產(chǎn)油酵母和真菌中類胡蘿卜素的產(chǎn)生的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供用于生產(chǎn)表達類胡蘿卜素的經(jīng)工程設(shè)計的產(chǎn)油酵母或真菌的系統(tǒng)。
【專利說明】產(chǎn)油酵母和真菌中類胡蘿卜素的產(chǎn)生
[0001]本申請是申請日為2006年3月20日，申請?zhí)枮?00680008816.2，發(fā)明名稱為“產(chǎn)油酵母和真菌中類胡蘿卜素的產(chǎn)生”的申請的分案申請。
[0002]相關(guān)申請案
[0003]本申請案主張2005年3月18日申請的美國臨時申請案第60/663，621號的權(quán)益，所述申請案的內(nèi)容是以全文引用的方式并入本文中。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004]無
【背景技術(shù)】
[0005]類胡蘿卜素是由某些有機體(包括光合作用有機體)(例如，植物、藻類、藍藻)和一些真菌自然產(chǎn)生的有機色素，其顏色在黃色到紅色的范圍內(nèi)。類胡蘿卜素負責使胡蘿卜呈橙色，同時也是導致火烈鳥和鮭魚呈粉紅色和龍蝦與小蝦呈紅色的原因。然而，動物無法產(chǎn)生類胡蘿卜素并且必須通過飲食來接收類胡蘿卜素。
[0006]工業(yè)上將類 胡蘿卜素色素(例如，胡蘿卜素和奸青素(astaxanthin))用作食品和飼料原料的成分，從而提供營養(yǎng)功能并增強消費者的可接受性。舉例來說，蝦青素廣泛用于鮭魚水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中以使其具有其野生對應物的橙色特征。一些類胡蘿卜素還是維生素A的前體。同時，類胡蘿卜素具有抗氧化劑特性，并且可具有多種健康益處(例如，參看Jyonouchi 等人，Nutr.Cancerl6:93,1991 ；Giovannucci 等人，J.Natl.Cancer Inst.87:1767,1995 ；Miki, Pure App1.Chem63:141,1991 ；Chew 等人，Anticancer Res.19:1849,1999 ;Wang 等人，Antimicrob.Agents Chemother.44:2452, 2000)。一些類胡蘿卜素(諸如β_胡蘿卜素、番茄紅素和葉黃素)當前是作為營養(yǎng)補充劑銷售。
[0007]一般來說，產(chǎn)生類胡蘿卜素的生物系統(tǒng)在工業(yè)上極難操作和/或因僅產(chǎn)生低水平的化合物而使工業(yè)規(guī)模分離無法實行。因此，工業(yè)上使用的大多數(shù)類胡蘿卜素都是通過化學合成制備。故需要經(jīng)改良的能產(chǎn)生類胡蘿卜素的生物系統(tǒng)。先前已對基因工程設(shè)計某些細菌或真菌以產(chǎn)生較高水平的類胡蘿卜素進行一些嘗試(例如，參看Misawa等人，J.Biotechnol.59:169，1998 ;Visser 等人，F(xiàn)EMS Yeast Research4:221,2003)。然而，仍需要允許以較高產(chǎn)量生產(chǎn)并且更易于分離的經(jīng)改良系統(tǒng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明提供一種重組真菌，其中:a.上述真菌因可以積累占其細胞干重至少約20%的脂質(zhì)而為產(chǎn)油真菌；且b.上述真菌產(chǎn)生至少一種類胡蘿卜素，并且其可積累占其細胞干重至少約I %的所產(chǎn)生的類胡蘿卜素；其中上述真菌包含至少一種選自由產(chǎn)類胡蘿卜素修飾、產(chǎn)油修飾和其組合組成的群組的修飾，且其中上述至少一種修飾改變上述真菌的產(chǎn)油能力、賦予上述真菌產(chǎn)油能力、賦予上述真菌產(chǎn)生占其細胞干重至少約1%的水平的上述至少一種類胡蘿卜素的能力或賦予上述真菌產(chǎn)生至少一種上述真菌不會自然產(chǎn)生的類胡蘿卜素的能力。
[0009]上述真菌是自然產(chǎn)油的。
[0010]上述真菌不是自然產(chǎn)油的。
[0011]上述真菌不會自然產(chǎn)生上述至少ー種類胡蘿卜素。
[0012]上述真菌自然產(chǎn)生上述至少ー種類胡蘿卜素。
[0013]上述真菌不會自然產(chǎn)生至少ー種類胡蘿卜素。
[0014]上述真菌自然產(chǎn)生至少ー種類胡蘿卜素。
[0015]上述真菌是以單一細胞的形式生長。
[0016]上述真菌為酵母。
[0017]上述真菌含有至少ー種產(chǎn)油修飾。
[0018]上述至少ー種產(chǎn)油修飾賦予上述真菌產(chǎn)油能力。
[0019]上述至少ー種產(chǎn)油修飾改變上述真菌的產(chǎn)油能力。
[0020]上述真菌另外包含至少ー種產(chǎn)類胡蘿卜素修飾，其中上述產(chǎn)類胡蘿卜素修飾賦予上述真菌產(chǎn)生占其細胞干重至少約1%的水平的上述至少ー種類胡蘿卜素的能力，或賦予上述真菌產(chǎn)生至少ー種上述真菌不會自然產(chǎn)生的類胡蘿卜素的能力。
[0021]上述至少ー種產(chǎn)油修飾增加至少ー種產(chǎn)油多肽的表達或活性。
[0022]上述至少ー種產(chǎn)油修飾降低至少ー種產(chǎn)油多肽的表達或活性。
[0023]上述至少ー種產(chǎn)油修飾增加至少ー種產(chǎn)油多肽的表達或活性，并且降低至少ー種其它產(chǎn)油多肽的表達或活性。
[0024]上述真菌是紅酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous)(紅法夫酵母(Phqffiarhodozymaノ)。
[0025]上述真菌是釀酒酵母(Saccharomycescerevisae)。
[0026]上述至少ー種產(chǎn)油多肽選自由以下多肽組成的群組:こ酰輔酶A羧化酶多肽、丙酮酸脫羧酶多肽、異檸檬酸脫氫酶多肽、ATP-檸檬酸裂解酶多肽、蘋果酸酶多肽、AMP脫氨酶多肽和其組合。
[0027]上述至少ー種產(chǎn)油多肽為至少ー種選自由表1到表6中任一表中的多肽組成的群組的多肽。
[0028]上述至少ー種產(chǎn)油修飾包含在上述真菌中表達至少ー種異源產(chǎn)油多肽。
[0029]上述至少ー種產(chǎn)油修飾包含表達至少一種編碼上述至少ー種異源產(chǎn)油多肽的異源基因。
[0030]上述至少ー種異源產(chǎn)油多肽包含動物多肽、哺乳動物多肽、昆蟲多肽、植物多肽、真菌多肽、酵母多肽、藻類多肽、細菌多肽、藍藻多肽、古細菌多肽或原生動物多肽。
[0031]上述至少ー種異源產(chǎn)油多肽包含至少兩種異源產(chǎn)油多肽。
[0032]上述至少兩種異源產(chǎn)油多肽是來自單ー原始生物體。
[0033]上述至少兩種異源產(chǎn)油多肽是來自至少兩種不同的原始生物體。
[0034]上述真菌含有至少ー種產(chǎn)類胡蘿卜素修飾。
[0035]上述至少ー種產(chǎn)類胡蘿卜素修飾賦予上述真菌產(chǎn)生占其細胞干重至少約1%的水平的上述至少ー種類胡蘿卜素的能力。
[0036]上述至少ー種產(chǎn)類胡蘿卜素修飾賦予上述真菌產(chǎn)生至少ー種上述真菌不會自然產(chǎn)生的類胡蘿卜素的能力。
[0037]上述真菌另外包含至少一種產(chǎn)油修飾，其中上述產(chǎn)油修飾改變上述真菌的產(chǎn)油能力或賦予上述真菌產(chǎn)油能力。
[0038]上述至少一種產(chǎn)類胡蘿卜素修飾賦予上述真菌產(chǎn)生選自由達到占上述真菌的細胞干重的以下水平組成的群組的上述至少一種類胡蘿卜素的能力:至少約2%、至少約3%、至少約5%和至少約10%。
[0039]上述至少一種類胡蘿卜素選自由蝦青素、胡蘿卜素、角黃素、玉米黃素、葉黃素、番茄紅素和其組合組成的群組。
[0040]上述至少一種類胡蘿卜素主要為蝦青素。
[0041]上述至少一種產(chǎn)類胡蘿卜素修飾增加產(chǎn)類胡蘿卜素多肽的表達或活性。
[0042]上述至少一種產(chǎn)類胡蘿卜素修飾降低產(chǎn)類胡蘿卜素多肽的表達或活性。
[0043]上述至少一種產(chǎn)類胡蘿卜素修飾增加至少一種產(chǎn)類胡蘿卜素多肽的表達或活性并且降低至少一種其它產(chǎn)類胡蘿卜素多肽的表達或活性。
[0044]上述至少一種產(chǎn)類胡蘿卜素修飾包含表達至少一種異源產(chǎn)類胡蘿卜素多肽。
[0045]上述至少一種產(chǎn) 類胡蘿卜素修飾包含表達至少一種編碼上述至少一種異源產(chǎn)類胡蘿卜素多肽的異源基因。
[0046]上述產(chǎn)類胡蘿卜素多肽選自由以下多肽組成的群組:類異戊二烯生物合成多肽、類胡蘿卜素生物合成多肽、類異戊二烯生物合成競爭劑多肽和其組合。
[0047]上述類異戊二烯生物合成多肽選自由以下多肽組成的群組:乙酰乙酰輔酶A硫解酶多肽、HMG-CoA合酶多肽、HMG-CoA還原酶多肽、甲羥戊酸激酶多肽、磷酸甲羥戊酸激酶多肽、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶多肽、IPP異構(gòu)酶多肽、FPP合酶多肽和GGPP合酶多肽。
[0048]上述類胡蘿卜素生物合成多肽選自由以下多肽組成的群組:八氫番茄紅素合酶多肽、八氫番茄紅素脫氫酶多肽、番茄紅素環(huán)化酶多肽、類胡蘿卜素酮酶多肽、類胡蘿卜素羥化酶多肽、蝦青素合酶多肽、類胡蘿卜素ε羥化酶多肽、類胡蘿卜素葡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽、番茄紅素環(huán)化酶(β和ε亞單位)多肽和?；o酶A: 二?；视王；D(zhuǎn)移酶多肽。
[0049]上述類異戊二烯生物合成競爭劑多肽選自由角鯊烯合酶多肽、異戊二烯基二磷酸合酶和PHB聚異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶組成的群組。
[0050]上述產(chǎn)類胡蘿卜素多肽選自由表7-25、表29和表30中任一表中的多肽中的任一種和其組合組成的群組。
[0051]上述至少一種異源產(chǎn)類胡蘿卜素多肽包含動物多肽、哺乳動物多肽、昆蟲多肽、植物多肽、真菌多肽、酵母多肽、藻類多肽、細菌多肽、藍藻多肽、古細菌多肽或原生動物多肽。
[0052]上述至少一種異源產(chǎn)類胡蘿卜素多肽包含至少兩種異源產(chǎn)類胡蘿卜素多肽。
[0053]上述至少兩種異源產(chǎn)類胡蘿卜素多肽是來自單一原始生物體。
[0054]上述至少兩種異源產(chǎn)類胡蘿卜素多肽是來自至少兩種不同的原始生物體。
[0055]上述真菌積累所產(chǎn)生的至少一種類胡蘿卜素達到選自由以下水平組成的群組的水平:占上述真菌的細胞干重大于約I %、大于約2%、大于約3%、大于約5%和大于約10%。
[0056]上述真菌積累細胞質(zhì)體形式的脂質(zhì)。
[0057]上述至少一種類胡蘿卜素積累于上述細胞質(zhì)油體中。[0058]本發(fā)明提供ー種解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株,其包含ー種或ー種以上選自由產(chǎn)油修飾、產(chǎn)類胡蘿卜素修飾和其組合組成的群組的修飾，使得上述菌株積累占其細胞干重1%到10%的至少ー種類胡蘿卜素。
[0059]上述菌株積累占其細胞干重20%到50%的脂質(zhì)。
[0060]上述菌株積累占其細胞干重20%到50%的細胞質(zhì)油體形式的脂質(zhì)。
[0061]上述菌株包含選自由以下修飾組成的群組的產(chǎn)類胡蘿卜素修飾:a.表達選自由以下多肽組成的群組的多肽:缺乏N端跨膜結(jié)構(gòu)域的截短型內(nèi)源HMG-CoA還原酶多肽、こ酰こ酰輔酶A硫解酶、HMG-CoA合酶、FPP合酶和GGPP合酶；b.表達選自由以下多肽組成的群組的異源多肽:八氫番茄紅素合酶、八氫番茄紅素去飽和酶、番茄紅素環(huán)化酶、類胡蘿卜素酮酶、類胡蘿卜素羥化酶和其組合；c.降低選自由以下多肽組成的群組的內(nèi)源多肽的表達或活性:角鯊烯合酶多肽、異戊二烯基二磷酸合酶多肽和PHB聚異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽；和其組合。 [0062]上述菌株積累占其細胞干重1% -10%的(6-胡蘿卜素。
