以及靜脈瓣中和Isll共表達(dá)（圖1F，G)。Cx40表達(dá)在心房心 肌層而Isll表達(dá)于SAN(圖1H，J)。
[0139] 結(jié)果表明了Isll在SAN發(fā)育和功能中的起著重要的作用。
[0140] 實(shí)施例2在Isll復(fù)合型突變鼠胚胎中Isll表達(dá)的降低導(dǎo)致竇性心律不齊和SAN 細(xì)胞的減少
[0141] 2. 1構(gòu)建一個(gè)Isll不完全表達(dá)的Isll復(fù)合型突變小鼠模型（IsllnLacZ/fNe°+)，其 表現(xiàn)型較全身敲除小鼠為輕，能存活稍長(zhǎng)時(shí)間（E12. 5天死亡），但較Isll不完全表達(dá)小鼠 系表現(xiàn)型更重。
[0142]Isll復(fù)合型突變小鼠模型使用Isll核LacZ敲入小鼠系（Isl-nLacZ)，和Isll低 表達(dá)小鼠系（Isllfne°/+，該小鼠Isll內(nèi)含子中含有neomycin位點(diǎn)，能夠干擾Isll正常表 達(dá)）雜交而成。
[0143] 結(jié)果：Isll復(fù)合型突變小鼠（IsllnLacZ/fne°)較Isll不完全表達(dá)小鼠系表達(dá)更 少量的Isll，可導(dǎo)致胚胎在E11. 5死亡（54)。組織切片X-gal染色顯示Isll-nLaz小鼠中 Isll-nLaz顯色和內(nèi)源性Isll的表達(dá)部位完全一致。
[0144] 與圖1所示一致，在E9. 5Isll_nLacZ在背心系膜，SAN和SAN周圍心房?jī)?nèi)膜表達(dá) (圖2A，A'箭頭)。
[0145]在E11. 5,Isll-nLacZ表達(dá)于SAN(圖 2D，D'）。
[0146] 在E9. 5和E11.5Isll復(fù)合型突變體小鼠在SV心肌層，SAN，背心系膜部位的 Isll-nLacZ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著減少（圖2B，B'，E，E'，箭頭)。
[0147]Is11和HCN4抗體進(jìn)行免疫熒光染色表明在E9. 5天Is11復(fù)合型突變體SV中Is11 和HCN4陽(yáng)性細(xì)胞顯著減少（圖2C，C'）。
[0148] 結(jié)論：Isll對(duì)SAN細(xì)胞，SV心肌細(xì)胞，心臟后部的心臟祖細(xì)胞的增殖和存活都是必 須的。為此，使用BrdU作為細(xì)胞增殖標(biāo)記，使用TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡。發(fā)現(xiàn)在E9. 5胚 胎，SV心肌層BrdU標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量顯著減少，SV右角細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著增加（圖2G，G'）。
[0149] 2. 2為了進(jìn)一步研究Isll復(fù)合型突變體起搏細(xì)胞的功能，應(yīng)用超聲心動(dòng)儀檢測(cè)突 變小鼠E9. 5至E11. 5的心率變化。標(biāo)記了每個(gè)胚胎在子宮中的位置并檢測(cè)每個(gè)胚胎心率。
[0150] 結(jié)果：Isll復(fù)合型突變體在E9. 5的心率和對(duì)照組E9. 5的心率相比明顯變慢，在 Isll復(fù)合型突變體E11. 5心率減慢更加顯著（圖2H)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)Isll復(fù)合型突變胚胎會(huì) 出現(xiàn)間歇性的心臟早搏，其發(fā)生頻率隨著胚胎的發(fā)育而增加。在實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)程中有部分胚 胎發(fā)生長(zhǎng)時(shí)間心臟停搏。
[0151] 結(jié)論：Isll早期低表達(dá)的突變鼠死于心律失常。
[0152] 實(shí)施例3Isll復(fù)合型突變胚胎中Isll表達(dá)降低引起SNA功能相關(guān)的關(guān)鍵基因表 達(dá)降低