[0063]上述菌株包含選自由以下修飾組成的群組的產(chǎn)類胡蘿卜素修飾:a.表達選自由以下多肽組成的群組的多肽:缺乏N端跨膜結(jié)構(gòu)域的截短型內(nèi)源HMG-CoA還原酶多肽、こ酰こ酰輔酶A硫解酶、HMG-CoA合酶、FPP合酶和GGPP合酶；b.表達選自由以下多肽組成的群組的異源多肽:八氫番茄紅素合酶、八氫番茄紅素去飽和酶、番茄紅素環(huán)化酶、類胡蘿卜素酮酶、類胡蘿卜素羥化酶、蝦青素合酶、類胡蘿卜素e羥化酶、番茄紅素環(huán)化酶和e亞単位)、類胡蘿卜素葡糖基轉(zhuǎn)移酶、?；o酶A:二?；视王；D(zhuǎn)移酶和其組合；c.降低內(nèi)源角鯊烯合酶多肽的表達或活性；和其組合。
[0064]上述菌株積累占其細胞干重1% -10%的蝦青素或葉黃素。
[0065]本發(fā)明提供一種產(chǎn)生類胡蘿卜素的方法，該方法包含以下步驟:a.在允許產(chǎn)生上述類胡蘿卜素的條件下，培養(yǎng)上述真菌山.和分離上述所產(chǎn)生的類胡蘿卜素。
[0066]上述分離步驟包含分離培養(yǎng)基以獲得至少ー個富含類胡蘿卜素的部分。
[0067]上述培養(yǎng)步驟包含在允許將上述類胡蘿卜素積累于細胞質(zhì)油體中的條件下培養(yǎng)上述真菌，且上述分離步驟包含分離從上述細胞質(zhì)油體得到的油。
[0068]上述類胡蘿卜素選自由以下物質(zhì)組成的群組:蝦青素、(6-胡蘿卜素、角黃素、玉米黃素、葉黃素、番茄紅素和其組合。
[0069]上述類胡蘿卜素包含蝦青素。
[0070]本發(fā)明提供一種制備含有類胡蘿卜素的食品或飼料添加劑的方法，上述方法包含以下步驟:a.在允許產(chǎn)生上述類胡蘿卜素的條件下，培養(yǎng)上述真菌；b.分離上述類胡蘿卜素；和c.將上述經(jīng)分離的類胡蘿卜素與ー種或ー種以上其它食品或飼料添加劑組分組合。
[0071]本發(fā)明提供用于生物學生產(chǎn)類胡蘿卜素的經(jīng)改良系統(tǒng)。一方面，本發(fā)明涵蓋在產(chǎn)油生物體中生產(chǎn)類胡蘿卜素是合乎需要的這ー發(fā)現(xiàn)。不希望受任何特定理論的束縛，本發(fā)明提出，如果將類胡蘿卜素螯合于脂質(zhì)體中，那么生物系統(tǒng)就能夠積累較高水平的所述化合物。然而，不管絕對水平是否較高，積累于產(chǎn)油生物體脂質(zhì)體內(nèi)的類胡蘿卜素都可通過脂質(zhì)體的分離而輕易地分離。
[0072]因此，本發(fā)明提供產(chǎn)生ー種或ー種以上類胡蘿卜素的產(chǎn)油真菌(例如，包括酵母或其它單細胞真菌)。本發(fā)明還提供構(gòu)造所述酵母和真菌的方法；使用所述酵母和真菌產(chǎn)生類胡蘿卜素的方法；和使用在所述產(chǎn)油酵母或真菌中所產(chǎn)生的類胡蘿卜素制備含有類胡蘿卜素的組合物(諸如食品或飼料添加劑，或營養(yǎng)補充劑)的方法。具體來說，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生含有一個或一個以上產(chǎn)油和/或產(chǎn)類胡蘿卜素修飾的酵母和真菌的系統(tǒng)和方法，與缺乏所述修飾的其它相同生物體相比，所述修飾使所述生物體的產(chǎn)油能力提高和/或改變其產(chǎn)生類胡蘿卜素的能力。
[0073]本發(fā)明另外涵蓋脂質(zhì)積累系統(tǒng)可用于產(chǎn)生和/或分離親脂劑(諸如(但不限于)類異戊二烯或類異戊二烯衍生的化合物)的通用識別。因此，根據(jù)本發(fā)明，需要工程設(shè)計生物體以產(chǎn)生所述親脂劑和/或積累脂質(zhì)。
[0074]所屬領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)包括隨附權(quán)利要求在內(nèi)的本發(fā)明將對本發(fā)明的各個其它方面顯而易見。
[0075]定義
[0076]產(chǎn)類胡蘿卜素修飾:如本文所使用的術(shù)語“產(chǎn)類胡蘿卜素修飾”是指如本文所述的對宿主生物體進行的調(diào)節(jié)一種或一種以上類胡蘿卜素的產(chǎn)量的修飾。舉例來說，產(chǎn)類胡蘿
卜素修飾可增加一種或一種以上類胡蘿卜素的產(chǎn)量，和/或可改變不同類胡蘿卜素的相對產(chǎn)量。大體上，本發(fā)明的產(chǎn)類胡蘿卜素修飾可為任何化學、生理學、基因或其它修飾，與不經(jīng)歷相同修飾的其它相同生物體中所產(chǎn)生的一種或一種以上類胡蘿卜素的水平相比，所述修飾適當?shù)馗淖兯拗魃矬w中由所述生物體所產(chǎn)生的所述類胡蘿卜素的產(chǎn)量。然而，在大部分實施例中，產(chǎn)類胡蘿卜素修飾將包含通常引起一種或一種以上所選類胡蘿卜素產(chǎn)量增加的基因修飾。在一些實施例中，所選類胡蘿卜素為蝦青素、β_胡蘿卜素、角黃素、葉黃素、番茄紅素、八氫番茄紅素、玉米黃素和/或玉米黃素或蝦青素的變體(例如，糖苷化、酯化玉米黃素或蝦青素)中的一種或一種以上。在一些實施例中，所選類胡蘿卜素為一種或一種以上葉黃素和/或其變體(例如，糖苷化、酯化葉黃素)。在某些實施例中，所選葉黃素選自由蝦青素、葉黃素、玉米黃素、番茄紅素和其變體組成的群組。在一些實施例中，所選類胡蘿卜素為蝦青素、β -胡蘿卜素、角黃素、葉黃素、番茄紅素和玉米黃素和/或玉米黃素或蝦青素的變體中的一種或一種以上。在一些實施例中，類胡蘿卜素為胡蘿卜素。在一些實施例中，所選類胡蘿卜素為蝦青素。在一些實施例中，所選類胡蘿卜素為除β_胡蘿卜素以外的物質(zhì)。`
[0077]產(chǎn)類胡蘿卜素多肽:如本文所使用的術(shù)語“產(chǎn)類胡蘿卜素多肽”是指在細胞中產(chǎn)生類胡蘿卜素的過程中所涉及的任何多肽，且其可包括除產(chǎn)生類胡蘿卜素的過程外的其它過程中所涉及的多肽，但所述多肽的活性會(例如)通過清除類胡蘿卜素生產(chǎn)中直接涉及的類胡蘿卜素多肽所利用的底物或反應物而影響一種或一種以上類胡蘿卜素的生產(chǎn)程度或產(chǎn)量。產(chǎn)類胡蘿卜素多肽包括類異戊二烯生物合成多肽、類胡蘿卜素生物合成多肽和類異戊二烯生物合成競爭劑多肽，所述術(shù)語已于本文中定義。所述術(shù)語還涵蓋可能影響脂質(zhì)體中類胡蘿卜素積累的程度的多肽。
[0078]類胡蘿卜素:在所屬領(lǐng)域中應將術(shù)語“類胡蘿卜素”理解為是指由類異戊二烯路徑中的中間體得到的一類結(jié)構(gòu)不同的色素。類胡蘿卜素生物合成中的約定步驟為由香葉基香葉基焦磷酸形成八氫番茄紅素。類胡蘿卜素可無環(huán)或為環(huán)狀，并且可含或可不含氧，因此術(shù)語類胡蘿卜素包括胡蘿卜素與葉黃素?？偟膩碚f，類胡蘿卜素為具有在形式上衍生自五碳化合物IPP的共軛多烯碳骨架的碳氫化合物，包括三萜(C3tl 二-阿樸類胡蘿卜素(C30diapocarotenoid))和四職(C4tl類胡蘿卜素)，以及其氧化衍生物和例如長度為C35、C5(1、C60, C70, C8tl或其它長度的其它化合物。許多類胡蘿卜素都具有強吸光特性，并且其長度可在超過C2tltl的范圍內(nèi)。C3tl 二 -阿樸類胡蘿卜素通常是由6個類異戊二烯單元組成，所述類異戊二烯單元是以使類異戊二烯單元的排列在分子中心處倒轉(zhuǎn)從而使兩個中心甲基呈1，6位關(guān)系而剰余非末端甲基呈1，5位關(guān)系的方式連接。在形式上，所述C3tl類胡蘿卜素可通過以下方法從具有具共軛雙鍵的長中心鏈的無環(huán)C3tlH42結(jié)構(gòu)獲得:(i)氫化；(ii)脫氫；(iii)環(huán)化；(iv)氧化；(v)酷化/糖基化；或這些方法的任何組合。C4tl類胡蘿卜素通常是由八個類異戊二烯單元組成，所述類異戊二烯單元是以使類異戊二烯單元的排列在分子中心處倒轉(zhuǎn)從而使兩個中心甲基呈1，6位關(guān)系而剰余非末端甲基呈1，5位關(guān)系的方式連接。在形式上，所述C4tl類胡蘿卜素可通過以下方法從具有具共軛雙鍵的長中心鏈的無環(huán)C4tlH56結(jié)構(gòu)獲得:(i)氫化；(ii)脫氫；(iii)環(huán)化；(iv)氧化；(v)酷化/糖基化；或這些方法的任何組合。這類C4tl類胡蘿卜素中還包括由碳骨架重排或(形式上)移除部分所述結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生的某些化合物。自然界中已鑒別出超過600種不同的類胡蘿卜素；某些常見類胡蘿卜素已描繪于圖1中。類胡蘿卜素包括(但不限干):花黃素、金盞花紅素、金盞花黃素、蝦青素、角黃素、辣椒紅素、隱黃素、a-胡蘿卜素、卜胡蘿卜素、(6, V-胡蘿卜素、S-胡蘿卜素、e-胡蘿卜素、海膽酮、3-羥基海膽酮、3'-羥基海膽酮、Y-胡蘿卜素、V-胡蘿卜素、4-酮基-Y -胡蘿卜素“-胡蘿卜素、a -隱黃素、脫氧屈曲黃素、硅藻黃素、7，8- 二脫氫蝦青素、二脫氫番爺紅素、巖藻黃素、巖藻黃醇、異胡蘿卜素(isorenieratene)、P _異胡蘿卜素、萵苣黃素(Iactucaxanthin)、葉黃素、番爺紅素、myxobactone、新葉黃素、鏈孢紅素、輕基鏈孢紅素、多甲藻素、八氫番茄紅素、玫紅品、玫紅品糖苷、4-酮基-玉紅黃素、管藻黃素、球形烯、球形酮、螺菌黃素、圓酵母素、4-酮基-圓酵母素、3-羥基-4-酮基-圓酵母素、烏利奧利德(uriolide)、こ酸烏利奧利德、紫黃素、玉米黃素-P - 二糖苷、玉米黃素和C30類胡蘿卜素。此外，類胡蘿卜素化合物包括這些分子的衍生物，其可包括羥基-、甲氧基-、氧基-、環(huán)氧基-、羧基-或醛式官 能團。另外，所包括的類胡蘿卜素化合物包括酷(例如，糖苷酯、脂肪酸酷)和硫酸酯衍生物(例如經(jīng)酯化葉黃素)。
[0079]類胡蘿卜素生物合成多肽:術(shù)語“類胡蘿卜素生物合成多肽”是指ー種或ー種以上類胡蘿卜素的合成過程中所涉及的任何多肽。僅舉幾例，這些類胡蘿卜素生物合成多肽例如包括八氫番茄紅素合酶、八氫番茄紅素脫氫酶(或去飽和酶)、番茄紅素環(huán)化酶、類胡蘿
卜素酮酶、類胡蘿卜素羥化酶、蝦青素合酶、類胡蘿卜素e羥化酶、番茄紅素環(huán)化酶和￡亞單位)、類胡蘿卜素葡糖基轉(zhuǎn)移酶和?；o酶A:二?；视王；D(zhuǎn)移酶。類胡蘿卜素生物合成多肽序列的代表性實例提供于表17-25中。
[0080]基因:如本文所使用的術(shù)語“基因” 一般是指編碼多肽的核酸，其視情況包括可影響ー種或ー種以上基因產(chǎn)物(即，RNA或蛋白質(zhì))的表達的某些調(diào)控元件。
[0081]異源:如本文所使用的術(shù)語“異源”是指基因或多肽，即指并非自然存在于表達基因或多肽的生物體中的所述基因或多肽。應了解，一般來說，當對異源基因或多肽進行選擇以將其引入宿主細胞和/或通過宿主細胞表達時，可選擇異源基因或多肽的特定原始生物體對于實踐本發(fā)明并不重要。有關(guān)的需要考慮的事項可包括(例如)潛在來源與宿主生物體在進化過程中如何緊密相關(guān)；或原始生物體與已進行其它相關(guān)多肽序列選擇的其它原始生物體的關(guān)系如何。[0082]宿主細胞:如本文所使用的“宿主細胞”為已根據(jù)本發(fā)明進行處理從而能積累脂質(zhì)和/或表達一種或一種以上如本文所述的類胡蘿卜素的酵母細胞或真菌細胞。如本文所使用的術(shù)語“經(jīng)修飾宿主細胞”為含有根據(jù)本發(fā)明的至少一種產(chǎn)油修飾和/或至少一種產(chǎn)類胡蘿卜素修飾的宿主細胞。
[0083]經(jīng)分離:如本文所使用的術(shù)語“經(jīng)分離”意謂已將經(jīng)分離的實體與至少一種先前與其締合的組分分開。當已將大部分其它組分移除時，所述經(jīng)分離實體“經(jīng)純化”。分離和/或純化可使用所屬領(lǐng)域已知的任何技術(shù)進行，例如包括分餾、萃取、沉淀或其它分離方法。[0084]類異戊二烯生物合成競爭劑多肽:如本文所使用的術(shù)語“類異戊二烯生物合成競爭劑多肽”是指在細胞中的表達會降低進入類胡蘿卜素生物合成路徑的可用香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)的水平的多肽。舉例來說，類異戊二烯生物合成競爭劑多肽包括對GGPP之前的類異戊二烯中間體起作用從而產(chǎn)生較少GGPP的酶(例如參看圖5)。角鯊烯合酶就為一種根據(jù)本發(fā)明的類異戊二烯生物合成競爭劑多肽；代表性角鯊烯合酶序列提供于表16中。異戊二烯基二磷酸合酶和對羥基苯甲酸(PHB)聚異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶也為根據(jù)本發(fā)明的其它類異戊二烯生物合成競爭劑多肽；代表性異戊二烯基二磷酸合酶和PHB聚異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽分別提供于表29和表30中。
[0085]類異戊二烯生物合成多肽:術(shù)語“類異戊二烯生物合成多肽”是指類異戊二烯的合成過程中所涉及的任何多肽。舉例來說，如本文所論述，乙酰乙酰輔酶A硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA還原酶、甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶、IPP異構(gòu)酶、FPP合酶和GGPP合酶為類異戊二烯生物合成的甲羥戊酸路徑中所涉及的所有酶。出于本發(fā)明的目的，這些蛋白質(zhì)中的每一種也是類異戊二烯生物合成多肽，并且這些酶的代表性實例的序列提供于表7-15中。
[0086]類異戊二烯路徑:在所屬領(lǐng)域中應將“類異戊二烯路徑”理解為是指產(chǎn)生或利用五碳代謝物焦磷酸異戊酯(IPP)的代謝路徑。如本文所論述，有兩種不同的路徑可產(chǎn)生常見的類異戊二烯前體IPP- “甲羥戊酸路徑”和“非甲羥戊酸路徑”。術(shù)語“類異戊二烯路徑”一般足以涵蓋這兩種類型的路徑。由IPP生物合成類異戊二烯是通過若干個五碳異戊二烯亞單位聚合發(fā)生。源自IPP的類異戊二烯代謝物具有不同的尺寸和化學結(jié)構(gòu)，包括環(huán)狀與無環(huán)分子。類異戊二烯代謝物包括(但不限于)單萜、倍半萜、二萜、固醇和多萜醇(諸如類胡蘿卜素)。
[0087]產(chǎn)油修飾:如本文所使用的術(shù)語“產(chǎn)油修飾”是指如本文所述對宿主生物體進行的調(diào)節(jié)所述宿主生物體的所需產(chǎn)油能力的修飾。在一些情況下，宿主生物體將因具有積累占其細胞干重至少約20%的脂質(zhì)的能力而為產(chǎn)油生物體。盡管如此，仍然需要根據(jù)本發(fā)明對此類生物體施行產(chǎn)油修飾，例如以增加(例如，在一些情況下可能降低)其總脂質(zhì)積累，或調(diào)節(jié)其所積累的一種或一種以上特定脂質(zhì)的類型或一種或一種以上特定脂質(zhì)的量(例如，增加三?；视偷南鄬Ψe累)。在其它情況下，宿主生物體可能為不產(chǎn)油生物體(但可能含有其它生物體中用于積累脂質(zhì)的一些酶和調(diào)控組分)，并且可能需要根據(jù)本發(fā)明進行產(chǎn)油修飾以便能夠產(chǎn)油。本發(fā)明還預期對不產(chǎn)油宿主菌株施行產(chǎn)油修飾，從而使其產(chǎn)油能力增加，甚至即使在經(jīng)修飾后，其可能也不是如本文所定義的產(chǎn)油生物體。大體上，產(chǎn)油修飾可為任何化學、生理學、基因或其它修飾，與未經(jīng)歷產(chǎn)油修飾的其它相同生物體相比，所述修飾使宿主生物體的產(chǎn)油能力適當?shù)馗淖?。然而，在大部分實施例中，產(chǎn)油修飾將包含通常引起ー種或ー種以上產(chǎn)油多肽的產(chǎn)量増加和/或活性增強的基因修飾。在一些實施例中，產(chǎn)油修飾包含至少ー種化學、生理學、基因或其它修飾；在其它實施例中，所述產(chǎn)油修飾包含ー種以上化學、生理學、基因或其它修飾。在利用ー種以上修飾的某些方面，所述修飾可包含化學、生理學、基因或其它修飾的任何組合(例如，ー種或ー種以上基因修飾和化學或生理學修飾)。[0088]產(chǎn)油多肽:如本文所使用的術(shù)語“產(chǎn)油多肽”是指細胞脂質(zhì)積累過程中所涉及的任何多肽，且其可包括除脂質(zhì)生物合成外的其它過程中所涉及的多肽，但其活性將(例如)通過清除脂質(zhì)積累直接涉及的產(chǎn)油多肽所利用的底物或反應物而影響ー種或ー種以上脂質(zhì)積累的程度或水平。舉例來說，如本文所論述，在其它蛋白質(zhì)中こ酰輔酶A羧化酶、丙酮酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、ATP-檸檬酸裂解酶、蘋果酸酶和AMP脫氨酶都涉及于細胞脂質(zhì)積累中。一般來說，預期降低丙酮酸脫羧酶或異檸檬酸脫氫酶的活性和/或增強こ酰輔酶A羧化酶、ATP-檸檬酸裂解酶、蘋果酸酶和/或AMP脫氨酶的活性將促進產(chǎn)油能力。出于本發(fā)明的目的，這些蛋白質(zhì)中的每ー種都為產(chǎn)油多肽，且這些酶的代表性實例的序列提供于表1-6中。
[0089]產(chǎn)油:術(shù)語“產(chǎn)油”是指生物體積累占其細胞干重至少約20%的脂質(zhì)的能力。在本發(fā)明的某些實施例中，產(chǎn)油酵母或真菌可積累占其細胞干重至少約25%的脂質(zhì)。在其它實施例中，本發(fā)明的產(chǎn)油酵母或真菌可積累占其細胞干重在約20% -45%范圍內(nèi)的脂質(zhì)。在其它實施例中，產(chǎn)油生物體可積累占其細胞干重多達約70%的脂質(zhì)。在本發(fā)明的一些實施例中，產(chǎn)油生物體可積累占總脂質(zhì)積累極大分率的三?；视托问降闹|(zhì)。在某些實施例中，所積累的大部分脂質(zhì)都為三?；视偷男问?。另外或其它，所述脂質(zhì)可以胞內(nèi)脂質(zhì)體或油體的形式積累。在某些實施例中，本發(fā)明利用自然產(chǎn)油的酵母或真菌。在ー些方面，自然產(chǎn)油的生物體可經(jīng)處理(例如，以基因方式、化學方式或其它方式處理)從而進一步增加生物體中所積累的脂質(zhì)的水平。在其它實施例中，如本文所述對自然不產(chǎn)油的酵母或真菌進行處理(例如，以基因方式、化學方式或其它方式處理)以積累脂質(zhì)。出于本發(fā)明的目的，紅酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)(紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma))和產(chǎn)瓶假絲酵母(Candida utilis)為自然不產(chǎn)油的真菌。
[0090]多肽:如本文所使用的術(shù)語“多肽” 一般具有其在所屬領(lǐng)域中公認的含義，即具有至少三個氨基酸的聚合物。然而，本術(shù)語還用于指特殊功能種類的多肽，諸如產(chǎn)油多肽、產(chǎn)類胡蘿卜素多肽、類異戊二烯生物合成多肽、類胡蘿卜素生物合成多肽和類異戊二烯生物合成競爭劑多肽。就每一所述種類而言，本說明書都提供所述多肽的已知序列的若干實例。然而，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，預期術(shù)語“多肽”一般不僅足以涵蓋具有本文所述(或本文特別提及的參考文獻或數(shù)據(jù)庫中所述)的完整序列的多肽，而且還涵蓋表示所述完整多肽的功能片段(即，保留至少ー種活性的片段)的多肽。此外，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應了解，蛋白質(zhì)序列一般容許在不破壞活性的情況下存在某種取代。因此，如本文所使用的相關(guān)術(shù)語“多肽”涵蓋任何多肽，其保留活性且與相同種類的另ー多肽共有至少約30% -40%，通常大于約50 %、60 %、70 %或80 %的整體序列一致性，且另外通常包括至少ー個具有更高一致性(通常大于90%)的區(qū)域，或甚至在ー個或ー個以上高度保守的區(qū)域中具有95%、96%、97%、98%或99%的一致性(例如，異檸檬酸脫氫酶多肽通常共有保守AMP結(jié)合基序；HMG-CoA還原酶多肽通常包括高度保守的催化結(jié)構(gòu)域(例如參看圖7);こ酰輔酶A羧化酶通常具有羧基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域；例如參看Downing等人，Chem.Abs.93:484,1980 ；Gil等人，Cell41:249,1985 ;Jitrapakdee 等人 Curr Protein Pept Sc1.4:217, 2003 ;美國專利第5，349，126號，所述參考文獻中每一者都是以全文引用的方式并入本文中)，通常涵蓋至少3-4個且通常多達20個或更多個氨基酸。
[0091] 原始生物體(source organism):如本文所使用的術(shù)語“原始生物體”是指特定多肽序列可發(fā)現(xiàn)于自然界的生物體。因此，舉例來說，如果在宿主生物體中表達一種或一種以上異源多肽，那么將在自然界中表達所述多肽(和/或最初對其基因進行克隆)的生物體被稱為“原始生物體”。如果在宿主生物體中表達一種以上異源多肽，那么可利用一種或一種以上原始生物體來獨立選擇各異源多肽。應理解，自然含有相關(guān)多肽序列的任何生物體和所有生物體都可用作本發(fā)明的原始生物體。代表性原始生物體包括(例如)動物、哺乳動物、昆蟲、植物、真菌、酵母、藻類、細菌、藍藻、古細菌和原生動物原始生物體。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0092]圖1A-1D描述某些常見類胡蘿卜素。
[0093]圖2描述足量的乙酰輔酶A和NADPH如何在產(chǎn)油生物體的胞質(zhì)中積累從而允許產(chǎn)生顯著水平的胞質(zhì)脂質(zhì)。酶:1，丙酮酸脫羧酶；2，蘋果酸脫氫酶；3，蘋果酸酶；4，丙酮酸脫氫酶；5，檸檬酸合酶；6，ATP-檸檬酸裂解酶；7，檸檬酸/蘋果酸移位酶。
[0094]圖3A和3B描述通常在真核生物(包括真菌)中運作的甲羥戊酸類異戊二烯生物合成路徑。
[0095]圖4描述通常在細菌和植物質(zhì)體中運作的甲羥戊酸非依賴性類異戊二烯生物合成路徑(也稱為DXP路徑)。
[0096]圖5描述類異戊二烯生物合成路徑中的中間體和如何將其饋入其它生物分子(包括類胡蘿卜素和非類胡蘿卜素化合物，諸如固醇、類固醇和諸如維生素E或維生素K的維生素)的生物合成路徑中。
[0097]圖6A-6D描述各種類胡蘿卜素的生物合成路徑。圖6A突出描述產(chǎn)生各種環(huán)狀和無環(huán)葉黃素的分支路徑；圖6B繪示產(chǎn)生二環(huán)和單環(huán)類胡蘿卜素(包括蝦青素)的某些紅酵母(X.dendrorhous)路徑；圖6C繪示將β -胡蘿卜素轉(zhuǎn)化成多種其它類胡蘿卜素(包括蝦青素)中的任一種的互連路徑；圖60描述由鏈孢紅素合成環(huán)狀類胡蘿卜素和常見植物與藻類葉黃素的可能途徑。
[0098]圖7Α-7Ι繪示某些代表性真菌HMG-CoA還原酶多肽的比對。如所見，這些多肽在催化區(qū)內(nèi)具有極高一致性，且還具有復雜的跨膜結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的一些實施例中，這些跨膜結(jié)構(gòu)域被破壞或移除，使得(例如)極度活躍型式的多肽得以產(chǎn)生。
[0099]圖8A-8D描述例證中產(chǎn)生且詳細描述的質(zhì)粒的示意性代表圖。