[0153]RNA原位雜交結(jié)果顯示，HCN4，Shox2和Tbx3在對(duì)照組E9. 5的SV中表達(dá)（圖3A-C， A'-C'，箭頭)，而在Isll復(fù)合型突變體E9. 5的SV中表達(dá)顯著降低（圖3F-H，F(xiàn)'-H'，箭頭)。
[0154]Cx40和Nkx2. 5在對(duì)照組胚胎心肌層表達(dá)，但不表達(dá)于SAN(圖3D，D'，E，E'，箭 頭)。在Isll復(fù)合型突變胚胎中發(fā)現(xiàn)Shox2和Tbx3出現(xiàn)異位表達(dá)，而沒(méi)有發(fā)現(xiàn)CX40和 NKX2. 5出現(xiàn)異位表達(dá)的現(xiàn)象（圖31，I'，J，J'，箭頭)。
[0155] 結(jié)論：Isll復(fù)合型突變胚胎中Isll表達(dá)降低可造成HCN4, Shox2和Tbx3等SNA 功能相關(guān)的基因表達(dá)降低，Isll調(diào)控了這些基因的表達(dá)，為其上游基因。
[0156] 實(shí)施例4Isll對(duì)已分化心肌細(xì)胞仍是必需的
[0157]在Isll復(fù)合型突變胚胎中，已分化SAN起搏細(xì)胞（E9. 5-E11. 5)，第二心區(qū)心臟祖 細(xì)胞和SV，SAN心肌層中Isll的表達(dá)都顯著降低。因此，使用Troponin-Cre(cTnT-Cre) 小鼠在已分化心肌細(xì)胞中特異性敲除Isll,用以觀察Isll在已分化竇房結(jié)細(xì)胞中的作 用。
[0158]cTnT-Cre敲除Isll小鼠（cTnT-Cre;Isll小鼠系）和Isll復(fù)合型突變鼠的表現(xiàn) 型類似，該突變鼠在胚胎期早期即E9. 5-E11. 5死亡，突變胚胎表現(xiàn)出明顯的心率變慢和早 搏，見(jiàn)圖7。
[0159] 結(jié)論：實(shí)驗(yàn)表明，即使心肌細(xì)胞已經(jīng)成熟，Isll的表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞的起搏功能仍 是必需的。
[0160] 實(shí)施例5在E9. 5使用HCN4-CreERT2敲除小鼠SAN細(xì)胞IS11可導(dǎo)致胚胎Ell. 5 竇性心律不齊，竇房結(jié)細(xì)胞減少和胚胎期致死
[0161] 由于Isll在SAN中持續(xù)表達(dá)且表達(dá)時(shí)間要長(zhǎng)于cTnT-Cre;因此需要使用其他方 法研究發(fā)育晚期Isll在SAN中的作用。
[0162] 5. 1在E9. 5天，SV作為心臟的主要起搏區(qū)域，而SAN最早在E11. 5天形成可分 辨的組織結(jié)構(gòu)，在E13. 5天成熟并行使功能。因此主要研究的是以上所述的SAN發(fā)育階 段。通過(guò)他莫昔芬誘導(dǎo)，HCN4-Cre可在心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)中表達(dá)。使用HCN4-CreERT2和帶 有Rosa26-LacZ或YFP背景的Isllf/f小鼠雜交，以追蹤C(jī)re的表達(dá)部位。采用可誘導(dǎo)的 HCMCre小鼠系（HCN4-CreERT2)構(gòu)建特異性的Isll在SAN起搏細(xì)胞中的基因敲除小鼠模 型。
[0163] 結(jié)果：通過(guò)在E9. 5天給予他莫昔芬后每天用超聲心動(dòng)儀檢測(cè)胚胎心率。發(fā)現(xiàn)， 和對(duì)照組相比，HCN4-CreERT2;Isll突變鼠心率在E10. 5天顯著變慢。HCN4-CreERT2 ; Isll突變體心率隨著發(fā)育過(guò)程逐漸降低，在Ell. 5天發(fā)生心臟長(zhǎng)時(shí)間停跳，大多數(shù)的 HCN4-CreERT2;Isll突變體胚胎在E11. 5天死亡（圖4A)。
[0164] 5. 2為了檢測(cè)SAN細(xì)胞在HCN4_CreERT2 ;Isll中分布情況，使用Rosa-LacZ染色 來(lái)跟蹤SAN細(xì)胞發(fā)育和分布情況。在胚胎E9. 5給予他莫昔芬后，于E10. 5-E11和E11. 5取 胚胎進(jìn)行X-gal染色（圖4B-F)。