【具體實施方式】
[0100]如上文所述，本發(fā)明涵蓋類胡蘿卜素可合乎需要地在產(chǎn)油酵母和真菌中產(chǎn)生這一發(fā)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明，通過處理宿主細胞來產(chǎn)生具有以下特性的菌株(即，菌株包括例如自然存在的菌株、先前已經(jīng)修飾的菌株等):(i)積累經(jīng)常為細胞質(zhì)油體形式且通常占細胞干重至少約20%的脂質(zhì)；且(ii)產(chǎn)生占細胞干重至少約1%且在一些實施例中為至少約3%-20%的水平的類胡蘿卜素。隨后，使用這些經(jīng)處理的宿主細胞產(chǎn)生類胡蘿卜素，從而能夠輕易地分離分配到脂質(zhì)體中的類胡蘿卜素。
[0101]一般說來，需要使本發(fā)明細胞中的產(chǎn)油能力與類胡蘿卜素產(chǎn)量平衡，使得能達成盡可能最低的所需產(chǎn)油水平，從而將能夠利用并且轉(zhuǎn)入產(chǎn)物生物合成中的實質(zhì)上所有的其它碳都轉(zhuǎn)入類胡蘿卜素生產(chǎn)路徑中。在本發(fā)明的一些實施例中，這一戰(zhàn)略涉及工程設(shè)計產(chǎn)油細胞；在其它實施例中，其涉及工程設(shè)計細胞以積累比細胞在缺乏此工程設(shè)計的情況下積累的脂質(zhì)水平高的脂質(zhì)，尤其細胞質(zhì)脂質(zhì)，即使經(jīng)工程設(shè)計的細胞可能無法達到如本文所定義的“產(chǎn)油”時也是如此。在其它實施例中，產(chǎn)油宿主細胞積累脂質(zhì)的程度實際上已降低，因此剩余的碳可用于類胡蘿卜素的生產(chǎn)中。
[0102]宿主細胞
[0103]所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將易于理解，存在自然產(chǎn)油或自然產(chǎn)生類胡蘿卜素的各種酵母和真菌菌株。所述菌株中的任一種都可用作本發(fā)明的宿主菌株，并且可經(jīng)工程設(shè)計或另外經(jīng)處理以產(chǎn)生本發(fā)明的產(chǎn)油、產(chǎn)類胡蘿卜素菌株?；蛘?，也可使用自然不產(chǎn)油也自然不產(chǎn)類胡蘿卜素的菌株。此外，甚至當特定菌株具有自然的產(chǎn)油或產(chǎn)生類胡蘿卜素的能力時，也可如本文所述對其自然能力進行調(diào)節(jié)，從而改變脂質(zhì)和/或類胡蘿卜素的產(chǎn)量。在某些實施例中，工程設(shè)計或處理菌株將導致對所產(chǎn)生的脂質(zhì)和/或類胡蘿卜素的類型的改變。舉例來說，菌株可自然產(chǎn)油和/或產(chǎn)類胡蘿卜素，然而，可對菌株進行工程設(shè)計或修飾，從而改變所積累的脂質(zhì)的類型或改變所產(chǎn)生的類胡蘿卜素的類型。
[0104]當選擇特定酵母或真菌菌株用于本發(fā)明中時，一般會需要選擇培養(yǎng)特性適于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的菌株。舉例來說，一般(但通常非必需)需要避免絲狀生物體，或?qū)ιL條件具有特別罕見或嚴苛要求的 生物體。然而，當應用允許利用絲狀生物體的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)條件時，可將這些絲狀生物體選作宿主細胞。在本發(fā)明的一些實施例中，當可視情況將宿主細胞直接調(diào)配成食品或飼料添加劑，或視需要調(diào)配成營養(yǎng)補充劑時，需要利用可食用生物體作為宿主細胞。為便于生產(chǎn)，本發(fā)明的一些實施例利用易于以基因方法處理、適于分子遺傳學(例如，尤其可經(jīng)已確立或可用載體有效轉(zhuǎn)化；視情況可例如連續(xù)并入和/或整合多個基因；和/或具有已知的基因序列等)、無復雜的生長要求(例如，對光的需求)、嗜溫(例如，優(yōu)選的生長溫度在約25°C _32°C的范圍內(nèi))、能夠吸收多種碳源和氮源和/或能夠生長到高細胞密度的宿主細胞。另外或其它，本發(fā)明的各個實施例將利用生長為單一細胞而非多細胞生物體(例如，菌絲體)的宿主細胞。
[0105]一般來說，當根據(jù)本發(fā)明需要利用自然產(chǎn)油的生物體時，任何可修飾且可培養(yǎng)的產(chǎn)油生物體都可使用。在本發(fā)明的某些實施例中，所使用的酵母或真菌屬包括(但不限于)布拉氏霉屬(Blakeslea)、假絲酵母屬(Candida)、隱球菌屬(Cryptococcus)、小克銀漢霉屬(Cunninghamella)、油脂酵母屬(Lipomyces)、被孢霉屬(Mortierella)、毛霉菌屬(Mucor)、須霉屬(Phycomyces)、腐霉屬(Pythium)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、紅酵母屬(Rhodotorula)、毛孢子菌屬(Trichosporon)和耶氏酵母屬(Yarrowia)。在某些特殊實施例中，所使用的生物體種類包括(但不限于)三孢布拉氏霉(Blakeslea trispora)、鐵紅假絲酵母(Candida pulcherrima)、C.revkauf1、熱帶假絲酵母(C.tropicalis)、彎曲隱球菌(Cryptococcus curvatus)、刺抱小克銀漢霉菌(Cunninghamella echinulata)、綺麗小克銀漢霉(C elegans)、高大毛霉(C.japonica)、斯達氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)、產(chǎn)油油脂酵母(L.1ipoferus)、高山被抱霉(Mortierella alpina)、深黃被孢霉(M.1sabellina)、拉曼被孢霉(M.ramanniana)、葡酒色被孢霉(M.vinacea)、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、布氏須霉(Phycomyces blakesleanus)、畸雌腐霉(Pythium irregulare)、圓紅冬抱酵母菌(Rhodosporidium toruloides)、粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)、瘦弱紅酵母(R.gracilis)、牧草紅酵母(R.graminis)、粘質(zhì)紅酵母(R.mucilaginosa)、R.pinicola、出芽短梗絲抱酵母(Trichosporon pullans)、皮膚毛抱子菌(T.cutaneum)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。
[0106]在這些自然產(chǎn)油的菌株中，一些菌株也可自然產(chǎn)生類胡蘿卜素而ー些菌株不能。在大多數(shù)情況下，自然存在的產(chǎn)類胡蘿卜素、產(chǎn)油酵母或真菌僅產(chǎn)生低水平的類胡蘿卜素(占細胞干重小于約0.05% )。有時會產(chǎn)生較高水平的P -胡蘿卜素，但一般不會觀察到高水平的其它類胡蘿卜素。
[0107]總的來說，可將自然產(chǎn)油但不產(chǎn)生類胡蘿卜素(例如，產(chǎn)生小于約0.05%細胞干重的類胡蘿卜素、不產(chǎn)生所關(guān)注的類胡蘿卜素)的任何生物體用作本發(fā)明的宿主細胞。在一些實施例中，生物體為來自諸如(但不限干)假絲酵母屬、隱球菌屬、小克銀漢霉屬、油脂酵母屬、被孢霉屬、腐霉屬、毛孢子屬和耶氏酵母屬等種屬的酵母或真菌；在一些實施例中，所述生物體屬于包括(但不限干)高山被孢霉和解脂耶氏酵母種類的生物體。
[0108]相比之下，本發(fā)明可將任何自然產(chǎn)油、產(chǎn)類胡蘿卜素的生物體用作宿主細胞。一般來說，本發(fā)明可用于增加流入自然產(chǎn)生類胡蘿卜素的生物體(尤其是除布拉氏霉屬和須霉屬外的生物體)中的類異戊二烯路徑中的碳，和/或?qū)a(chǎn)生ー種類胡蘿卜素(例如(6-胡蘿卜素)轉(zhuǎn)變成產(chǎn)生另ー種類胡蘿卜素(例如蝦青素)。根據(jù)本發(fā)明，引入ー種或ー種以上產(chǎn)類胡蘿卜素修飾(例如，増加ー種或ー種以上內(nèi)源性或異源性產(chǎn)類胡蘿卜素多肽的表達)可達成這些目標。
[0109]在本發(fā)明的某些實施例中，所利用的產(chǎn)油、產(chǎn)類胡蘿卜素生物體為例如屬于諸如(但不限干)布拉氏霉屬、毛霉菌屬、須霉屬、紅冬孢酵母屬和紅酵母屬等種屬的酵母或真菌；在一些實施例中，所述生物體屬于諸如卷枝毛霉和粘紅酵母的種類。
[0110]當需要將自然不產(chǎn)油的菌株用作本發(fā)明的宿主細胞時，不產(chǎn)油酵母或真菌屬包括(但不限于)曲霉屬(Aspergillus)、葡萄孢屬(Botrytis)、尾孢屬(Cercospora)、錸孢菌屬(Fusarium)(赤霉屬(Gibberella))、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、鏈孢霉屬(Neurospora)、青霉屬(Penicillium)、畢赤酵母屬(Pichia)(漢森氏酵母屬(Hansenula))、柄鎊菌屬(Puccinia)、酵母菌屬(Saccharomyces)、小核菌屬(Sclerotium)、木霉屬(Trichoderma)和紅酵母屬(Xanthophyllomyces)(法夫?qū)?Phaffia));在ー些實施例中，所述生物體的種類包括(但不限于)鉤巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(A.niger)、土曲霉(A.terreus)、灰葡萄抱菌(Botrytis cinerea)、煙草尾抱(Cercospora nicotianae)、藤倉祿抱霉(Fusarium fujikuroi)(玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae))、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces Iactis)、乳酸克魯維酵母(K.1actis)、粗糖鏈抱霉(Neurospora crassa)、巴斯得畢赤酵母(Pichia pastoris)、獨特鎊菌(Puccinia distincta)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、齊整小核菌(Sclerotium rolfsii)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和紅酵母(XanthophyI1mycesdendrorhous)(紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma))。[0111]應理解，如本文所使用的術(shù)語“不產(chǎn)油”涵蓋自然具有積累脂質(zhì)、尤其細胞質(zhì)脂質(zhì)的某種能力但未積累達到足以成為如本文所定義的“產(chǎn)油”的程度的菌株；和不會自然具有積累額外脂質(zhì)(例如膜外脂質(zhì))的任何能力的菌株。另外應理解，在本發(fā)明的一些實施例中，即使經(jīng)修飾細胞無法成為如本文所述的產(chǎn)油細胞，但其足以增加特定宿主細胞的自然產(chǎn)油水平。
[0112]與自然產(chǎn)油的生物體一樣，一些自然不產(chǎn)油的真菌自然產(chǎn)生類胡蘿卜素，而其它生物體則不能?？珊弦獾赜米鞅景l(fā)明的宿主細胞的不會自然產(chǎn)生類胡蘿卜素(例如，產(chǎn)生小于約0.05%細胞干重的類胡蘿卜素、不產(chǎn)生所關(guān)注的類胡蘿卜素)的自然不產(chǎn)油真菌屬包括(但不限于)曲霉屬、克魯維酵母屬、青霉菌屬、酵母菌屬和畢赤酵母屬；種類包括(但不限于)黑曲霉和釀酒酵母。不會自然產(chǎn)生類胡蘿卜素且可合意地用作本發(fā)明的宿主細胞的自然不產(chǎn)油真菌屬包括(但不限于)葡萄孢屬、尾孢屬、鐮孢菌屬(赤霉屬)、鏈孢霉屬、柄銹菌屬、小核菌屬、木霉屬和紅酵母屬(法夫?qū)?；種類包括(但不限于)紅酵母(紅法夫酵母)。
[0113]如上文所論述，可將多種生物體中的任一種用作本發(fā)明的宿主細胞。在本發(fā)明的某些實施例中，宿主細胞將為解脂耶氏酵母細胞。解脂耶氏酵母的優(yōu)勢例如包括遺傳學和分子生物學易處理、基因組序列的可用性(例如參看Sherman等人Nucleic AcidsRes.32 (Database issue):D315_8，2004)、對各種節(jié)省成本的生長條件的適合性和生長到高細胞密度的能力。此外，解脂耶氏酵母為自然產(chǎn)油生物體，因此可能需要比其它生物體所需的處理少的處理即可產(chǎn)生產(chǎn)油、產(chǎn)類胡蘿卜素的解脂耶氏酵母菌株。另外，已對解脂耶氏酵母取得豐富的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)經(jīng)驗。
[0114]釀酒酵母也特別因為其實驗易處理性和研究者已對所述生物體積累豐富經(jīng)驗而成為本發(fā)明的有用宿主細胞。盡管在高碳條件下培養(yǎng)酵母菌可能導致乙醇產(chǎn)量的增加，但這一般可通過方法和/或基因改變來處理。
[0115]其它有用的宿主包括實驗上易處理并且自然產(chǎn)類胡蘿卜素的紅酵母(紅法夫酵母)。紅酵母(紅法夫酵母)菌株可產(chǎn)生若干種類胡蘿卜素，包括蝦青素。
[0116]黑曲霉和高山被孢霉分別積累大量的檸檬酸和脂肪酸；高山被孢霉還可產(chǎn)油。
[0117]鏈孢霉屬或赤霉屬也極為有用。其自然不產(chǎn)油且傾向于產(chǎn)生極少量的類胡蘿卜素，因此可能需要根據(jù)本發(fā)明進行廣泛修飾。從實驗角度看，認為鏈孢霉屬和赤霉屬相對易于處理。這兩者都為絲狀真菌，因此，由于克服對所述菌株的利用是必需的，故工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)將成為一種挑戰(zhàn)。
[0118]卷枝毛霉為另一種可用的有用種類。盡管其分子遺傳學比一些其它的生物體不易理解，但由于其自然產(chǎn)生β_胡蘿卜素，故可能需要比其它可用種類少的修飾。
[0119]可對布拉氏霉進行分子遺傳學修飾，但可能需要大量嘗試。另外，由于例如可能需要將兩種交配型混合，故節(jié)省成本的發(fā)酵條件可為一項挑戰(zhàn)。須霉屬真菌也可能成為有可能引起發(fā)酵過程中的挑戰(zhàn)的原因，并且這些真菌還可能比若干種其它潛在的宿主生物體不易于處理。
[0120]所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應理解，對用于本發(fā)明中的特定宿主細胞的選擇還將影響(例如)對將要引入所述細胞的任何異源多肽所利用的表達序列的選擇，并且還會影響培養(yǎng)條件的各個方面等?，F(xiàn)已對本發(fā)明中所利用的不同宿主細胞的不同基因調(diào)控要求、蛋白質(zhì)靶向序列要求和培養(yǎng)要求有所了解(例如參看，關(guān)于耶氏酵母屬的Barth等人FEMSMicrobiol Rev.19:219,1997 ；Madzak 等人 JBiotechnol.109:63, 2004 ；例如參看，關(guān)于紅酵母屬的 Verdoes 等人 Appl Environ Microbiol69:3728-38, 2003 ；Visser 等人 FEMSYeast Res4:221-31,2003 ;Martinez 等人 Antonie Van Leeuwenhoek.73(2): 147-53,1998 ;Kim 等人 Appl Environ Microbiol.64 (5): 1947-9,1998 ;Wery 等人 Gene.184 (I):89-97,1997 ;例如參看，關(guān)于酵母菌屬的 Guthrie 和 Fink Methods in Emymologyl94:1-933，1991)。舉例來說，在某些方面，可有益地包括宿主細胞的靶向序列(或其密切相關(guān)的類似物)以指引異源蛋白質(zhì)亞細胞定位。因此，可將所述有用的靶向序列加到異源序列中以用于具活性的適當胞內(nèi)定位。在其它方面(例如，線粒體靶向序列的加入方面)，可去除異源靶向序列或使所選異源序列改變(例如，改變或移除原始生物體植物葉綠體靶向序列)。[0121]工程設(shè)計產(chǎn)油能力
[0122]所有活的生物體都合成脂質(zhì)以用于其膜和各種其它結(jié)構(gòu)中。然而，大部分生物體都不會積累超過其細胞干重約10%的總脂質(zhì)，且所述脂質(zhì)中的大部分一般會保留在細胞膜內(nèi)。
[0123]已進行大量生物化學工作來定義賦予微生物產(chǎn)油能力所必需的代謝酶(主要是出于工程設(shè)計單細胞油作為花生四烯酸和二十二碳六烯酸的エ業(yè)來源的目的；例如參看Ratledge Biochimie86:807，2004，所述文獻的全部內(nèi)容都是以引用的方式并入本文中)。盡管在本發(fā)明之前，這項生物化學工作相當引人注目，但尚無有關(guān)通過基因工程設(shè)計編碼關(guān)鍵代謝酶的基因已重新建立產(chǎn)油能力的報導。
[0124]應注意，當在碳過量和氮或其它養(yǎng)分有限的條件下生長時，產(chǎn)油生物體通常僅積累脂質(zhì)。在這些條件下，生物體易于耗盡有限的養(yǎng)分，但持續(xù)吸收碳源?！斑^量”的碳將被引入脂質(zhì)生物合成中，因此脂質(zhì)(通常為三酰基甘油)通常以團體的形式積累于胞質(zhì)中。
[0125]一般說來，普遍認為，為能夠產(chǎn)油，生物體需在胞質(zhì)中產(chǎn)生こ酰輔酶A和NADPH，隨后這兩種物質(zhì)可由脂肪酸合酶機器利用而產(chǎn)生脂質(zhì)。在至少ー些產(chǎn)油生物體中，こ酰輔酶A是通過催化以下反應的ATP-檸檬酸裂解酶的作用而產(chǎn)生于胞質(zhì)中:
[0126](I)檸檬酸 +CoA+ATP —こ酰-CoA+ 草酰こ酸 +ADP+Pit)
[0127]當然，為了使ATP-檸檬酸裂解酶在胞質(zhì)中產(chǎn)生適量的こ酰輔酶A，其必須首先具有可用的其底物檸檬酸庫。檸檬酸是通過三羧酸(TCA)循環(huán)而產(chǎn)生于所有真核細胞的線粒體中，且可通過檸檬酸/蘋果酸移位酶而移到胞質(zhì)中(以交換蘋果酸)。
[0128]在大多數(shù)產(chǎn)油生物體和一些不產(chǎn)油生物體中，在線粒體中作為TCA循環(huán)的部分運作的酶異檸檬酸脫氫酶具有強AMP依賴性。因此，當將線粒體中的AMP耗盡時，這種酶將失去活性。當異檸檬酸脫氫酶無活性吋，異檸檬酸會積累于線粒體中。隨后這ー經(jīng)積累的檸檬酸可能通過順烏頭酸酶的作用而與檸檬酸達到平衡。因此，在低AMP條件下，檸檬酸會積累于線粒體中。如上文所述，可輕易地將線粒體中的檸檬酸轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)中。
[0129]認為在產(chǎn)油生物體中起始導致細胞質(zhì)檸檬酸積累(且因此こ酰輔酶A積累)的級聯(lián)的AMP耗盡是因上文所提及的養(yǎng)分耗盡而發(fā)生。當使產(chǎn)油細胞在存在過量碳源的情況下而在限制氮或ー些其它養(yǎng)分的條件下生長時，將強烈誘導催化以下反應的AMP脫氨酶的活性:[0130](2) AMP—肌苷 5'-—磷酸+NH3。
[0131]這種酶活性的增加將耗盡胞質(zhì)與線粒體中的細胞AMP。普遍認為耗盡線粒體中的AMP會使AMP依賴性異檸檬酸脫氫酶失活，從而導致檸檬酸積累于線粒體中，且因此在胞質(zhì)中積累。這一系列事件以圖解描述于圖2中。
[0132]如上文所述，產(chǎn)油能力需要胞質(zhì)乙酰輔酶A與胞質(zhì)NADPH。認為在許多產(chǎn)油生物體中，適量的胞質(zhì)NAPDH是通過蘋果酸酶(圖2中的酶3)作用而提供。然而，一些產(chǎn)油生物體(例如，油脂酵母屬和一些假絲酵母屬)中似乎不具有蘋果酸酶，因此顯然其它酶可提供可比擬的活性，但預期專用的NADPH來源可能為脂肪酸合成所需(例如參看Wynn等人，Microbioll45:1911,1999 ； Rat I edge Adv.App 1.Microbiol.51:1, 2002,所述文獻各自是以全文引用的方式并入本文中)。
[0133]因此，根據(jù)本發(fā)明，可通過修飾胞質(zhì)乙酰輔酶A和/或NADPH產(chǎn)生中所涉及的一種或一種以上多肽的表達或活性來增強宿主生物體的產(chǎn)油能力。舉例來說，根據(jù)本發(fā)明修飾乙酰輔酶A羧化酶、丙酮酸脫羧酶、異檸檬酸脫氫酶、ATP-檸檬酸裂解酶、蘋果酸酶和AMP脫氨酶中一種或一種以上酶的表達或活性可增強產(chǎn)油能力。根據(jù)本發(fā)明可利用或獲得從而增強產(chǎn)油能力的不范性多肽包括(但不限于)那些分別提供于表1、表2、表3、表4、表5和表6中的乙酰輔酶A羧化酶、丙酮酸脫羧酶、異檸檬酸脫氫酶、ATP-檸檬酸裂解酶、蘋果酸酶和AMP脫氨酶多肽。
[0134]在本發(fā)明的一些實施例中，當使用產(chǎn)油宿主細胞時，與產(chǎn)油能力相關(guān)的酶和調(diào)控組分已處于適當位置，但可視需要(例如)通過改變一種或一種以上產(chǎn)油多肽的表達或活性和/或通過引入一種或一種以上異源產(chǎn)油多肽來進行修飾。在使用不產(chǎn)油宿主細胞的本發(fā)明的那些實施例中，一般 預期將引入至少一種或一種以上異源產(chǎn)油多肽。
[0135]本發(fā)明不僅涵蓋引入異源產(chǎn)油多肽，而且還涵蓋調(diào)節(jié)異源或內(nèi)源產(chǎn)油多肽的表達或活性水平，包括(例如)改變組成性或可誘導性表達模式。在本發(fā)明的一些實施例中，表達模式經(jīng)調(diào)節(jié)從而能夠無需在限制養(yǎng)分的條件下生長以誘導產(chǎn)油能力。舉例來說，可利用包含調(diào)控序列(例如，啟動子元件、終止子元件)的改變和/或加入的基因修飾，以賦予對表達模式的特定調(diào)控。所述基因修飾可與內(nèi)源基因組合利用(例如，用于調(diào)控內(nèi)源產(chǎn)油多肽)；或者，可包括所述基因修飾從而賦予對至少一種異源多肽(例如，產(chǎn)油多肽)表達的調(diào)控。舉例來說，包括(但不限于)TefUGpdl啟動子在內(nèi)的啟動子可與內(nèi)源基因和/或異源基因組合使用以用于修飾內(nèi)源產(chǎn)油多肽和/或異源產(chǎn)油多肽的表達模式。類似地，示范性終止子序列包括(但不限于)使用解脂耶氏酵母XPR2終止子序列。
[0136]在一些實施例中，將至少一種產(chǎn)油多肽引入宿主細胞中。在本發(fā)明的一些實施例中，將多種(例如兩種或兩種以上)不同的產(chǎn)油多肽引入相同的宿主細胞中。在一些實施例中，多種產(chǎn)油多肽含有來自相同原始生物體的多肽；在其它實施例中，多種多肽包括獨立地選自不同原始生物體的多肽。