[0165] 結(jié)果：在對(duì)照組E10. 5和11. 5胚胎，HCN4-CreERT2所標(biāo)記的X-gal陽(yáng)性細(xì)胞存 在于SV和SAN(圖4B，E，紅箭頭，bl，b2)，這個(gè)和內(nèi)源性HCMmRNA的表達(dá)部位一致（圖 3A)。但是在E10. 5-E11突變胚胎，SV區(qū)域內(nèi)的部分X-gal陽(yáng)性細(xì)胞缺失（圖4E，F(xiàn))。在 E11. 5,X-gal+陽(yáng)性細(xì)胞分布區(qū)域和對(duì)照組相似，但是SV中HCN4-CreERT2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯 著減少（圖 4B，C，紅箭頭，bl，b2,cl，c2,D)。
[0166] 5. 3應(yīng)用免疫熒光染色檢測(cè)在SAN細(xì)胞丟失前的Ell天Isll的表達(dá)情況。
[0167] 結(jié)果：在E9. 5天他莫昔芬的誘導(dǎo)顯著降低了Isll在SV和SAN中的表達(dá)（圖4G， H)，而同時(shí)Isll在咽部和背心系膜區(qū)域的表達(dá)未見(jiàn)改變。
[0168]HCN4-CreERT2;Isll突變胚胎的SV和SAN區(qū)域中HCN4和Tbx3的表達(dá)則顯著降 低（圖4I-L)，這表明Isll同時(shí)調(diào)控了HCN4和Tbx3的表達(dá)。
[0169] 此外，實(shí)驗(yàn)證明，在HCN4表達(dá)的SAN區(qū)域中，TUNEL標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量顯著增加（圖 8),而BrdU標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量減少。
[0170] 結(jié)論：Isll在SAN細(xì)胞的存活和增殖過(guò)程發(fā)育早期中都發(fā)揮了重要作用。
[0171] 實(shí)施例6使用HCN4-CreERT2在E11. 5胚胎SAN細(xì)胞中敲除Isll可導(dǎo)致竇性心律 不齊，減少SAN細(xì)胞的增殖。
[0172] 為了研究Isll在SAN發(fā)育晚期和其起搏功能中的作用，在SAN發(fā)育晚期敲除了 Isllo
[0173] 6. 1在Ell. 5天給予他莫昔芬，Isll突變胚胎心率在24和72小時(shí)后的心超檢測(cè) 中顯著變緩（圖5A)。但是和胚胎早期敲除Isll不同，晚期敲除Isll后大部分的突變胚胎 仍然可以存活。
[0174] 在E13. 5天給予他莫昔芬，發(fā)現(xiàn)突變胚胎心率在48小時(shí)后顯著降低（圖5B)。研 究還發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中對(duì)照組胚胎心率是逐漸增加的，但是HCN4-CreERT2;Isll 突變胚胎心率未見(jiàn)增加，并表現(xiàn)出心率變化不規(guī)則。（圖5B)。
[0175] 對(duì)E14. 5天心臟（E11. 5他莫昔芬誘導(dǎo)）整體和切片的X-gal和galactosidase 免疫熒光共染色顯示，Isll突變胚胎SAN中X-gal陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量（圖印，D'，H)較對(duì)照組 (圖5C，C'，G)略降低。定量分析顯示（每個(gè)SAN計(jì)數(shù)10個(gè)切片)，Isl突變胚胎的SAN中 X-gal陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量（175. 5± 11. 7/切片）（圖）較對(duì)照組（205. 6± 17. 6/切片）（圖 5C'）減少了 15%。
[0176] 結(jié)論：SAN發(fā)育晚期敲除Isll后，大部分胚胎可以存活，但仍會(huì)造成嚴(yán)重的心律失 堂 巾。
[0177] 6. 2Isll突變胚胎SAN中HCN4-CreERT2 ;Rosa-YFP陽(yáng)性細(xì)胞的增殖細(xì)胞（BrdU+) 明顯減少。相反的，在發(fā)育早期，HCN4-CreERT2 ;Isll突變胚胎SAN細(xì)胞凋亡未見(jiàn)增多。
[0178]HCN4-CreERT2 ;Isll突變鼠的SAN切片免疫熒光染色結(jié)果顯示Isll，HCN4和Tbx3 的表達(dá)顯著降低（圖5E-H)。但是盡管Tbx3的表達(dá)降低，并無(wú)證據(jù)顯示Isll突變體SAN中 有NKX2. 5的異位表達(dá)。