[0137]根據(jù)本發(fā)明可引入宿主細胞中或在宿主細胞中進行修飾的各種產(chǎn)油多肽的代表性實例包括(但不限于)提供于表1-6中的那些多肽。如上文所述，預期這些多肽中至少一些(例如，蘋果酸酶和ATP-檸檬酸裂解酶)應合意地協(xié)調(diào)作用，且可能與一種或一種以上脂肪酸合酶組分一起作用，因此，在本發(fā)明的一些實施例中，將需要利用兩種或兩種以上來自相同原始生物體的產(chǎn)油多肽。[0138]總的說來，用于本發(fā)明中的產(chǎn)油多肽的原始生物體包括(但不限干)布拉氏霉、假絲酵母屬、隱球菌屬、小克銀漢霉屬、油脂酵母屬、被孢霉屬、毛霉菌屬、須霉屬、腐霉屬、紅冬孢酵母屬、紅酵母屬、毛孢子菌屬、耶氏酵母、曲霉、葡萄孢屬、尾孢屬、錸孢菌屬(赤霉屬)、克魯維酵母屬、鏈孢霉屬、青霉屬、畢赤酵母屬(漢森氏酵母屬)、柄銹菌屬、酵母菌屬、小核菌屬、木霉屬和紅酵母屬(法夫?qū)?。在一些實施例中，こ酰輔酶A羧化酶、ATP-檸檬酸裂解酶、蘋果酸酶和/或AMP脫氨酶多肽的原始物種包括(但不限干)鉤巢曲霉、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、藤倉錸孢霉、乳酸克魯維酵母、粗糙鏈孢霉、釀酒酵母、粟酒裂埴酵母(Schizosaccharomyces pombe)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)和解脂耶氏酵母；在ー些實施例中，丙酮酸脫羧酶或異檸檬酸脫氫酶多肽的原始物種包括(但不限干)粗糙鏈孢霉、紅酵母屬紅酵母(紅法夫酵母)、黑曲霉、釀酒酵母、卷枝毛霉、粘紅酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、高山被孢霉和解脂耶氏酵母。
[0139]工程設(shè)計類胡蘿卜素的產(chǎn)生
[0140]類胡蘿卜素是由類異戊二烯前體合成，所述前體中有一部分還涉及在類固醇和固醇的生產(chǎn)中。大部分常見類異戊二烯生物合成路徑(有時稱為“甲羥戊酸路徑”)大致描述于圖3中。如圖所示，こ酰輔酶A經(jīng)由羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)而轉(zhuǎn)化成甲羥戊酸。隨后將甲羥戊酸磷酸化且轉(zhuǎn)化成五碳化合物異戊烯基焦磷酸(IPP)。使IPP異構(gòu)化為二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)后，與額外的IPP分子進行的三個連續(xù)縮合反應將產(chǎn)生十碳分子香葉基焦磷酸(GPP)，隨后產(chǎn)生十五碳分子法尼基焦磷酸(FPP)且最終產(chǎn)生二十碳化合物香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)。
[0141]經(jīng)ー些生物體(尤其細菌)利用且有時稱為“甲羥戊酸非依賴性路徑”的可選類異戊二烯生物合成路徑描述于圖4中。這一路徑是由從丙酮酸和甘油醛-3-磷酸合成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(DOXP)起始。隨后DOXP經(jīng)由圖4中所示的一系列反應而轉(zhuǎn)化成IPP，其異構(gòu)化成為DMAPP且隨后經(jīng)由GPP和FPP而轉(zhuǎn)化成如圖3所示且如上文所論述的GGPP。
[0142]已對多種生物體中類異戊二烯生物合成中所涉及的各種蛋白質(zhì)進行鑒別并對其特性進行描述。此外，類異戊二烯生物合成路徑中的各個方面在真菌、細菌、植物和動物王國中始終保守。舉例來說，已對多種生物體和細胞中與圖3中所示的こ酰こ酰輔酶A硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA還原酶、甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶、IPP異構(gòu)酶、FPP合酶和GGPP合酶對應的多肽進行鑒別，并且將其從所述生物體和細胞中分離。多種所述多肽的代表性實例提供于表7-15中?？衫没颢@得ー種或ー種以上選自表7-15中任一表所提供的多肽的多肽以用于本發(fā)明的方法和組合物中。
[0143]根據(jù)本發(fā)明，可通過修飾類異戊二烯生物合成過程中所涉及的ー種或ー種以上蛋白質(zhì)的表達或活性來調(diào)節(jié)宿主生物體中類胡蘿卜素的產(chǎn)量。在一些實施例中，所述修飾涉及將ー種或ー種以上異源類異戊二烯生物合成多肽引入宿主細胞中；另外或其它，可對一種或ー種以上內(nèi)源或異源類異戊二烯生物合成多肽的表達或活性進行修飾?？紤]到類異戊二烯生物合成多肽組分的可觀保守性，預期異源類異戊二烯生物合成多肽甚至在顯著差異的生物體中通常也會起作用。此外，引入ー種以上異源類異戊二烯生物合成多肽應為合乎需要的，在許多情況中，來自不同原始生物體的多肽將一起起作用。在本發(fā)明的一些實施例中，將多種不同的異源類異戊二烯生物合成多肽引入相同的宿主細胞中。在一些實施例中，所述多種多肽僅含有來自相同原始生物體的多肽(例如，相同原始生物體的兩種或兩種以上序列或源自相同生物體的序列)；在其它實施例中，所述多種多肽包括獨立地選自來自不同原始生物體的多肽的多肽(例如，至少兩種獨立原始生物體的兩種或兩種以上序列，或源自至少兩種獨立原始生物體的序列)。[0144]在利用異源類異戊二烯生物合成多肽的本發(fā)明的一些實施例中，原始生物體包括(但不限干)布拉氏霉屬、假絲酵母屬、隱球菌屬、小克銀漢霉屬、油脂酵母屬、被孢霉屬、毛霉菌屬、須霉屬、腐霉屬、紅冬孢酵母屬、紅酵母屬、毛孢子菌屬、耶氏酵母、曲霉屬、葡萄孢屬、尾孢屬、錸孢菌屬(赤霉屬)、克魯維酵母屬、鏈孢霉屬、青霉屬、畢赤酵母屬(漢森氏酵母屬)、柄銹菌屬、酵母菌屬、裂殖酵母菌屬、小核菌屬、木霉屬、黑粉菌屬和紅酵母屬(法夫?qū)?的真菌。在某些實施例中，原始生物體屬于以下種類，包括(但不限干)新型隱球菌、藤倉錸孢霉、乳酸克魯維酵母、粗糙鏈孢霉、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、玉米黑粉菌和解脂耶氏酵母。[0145]如上文所述，類異戊二烯生物合成路徑中還涉及非類胡蘿卜素化合物的生產(chǎn)，諸如固醇、類固醇和維生素(諸如維生素E或維生素K)。因此對類異戊二烯生物合成路徑中的中間體起作用并且將其轉(zhuǎn)入非類胡蘿卜素化合物的生物合成中的蛋白質(zhì)為類胡蘿卜素生物合成的間接抑制劑(例如參看圖5，其說明將類異戊二烯中間體引導到其它生物合成路徑中的點)。因此，認為所述蛋白質(zhì)為類異戊二烯生物合成競爭劑多肽。預期降低所述類異戊二烯生物合成競爭劑多肽的水平或活性將使根據(jù)本發(fā)明的宿主細胞中類胡蘿卜素的產(chǎn)量增加。[0146]在本發(fā)明的一些實施例中，可降低或去除宿主細胞中內(nèi)源類異戊二烯生物合成競爭劑多肽的產(chǎn)量或活性。在一些實施例中，可通過用麥角固醇生物合成路徑中的小分子酶抑制劑處理宿主生物體來達成所述類異戊二烯生物合成競爭劑多肽活性的降低或去除。麥角固醇生物合成路徑中的酶例如包括角鯊烯合酶、角鯊烯環(huán)氧酶、2，3-氧代角鯊烯-羊毛固醇環(huán)化酶、細胞色素P450羊毛固醇14 a -脫甲基酶、C-14固醇還原酶、C_4固醇甲基氧化酶、SAM:C-24固醇甲基轉(zhuǎn)移酶、C-8固醇異構(gòu)酶、C-5固醇去飽和酶、C-22固醇去飽和酶和C-24固醇還原酶。認為這些酶中的每ー種都為類異戊二烯生物合成競爭劑多肽。還可認為這些酶的調(diào)控劑為類異戊二烯生物合成競爭劑多肽(例如，酵母蛋白SutUGenebank寄存編號 JC4374G1:2133159)和 Mot3 (Genebank 寄存編號 NP_013786G1:6323715))，其可具有或可不具有其它生物體中的同系物。[0147]在其它實施例中，可通過降低泛醌生物合成路徑的活性來達成類異戊二烯生物合成競爭劑多肽活性的降低或去除。泛醌生物合成中的約定步驟為由哺乳動物中的酪氨酸或苯丙氨酸或細菌中的分支酸形成對羥基苯甲酸(PHB)，隨后使PHB與異戊二烯前體縮合，導致異戊二烯基的加成。這一反應是由PHB-聚異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶催化。泛醌的類異戊二烯側(cè)鏈是由異戊二烯基二磷酸合酶確定。由PHB與十異戊二烯基二磷酸的縮合反應產(chǎn)生的3-十異戊二烯基-4-羥基苯甲酸將經(jīng)歷其它修飾(其包括羥基化、甲基化和脫羧)，以便形成泛醌(CoQlO)。因此，抑制導致法尼基焦磷酸成為擴展類異戊二烯的異戊二烯基二磷酸合酶或抑制PHB聚異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶可用于增加類胡蘿卜素生物合成中可用類異戊二烯的量。(異戊二烯基二磷酸合酶和PHB-聚異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶的實例分別描述于表29和30中)。[0148]已知的類異戊二烯生物合成競爭劑酶的小分子抑制劑包括(但不限于)薩拉哥酸(zaragosic acid)(包括其類似物,諸如 TAN1607A(Biochem Biophys Res Commun1996年2月 15 日，219 (2):515-520))、RPR107393 (3-羥基 _3-[4_(喹啉-6-基)苯基]-1-氮雜雙環(huán)[2-2-2]辛烷二鹽酸鹽 J Pharmacol Exp Ther.1997 年 5 月，281 (2):746-52)、ER-28448 (5- {N- [2- 丁烯基-3- (2-甲氧基苯基)]-N-甲基氨基} -1，1-亞戊基雙(膦酸)三鈉鹽 Journal of Lipid Research，第 41 卷，1136-1144，2000 年 7 月)、BMS-188494 (TheJournal of Clinical Pharmacology, 1998 ;38:1116-1121)、TAK-475(1-[2-[(3R，5S) -1-(3-こ酸氧基_2, 2- 二甲基丙基)-rJ-氣-1,2,3,5-四氧~2~氧代_5-(2, 3- 二甲氧基苯基)-4，1-苯并氮雜卓-3-基]こ?；鵠哌啶-4-こ酸；Eur J Pharmaco12003年4月11 日；466 (1-2):155-61)、丫]?-53601(伍)-2-[2-氟-2-(亞喹嚀環(huán)-3-基)こ氧基]-9H-咔唑單鹽酸鹽；Br J Pharmacol.2000年9月；131 (1):63-70)或抑制角鯊烯合酶的角鯊抑素I (squalestatin I)、抑制角S烯環(huán)氧酶的特比萘芬(terbinafine)、抑制細胞色素P450羊毛固醇14 a -脫甲基酶的各種唑類和抑制C-14固醇還原酶和C-8固醇異構(gòu)酶的芬普福(fenpropimorph)。在其它實施例中，可利用異源類異戍二烯生物合成競爭劑多肽(無論功能性或非功能性多肽；在ー些實施例中，可使用顯性陰性突變體)。 [0149]ー種可用于本發(fā)明中的特殊類異戊二烯生物合成競爭劑多肽為已從多種生物體中鑒別出來并予以表征的角鯊烯合酶；表16中包括角鯊烯合酶多肽序列的代表性實例。在利用角鯊烯合酶(或角鯊烯合酶的變體)的本發(fā)明的一些實施例中，原始生物體包括(但不限于)粗糙鏈孢霉、紅酵母(紅法夫酵母)、黑曲霉、釀酒酵母、卷枝毛霉、粘紅酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、高山被孢霉和解脂耶氏酵母。
[0150]類胡蘿卜素生物合成路徑從形成GGPP點處與類異戊二烯生物合成路徑分開。類胡蘿卜素生物合成中的約定步驟為通過由八氫番茄紅素合酶(通常稱為crtB，參看圖6)催化的兩個GGPP分子頭-頭縮合來形成八氫番茄紅素。經(jīng)ー系列各自使共軛雙鍵的數(shù)量增加2個的脫氫反應將八氫番茄紅素經(jīng)由鏈孢紅素轉(zhuǎn)化成番茄紅素。所述路徑可在產(chǎn)生番茄紅素之前和之后的多個點處分叉，因此可產(chǎn)生多種類胡蘿卜素。舉例來說，環(huán)化酶對番茄紅素起作用將產(chǎn)生Y-胡蘿卜素；而以去飽和酶對番茄紅素起作用將產(chǎn)生3，4_ 二脫氫番茄紅素。Y-胡蘿卜素是通過環(huán)化酶作用而轉(zhuǎn)化成(6-胡蘿卜素。(6-胡蘿卜素可經(jīng)加工成多種產(chǎn)物中的任ー種(例如參看圖6C)，包括蝦青素(經(jīng)由海膽酮、羥基海膽酮和芬尼黃質(zhì)(pnoenicoxanthinノ)。