[0179] 結(jié)論：Isll的減少造成了多個(gè)基因（如HCN4)的減少，因此，Isll在心臟傳導(dǎo)系統(tǒng) 中可能起到了重要的上游調(diào)控作用。
[0180] 實(shí)施例7Isll調(diào)控了SAN發(fā)育和功能必須的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，離子通道，以及細(xì)胞周 期，細(xì)胞存活基因的表達(dá)。
[0181] 為了研究可能導(dǎo)致前述Isll突變鼠表現(xiàn)型的Isll潛在的下游靶基因，使用 qRT-PCR對(duì)E11. 5天HCN4-CreERT2 ;Isll突變鼠和對(duì)照組SAN細(xì)胞進(jìn)行了分析（他莫昔芬 在E9. 5進(jìn)行了誘導(dǎo)）（圖6A-C)。選擇與Isll相關(guān)或與Isll表現(xiàn)型相關(guān)的基因進(jìn)行分析。
[0182] 7. 1實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一系列信號(hào)通路基因表達(dá)下調(diào)，包括細(xì)胞增殖（Ccndl，Ccnd2， Ccnel，Ccnbl，Plkl，AurkaandCdknl),細(xì)胞存活（Bcl2)(圖 6A)和心臟以及SAN發(fā)育 所必需的轉(zhuǎn)錄因子（Shox2，Isll,Mef2c，Tbx3)(圖6B)。在這些基因中，Ccndl(encoding cyclinD1)和Mef2c已被證明是Isll的直接下游祀基因。同時(shí)，還有一系列和傳導(dǎo)系統(tǒng)功 能相關(guān)的離子通道基因的表達(dá)下調(diào)（Atplbl，Atplb2,Atp2al，Kcnel，Kcna5和Cacnalh)。 Gja5和Gjd3 (分別編碼了Cx40和Cx30. 2)的表達(dá)也明顯降低。Gjal和Gja4 (分別編碼了 Cx43和Cx37)的表達(dá)則有增高（圖6C)。此外，還發(fā)現(xiàn)和人類病竇綜合征相關(guān)的基因Myh6 在Isll突變胚胎SAN中的表達(dá)降低（圖6C)。
[0183] 7. 2SAN發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵因子HCN4和Tbx3在HCN4-CreERT2 ;Isll突變胚胎SAN 中的表達(dá)顯著降低。為了研究這2個(gè)基因是否是Isll的直接下游靶基因，對(duì)FACS純化后 E14. 5 至E17. 5HCN4-nEGFP突變鼠SAN細(xì)胞進(jìn)行了nano-ChIP分析（60) (51)。
[0184]qPCR分析ChIP結(jié)果中不同DNA的表達(dá)豐度。為了鑒定Isll在進(jìn)化保守區(qū)域 (ECRs)可能的結(jié)合位點(diǎn)（YTAATR)，檢查了小鼠HCN4和Tbx3基因組上游和下游各5kb的 區(qū)域。
[0185] 結(jié)果：2個(gè)ECRs可能包含了Isll結(jié)合位點(diǎn)（圖6D，F(xiàn))。 Tbx3-l(chr5:119671762-119672016)位于Tbx3的5'非編碼區(qū)域，在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS) 下游 1271bp和 1270bp包含有 2 個(gè)相鄰的TAAT位點(diǎn)。Tbx3-2(chr5:119684628-119685046) 在一個(gè)Tbx33'端相鄰的465bp的ECR中，含有多個(gè)潛在的Isll結(jié)合位點(diǎn)。
[0186]ChIP-PCR在HCN4 也發(fā)現(xiàn)了 2 個(gè)高豐度位點(diǎn)locus(圖 6E，F(xiàn))。HCN4-2 (chr9:58842538-58842979)定位于一個(gè)442bp內(nèi)含子ECR中，該位點(diǎn)已被證明為是一個(gè)有 效的增強(qiáng)子，該區(qū)域有多個(gè)Isll結(jié)合位點(diǎn)。HCN4-1 (chr9:58820136-58820197)位于一個(gè) 非保守區(qū)域內(nèi)，位于HCN4轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游3376bp處，包含有一個(gè)潛在的Is11結(jié)合位點(diǎn)。 [0187] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種 LIM 同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子（LIM homeodomain transcription factor，Isletl, Isll)基因或其蛋白的用途，其特征在于，用于制備檢測(cè)或預(yù)測(cè)竇房結(jié)（SAN)異常相關(guān)疾病 的試劑或試劑盒。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的Isll基因或蛋白來(lái)自于哺乳動(dòng)物，更 佳地來(lái)源于嚙齒動(dòng)物（如小鼠、大鼠）或靈長(zhǎng)類動(dòng)物(如人)。
3. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的竇房結(jié)異常相關(guān)疾病包括：病竇綜合 征或心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)心律失常。
4. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的試劑包括Isll特異性引物、特異性抗 體、探針和/或芯片。
5. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述檢測(cè)是測(cè)定羊水樣品、組織樣品、血液 樣品、血清樣品或體液樣品。
6. 如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述的羊水樣品來(lái)自小鼠E8-E14或人類12 周20周的胚胎。
7. 如權(quán)利要求1所述的的用途，其特征在于，所述的試劑包括： (a) 檢測(cè)Isll的核酸芯片； (b) 抗Isll蛋白的特異性抗體；和/或 (c) 特異性擴(kuò)增Isll的基因組DNA、mRNA或cDNA的特異性引物。
8. -種用于檢測(cè)或預(yù)測(cè)竇房結(jié)異常相關(guān)疾病的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包 括檢測(cè)Isll的核酸芯片或特異性擴(kuò)增Isll核苷酸序列的特異性引物、以及說(shuō)明書；其中所 述的說(shuō)明書包括以下內(nèi)容：通過(guò)測(cè)定Isll基因或蛋白的表達(dá)和/或活性來(lái)檢測(cè)或預(yù)測(cè)竇房 結(jié)（SAN)異常相關(guān)疾病。
9. 如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述的說(shuō)明書還記載以下內(nèi)容：檢測(cè)所需 對(duì)象的Isll基因或蛋白的表達(dá)和/或活性，若顯著低于正常人群，則說(shuō)明，該檢測(cè)對(duì)象患有 竇房結(jié)異常相關(guān)疾病的概率高于正常人群。
10. -種制備動(dòng)物模型的方法，其特征在于，包括步驟： 將Isllhypo/+基因型的嚙齒動(dòng)物與Isll+/nLacZ基因型的嚙齒動(dòng)物進(jìn)行交配、或?qū)?Isllhypo/+基因型的嚙齒動(dòng)物與Isllhypo/+基因型的嚙齒動(dòng)物進(jìn)行交配，從而獲得Isll 復(fù)合低表達(dá)（Isllhypo/nLacZ)變異嚙齒動(dòng)物子代。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104342485SQ201310325147
【公開(kāi)日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2013年7月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月30日
【發(fā)明者】孫云甫, 梁興群 申請(qǐng)人:上海市東方醫(yī)院（同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院）