[0151]根據(jù)本發(fā)明，可通過修飾類胡蘿卜素生物合成中所涉及的ー種或ー種以上蛋白質(zhì)的表達或活性來調(diào)節(jié)宿主生物體中類胡蘿卜素的產(chǎn)量。如所述，在一些實施例中，需要將自然產(chǎn)生ー種或ー種以上類胡蘿卜素的生物體用作宿主細胞。在ー些其它情況中，關(guān)注的焦點將為(例如)通過增加自然產(chǎn)生的類胡蘿卜素的合成中所涉及的ー種或ー種蛋白質(zhì)的水平和/或活性，和/或通過降低競爭性生物合成路徑中所涉及的ー種或ー種以上蛋白質(zhì)的水平或活性來増加所述類胡蘿卜素的產(chǎn)量。另外或其它，在一些實施例中，將需要產(chǎn)生ー種或ー種以上并非宿主細胞自然產(chǎn)生的類胡蘿卜素的產(chǎn)量。
[0152]根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，將需要將ー種或ー種以上異源產(chǎn)類胡蘿卜素多肽引入宿主細胞中。如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見，可使用多種異源多肽中的任ー種；例如將考慮選擇產(chǎn)量有待增強的特定類胡蘿卜素。本發(fā)明不僅涵蓋引入異源產(chǎn)類胡蘿卜素多肽，而且還涵蓋調(diào)節(jié)異源或內(nèi)源產(chǎn)類胡蘿卜素多肽的表達或活性，例如包括改變組成性或可誘導性表達模式。在本發(fā)明的一些實施例中，表達模式經(jīng)調(diào)節(jié)，從而能夠無需在限制養(yǎng)分的條件下生長以誘導產(chǎn)油能力。舉例來說，可利用包含調(diào)控序列(例如，啟動子元件、終止子元件)的改變和/或加入的基因修飾，以賦予對表達模式的特定調(diào)控。所述基因修飾可與內(nèi)源基因組合利用(例如，用于調(diào)控內(nèi)源產(chǎn)類胡蘿卜素多肽)；或者，可包括所述基因修飾從而賦予對至少ー種異源多肽(例如，產(chǎn)類胡蘿卜素多肽)的表達的調(diào)控。舉例來說，包括(但不限干)Tefl、Gpdl啟動子在內(nèi)的啟動子可與內(nèi)源基因和/或異源基因組合使用以用于修飾內(nèi)源產(chǎn)類胡蘿卜素多肽和/或異源產(chǎn)類胡蘿卜素多肽的表達模式。類似地，示范性終止子序列包括(但不限干)使用解脂耶氏酵母XPR2終止子序列。
[0153]如圖6和文獻中所述，類胡蘿卜素生物合成中所涉及的蛋白質(zhì)包括(但不限干)八氫番茄紅素合酶、八氫番茄紅素脫氫酶、番茄紅素環(huán)化酶、類胡蘿卜素酮酶、類胡蘿卜素羥化酶、蝦青素合酶(見于ー些原始生物體中的単一多功能酶，通常具有酮酶與羥化酶活性)、類胡蘿卜素e羥化酶、番茄紅素環(huán)化酶和e亞單位)、類胡蘿卜素葡糖基轉(zhuǎn)移酶和酰基輔酶A:二?；视王；D(zhuǎn)移酶。這些類胡蘿卜素生物合成多肽的代表性實例序列提供于表17-25中。
[0154]由于葉黃素的環(huán)狀端基上存在含氧官能團，故可將其與其它類胡蘿卜素相區(qū)別。舉例來說，葉黃素和玉米黃素在其每ー末端環(huán)結(jié)構(gòu)上都含有單ー羥基，而蝦青素在每ー末端環(huán)上都含有酮基與羥基。這ー特性使得葉黃素的極性比胡蘿卜素(諸如(6-胡蘿卜素和番茄紅素)的極性強，且因此使其在脂肪和脂質(zhì)中的溶解性顯著降低。已發(fā)現(xiàn)自然存在的葉黃素通常是呈末端羥基酯(即脂肪酸單酯和二酷)的形式。在某些種類的細菌中，其還作為糖苷存在。通過加入酷部分可極大地改變?nèi)~黃素的溶解性和可分散性，且已知酯化也可影響指定類胡蘿卜素的可吸收性和/或生物可用性。本發(fā)明的目的在于使積累于產(chǎn)油酵母的胞內(nèi)三酰基甘油酯部分 內(nèi)的特定葉黃素的量最大化，且達成這一目標的ー個機制為增加所積累的葉黃素產(chǎn)物的疏水性。ー種達成這ー目的的方式是對目標葉黃素化合物的脂肪?；鶈熙ズ?或二酯的產(chǎn)生進行工程設(shè)計。
[0155]多種酶可起到酯化類胡蘿卜素的作用。舉例來說，已在若干種細菌種類中鑒別出類胡蘿卜素葡糖基轉(zhuǎn)移酶(例如參看表24)。此外，在三?；视蜕锖铣傻淖詈蟛襟E中起作用的酰基輔酶A:二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT)和?；o酶A:單酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶(MGAT)很可能在葉黃素酯化反應中起到額外作用。代表性DGAT多肽展示于表25中。此外，其它酶可對類胡蘿卜素和具有類似結(jié)構(gòu)的分子(例如固醇)進行特異性修飾并且可用于修飾和酯生產(chǎn)中。
[0156]在本發(fā)明的一些實施例中，類胡蘿卜素生物合成多肽的潛在原始生物體包括(但不限于)自然產(chǎn)類胡蘿卜素的自然產(chǎn)油或不產(chǎn)油真菌屬。這些真菌屬包括(但不限干)葡萄孢屬、尾孢屬、錸孢菌屬(赤霉屬)、毛霉菌屬、鏈孢霉屬、須霉屬、柄銹菌屬、紅酵母屬、小核菌屬、木霉屬和紅酵母屬。示范性種類包括(但不限干)粗糙鏈孢霉、紅酵母(紅法夫酵母)、卷枝毛霉和粘紅酵母。當然，類胡蘿卜素是由多種不同的生物體產(chǎn)生，諸如植物、藻類、酵母、真菌、細菌、藍藻等。任何所述生物體都可為本發(fā)明的類胡蘿卜素生物合成多肽的原始生物體。
[0157]應理解，根據(jù)本發(fā)明對宿主細胞所作的特定產(chǎn)類胡蘿卜素修飾將受需要產(chǎn)生何種類胡蘿卜素影響。舉例來說，類異戊二烯生物合成多肽與大多數(shù)類胡蘿卜素的生產(chǎn)相關(guān)。類胡蘿卜素生物合成多肽也廣泛相關(guān)。酮酶尤其與角黃素的生產(chǎn)相關(guān)，而羥化酶與葉黃素和玉米黃素的生產(chǎn)相關(guān)。羥化酶與酮酶(或蝦青素合酶)尤其可用于生產(chǎn)蝦青素。
[0158]類胡蘿卜素的產(chǎn)生和分離
[0159]如上文所論述，脂質(zhì)體在產(chǎn)油生物體中的積累一般是通過在存在過量碳源和有限氮源的情況下生長相應生物體來誘導。先前已針對多種不同的產(chǎn)油生物體確立用于誘導所述積累的特定條件(例如參看Wolf (編)Nonconventional yeasts in biotechnology第 I卷，Springer-Verlag, Berlin, Germany,第 313-338 頁；Lipidsl8 (9):623,1983 ；IndianJ.Exp.Biol.35(3):313,1997 ；J.1nd.Microbiol.Biotechno1.30(I):75,2003 ；BioresourTechnol.95 (3):287, 2004，各所述文獻都是以全文引用的方式并入本文中)。
[0160]一般來說，在允許積累占細胞干重至少約20%的脂質(zhì)的條件下培育本發(fā)明的經(jīng)修飾宿主細胞將是合乎人意的。在其它實施例中，本發(fā)明的經(jīng)修飾宿主細胞是在允許積累占其細胞干重至少約 15% ,16% ,17% ,18% ,19%,20%,21%,22%,23%,24%,25%,30%,35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或甚至80%或更多脂質(zhì)的條件下生長。在某些實施例中，所利用的宿主細胞為自然產(chǎn)油且經(jīng)誘導以產(chǎn)生所需水平的脂質(zhì)的細胞。在其它實施例中，宿主細胞為自然產(chǎn)生脂質(zhì)但已經(jīng)工程設(shè)計以增加脂質(zhì)產(chǎn)量從而產(chǎn)生所需含量的脂質(zhì)且達成積累的細胞。
[0161]在一些實施例中，本發(fā)明的宿主細胞并非自然產(chǎn)油的細胞，但已經(jīng)工程設(shè)計以產(chǎn)生脂質(zhì)從而能獲得所需水平的脂質(zhì)產(chǎn)生。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，一般說來，有效誘導原始生物體中脂質(zhì)積累的生長條件也可能對于誘導已引入原始生物體的產(chǎn)油多肽的宿主細胞中脂質(zhì)的積累有用。當然，根據(jù)宿主細胞的特征，可能需要進行修飾，所述修飾是在所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。
[0162]所屬領(lǐng)域技術(shù)人員還應理解，一般需要確保本發(fā)明的經(jīng)修飾宿主細胞產(chǎn)生所需類胡蘿卜素是在與誘導產(chǎn)油能力從而使類胡蘿卜素積累于脂質(zhì)體中相關(guān)的適當時間時發(fā)生。在一些實施例中，需要誘導不會自然產(chǎn)生類胡蘿卜素的宿主細胞中產(chǎn)生類胡蘿卜素，從而產(chǎn)生可檢測水平的類胡蘿卜素。在某些方面，不會自然產(chǎn)生某種(某些)類胡蘿卜素的宿主細胞能夠產(chǎn)生其它類胡蘿卜素(例如，某些宿主細胞可自然產(chǎn)生(6-胡蘿卜素，但可能不會自然產(chǎn)生蝦青素)；在其它方面，所述宿主細胞不會自然產(chǎn)生任何類胡蘿卜素。在其它實施例中，將需要増加自然產(chǎn)生低水平類胡蘿卜素的宿主細胞中類胡蘿卜素的產(chǎn)量，從而使所述類胡蘿卜素的可檢測水平増加。在某些方面，自然產(chǎn)生類胡蘿卜素(例如，(6-胡蘿卜素)的宿主細胞還產(chǎn)生其它類胡蘿卜素(例如，蝦青素)；在其它方面，自然產(chǎn)生類胡蘿卜素(例如(6-胡蘿卜素)的細胞不產(chǎn)生其它類胡蘿卜素。
[0163]在本發(fā)明的某些實施例中，將需要積累占細胞干重大于至少約1%的水平的類胡蘿卜素(即，考慮所有所產(chǎn)生的類胡蘿卜素的總量)。在一些實施例中，積累于脂質(zhì)體中的總類胡蘿卜素將達到占其總細胞干重至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約11 %、至少約12%、至少約13 %、至少約14%、至少約15 %、至少約16 %、至少約17 %、至少約18 %、至少約19%、至少約20%或更高的水平。在本發(fā)明的某些實施例中，將需要實現(xiàn)占細胞干重大于至少約1%的脂質(zhì)體中類胡蘿卜素積累的總含量(即，考慮所有所產(chǎn)生的類胡蘿卜素的總量)。在一些實施例中，積累于脂質(zhì)體中的總類胡蘿卜素將達到占其總細胞干重至少約2%、至少約3 %、至少約4 %、至少約5 %、至少約6 %、至少約7 %、至少約8 %、至少約9 %、至少約10 %、至少約11 %、至少約12%、至少約13%、至少約14%、至少約15%、至少約16%、至少約17%、至少約18%、至少約19%、至少約20%或更高的水平。
[0164]已證實，細菌產(chǎn)類胡蘿卜素基因可轉(zhuǎn)移到其它生物體中，且因此尤其適用于本發(fā)明中(例如參看Miura等人,Appl.Environ.Microbiol.64: 1226,1998)。在其它實施例中，可能需要利用來自其它原始生物體的基因，諸如植物、藻類或微藻類；這些生物體將提供酮酶和羥化酶多肽的多個潛在來源。其它有用的原始生物體包括多肽的真菌、酵母、昆蟲、原生動物和哺乳動物來源。
[0165]在某些實施例中，卷枝毛霉多功能八氫番茄紅素合酶/番茄紅素環(huán)化酶和粗糙鏈孢霉八氫番茄紅素脫氫酶基因都可在解脂耶氏酵母中表達。隨后，粗糙鏈孢霉羥甲基戊二酰輔酶A還原酶的催化結(jié)構(gòu)域的過度表達，和/或用角鯊烯合酶抑制劑薩拉哥酸處理經(jīng)修飾的解脂耶氏酵母菌株將進一步增加類胡蘿卜素的產(chǎn)量。最后，編碼類胡蘿卜素羥化酶和類胡蘿卜素酮酶的副球菌(Paracoccus marcusii)基因?qū)⒃诮庵辖湍府a(chǎn)β-胡蘿卜素菌株中表達，且這一修飾將導致蝦青素的積累?？稍谀懿捎玫钠渌a(chǎn)油或不產(chǎn)油宿主生物體中使用利用相同的同源或功能類似的產(chǎn)類胡蘿卜素多肽進行的增強類胡蘿卜素生產(chǎn)的類似方法。
[0166]應注意，對于產(chǎn)生一種以上類胡蘿卜素的本發(fā)明的生物體來說，通過調(diào)節(jié)生長條件來調(diào)節(jié)所產(chǎn)生的個別類胡蘿卜素的相對量有時是可能的。舉例來說，據(jù)報導，控制培養(yǎng)期間培養(yǎng)物中的溶解氧濃度可調(diào)控某些類胡蘿卜素(例如β -胡蘿卜素、海膽酮、β -隱黃素、3-羥基海膽酮、asteiOidenone、角黃素、玉米黃素、金盞花紅素、金盞花黃素和蝦青素)的相對產(chǎn)量(例如參看Tsubokura等人的美國專利第6，825，002號，所述專利的完整內(nèi)容是以引用的方式并入本文中)。
[0167]尤其在針對蝦青素生產(chǎn)的本發(fā)明的實施例中，通常將需要利用一個或一個以上來自自然產(chǎn)蝦青素生物體的基因。但當擬表達多種異源多肽時，可能需要利用相同的原始生物體或利用密切相關(guān)的原始生物體。
[0168]本發(fā)明所提供的一個優(yōu)勢在于，除允許產(chǎn)生高水平的類胡蘿卜素外，由于所產(chǎn)生的化合物積累于產(chǎn)油生物體內(nèi)的脂質(zhì)體中，故本發(fā)明還使這些所產(chǎn)生的化合物易于分離。已于多種產(chǎn)油生物體中確立分離脂質(zhì)體的方法和系統(tǒng)(例如參看美國專利第5，164，308號、第 5, 374, 657 號、第 5, 422, 247 號、第 5, 550, 156 號、第 5, 583, 019 號、第 6, 166, 231 號、第6，541，049號、第6，727，373號、第6，750，048號和第6，812，001號，所述專利中每一者都是以全文引用的方式并入本文中)。簡單來說，經(jīng)常通過噴霧干燥、過濾或離心從培養(yǎng)物中回收細胞。在一些情況下，將細胞均質(zhì)化且隨后使其經(jīng)歷超臨界液體萃取或溶劑萃取(例如，用諸如氯仿、己烷、二氯甲烷、甲醇、異丙醇、乙酸乙酯等溶劑)，得到粗油性懸浮液。如所屬領(lǐng)域所知，可視情況將所述油性懸浮液加以精制。經(jīng)精制的油狀物可直接用作飼料或食品添加劑。另外或其它，可使用常規(guī)技術(shù)從油狀物中分離出類胡蘿卜素。
[0169]考慮到類胡蘿卜素一般對氧化反應敏感，故本發(fā)明的許多實施例中都在類胡蘿卜素分離過程中和/或分離之后使用氧化穩(wěn)定劑(例如，生育酚、維生素C、促長啉(ethoxyquin)、維生素E、BHT、BHA、TBHQ等或其組合)。另外或其它,可使用例如以蛋白質(zhì)微膠囊化以增加氧化的實體障壁和/或改進處理(例如參看美國專利申請案2004/0191365)。[0170]用途
[0171]根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的類胡蘿卜素可用于多種應用中的任ー種中，例如開發(fā)其生物或營養(yǎng)特性(例如，抗氧化劑、抗增生等)和/或其色素特性。舉例來說，根據(jù)本發(fā)明，類胡蘿
卜素可用于藥物(例如參看，Bertram, Nutr.Rev.57:182,1999 ；Singh 等人，0ncologyl2:1643,1998 ；Rock, Pharmacol.Ther.75:185,1997 ；Edge 等人，J.Photochem Photobiol41:189,1997 ;美國專利申請案2004/0116514 ;美國專利申請案2004/0259959)、食品補充劑(例如參看，Koyama 等人，J.Photochem Photobiol9:265,1991 ；Bauernfeind, Carotenoidsas colorants and vitamin A precursors, Academic Press, NY, 1981 ;美國專利申請案2004/0115309 ;美國專利申請案2004/0234579)、電光應用、動物飼料添加劑(例如參看，Krinski, Pure Appl.Chem.66: 1003,1994 ；Polazza 等人，Meth.Enzymol.213:403,1992)、化妝品(作為抗氧化劑和/或作為化妝品，包括芳香劑；例如參看美國專利申請案2004/0127554)等中。根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的類胡蘿卜素還可用作制備其它化合物(例如類固醇等)的中間體。
[0172]舉例來說，蝦青素和/或其酷可用于多種醫(yī)藥應用和健康食品中，包括治療發(fā)炎性疾病、哮喘、異位性皮炎、敏感癥、多發(fā)性骨髓瘤、動脈硬化癥、心血管疾病、肝病、腦血管疾病、血栓癥、血管生成相關(guān)疾病(包括癌癥、風濕病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、黃斑變性和腦部病癥)、高脂質(zhì)血癥、腎缺血、糖尿病、高血壓、腫瘤增生和轉(zhuǎn)移和代謝病癥。此外,類胡蘿卜素和蝦青素可用于預防和治療疲勞、改善由發(fā)炎性疾病引起的腎病的腎功能并且預防和治療其它與生活習慣相關(guān)的疾病。另外，已發(fā)現(xiàn)蝦青素作為各個生物學過程的抑制劑的作用，包括白細胞介素抑制劑、磷酸二酯酶抑制劑、磷酸酯酶A2抑制劑、環(huán)氧化酶-2抑制劑、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑、毛細管內(nèi)皮細胞增生抑制劑、脂肪氧化酶抑制劑。例如參看，20060126公開的日本公開案第2006022121號(20051017申請的JP申請案第2005-301156號)、20060119公開的日本公開案第2006016408號(20051017申請的JP申請案第2005-301155號)、20060119公開的日本公開案第2006016409號(20051017申請的JP申請案第2005-301157號)、20060119公開的日本公開案第2006016407號(20051017申請的JP申請案第2005-301153號),20060112公開的日本公開案第2006008717號(20051017申請的JP申請案第2005-301151號)、20060112公開的日本公開案第2006008716號(20051017申請的JP申請案第2005-301150號),20060112公開的日本公開案第2006008720號(20051017申請的JP申請案第2005-301158號)、20060112公開的日本公開案第2006008719號(20051017申請的JP申請案第2005-301154號)、20060112公開的日本公開案第2006008718號(20051017申請的JP申請案第2005-301152號)、20060112公開的日本公開案第2006008713號(20051017申請的JP申請案第2005-301147號)、20060112公開的日本公開案第2006008715號(20051017申請的JP申請案第2005-301149號),20060112公開的日本公開案第2006008714號(20051017申請的JP申請案第2005-301148號)、20060112公開的日本公開案第2006008712號(20051017申請的JP申請案第2005-301146號)。
[0173]應理解，在本發(fā)明的一些實施例中，將由如本文所述的經(jīng)處理宿主細胞產(chǎn)生的類胡蘿卜素并入上下文中的宿主細胞的終產(chǎn)物(例如，食品或飼料補充劑、藥物、化妝品、含染料物品等)中。舉例來說，可將宿主細胞凍干、冷凍干燥、冷凍或以其它方式滅活，且隨后可將全細胞并入終產(chǎn)物中或用作終產(chǎn)物。也可在并入所述產(chǎn)物中之前對宿主細胞進行處理(例如經(jīng)由溶解)以增加生物可用性。另外或其它，終產(chǎn)物中可僅并入一部分從全細胞中分離的宿主細胞(例如，按尺寸、溶解性分離)。舉例來說，在本發(fā)明ー些實施例中，將脂質(zhì)小滴從宿主細胞中分離，并且將其并入終產(chǎn)物中或用作終產(chǎn)物。在其它實施例中，分離類胡蘿卜素本身或個別類胡蘿卜素化合物并且將其再調(diào)配成終產(chǎn)物。
[0174]如上文所述，脂肪酸和糖苷酯為自然界中可見的主要類胡蘿卜素酷，但可合成其它酯(例如，用有機酸或無機磷酸)以產(chǎn)生有用的產(chǎn)物形式。對于傳遞而言，也可將類胡蘿
卜素酯調(diào)配成酯鹽的形式(例如參看，美國專利公開案第20050096477號)。
[0175]并入指定產(chǎn)物中的類胡蘿卜素的量可視產(chǎn)物和所涉及的特定類胡蘿卜素而顯著變化。劑量可例如在小于0.01重量％到大于I重量％、10重量％、20重量％、30重量％或更多產(chǎn)物的范圍內(nèi)；在一些情況下，所述類胡蘿卜素可包含100%產(chǎn)物。
[0176]在本發(fā)明的一些實施例中，將ー種或ー種以上所產(chǎn)生的類胡蘿卜素并入食品或飼料(例如，食品補充劑)組分中。根據(jù)本發(fā)明，對可并入類胡蘿卜素的食品的類型并未特別限制，且其包括飲料，諸如茶、果汁和酒；甜食，諸如果子凍和餅干；含脂肪食品和飲料，諸如奶制品；加工食品，諸如米和軟米(或粥)；嬰兒配方等。在本發(fā)明這一方面的一些實施例中，由于類胡蘿卜素可促進并入某些含脂肪食品中，故在可食用脂質(zhì)體內(nèi)并入所述類胡蘿卜素可為有益的。
[0177]可并入本發(fā)明所產(chǎn)生的類胡蘿卜素的飼料的實例(例如)包括寵物食品，諸如貓食、狗食等；觀賞魚、養(yǎng)殖魚或甲殼動物等的飼料；農(nóng)場動物(包括家畜且另外包括水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中喂養(yǎng)的魚或甲殼動物)的飼料。可并入本發(fā)明所產(chǎn)生的類胡蘿卜素的食品或飼料物質(zhì)優(yōu)選可合乎作為預定接受者的生物體的口味。這ー食品或飼料物質(zhì)可具有當前對食品物質(zhì)已知的任何物理特性(例如，固體、液體、軟)。
[0178]在本發(fā)明的一些實施例中，可將ー種或ー種以上所產(chǎn)生的類胡蘿卜素并入化妝品中。所述化妝品的實例(例如)包括護膚品`(例如，洗液、乳液、面霜等)、唇膏、防曬化妝品、化妝品、香水、日用品(例如，牙膏、漱ロ水、防口臭試劑、固體肥皂、液體肥皂、洗發(fā)精、護理液)等。
[0179]在一些實施例中，將ー種或ー種以上所產(chǎn)生的類胡蘿卜素并入藥物中。所述藥物的實例(例如)包括各類片劑、膠囊、飲用劑、錠劑、漱ロ劑等。在一些實施例中，所述藥物適于局部應用。并未對劑型作特別限制，且其包括膠囊、油、顆粒劑、濃縮細粒(granulasubtilae)、凍干粉(pulveres)、片劑、丸劑、錠劑等。由于油和充油膠囊在制造過程中無成分分解，且由于易于將本發(fā)明的含類胡蘿卜素脂質(zhì)小滴并入油基調(diào)配物中，故其可提供額外優(yōu)勢。
[0180]可根據(jù)所屬領(lǐng)域中已確立的技術(shù)(例如包括如美國藥典(United StatesPharmacopoeia)中所述的常用程序)制備本發(fā)明的藥物。
[0181]可將根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的類胡蘿卜素并入任何含色素的產(chǎn)品(例如包括織物、油漆等)中。還可將其并入作為環(huán)境指示劑的產(chǎn)品中，或用作檢測劑的諸如生物感應器的儀器中。
[0182]例證:
[0183]下表26描述以下例證中所使用的解脂耶氏酵母菌株:
[0184]表26:解脂耶氏酵母菌株
【權(quán)利要求】
1.一種重組耶氏酵母屬(Yarrowia)真菌,其特征在于: a.所述真菌因可以積累占其細胞干重至少約20%的脂質(zhì)而為產(chǎn)油真菌；且 b.所述耶氏酵母屬真菌產(chǎn)生至少一種類胡蘿卜素，并且其可積累占其細胞干重至少約I %的所產(chǎn)生的類胡蘿卜素； 其中所述真菌包含至少一種產(chǎn)類胡蘿卜素修飾，且其中所述至少一種產(chǎn)類胡蘿卜素修飾賦予所述真菌產(chǎn)生占其細胞干重至少約I%的水平的所述至少一種類胡蘿卜素的能力，或賦予所述真菌產(chǎn)生至少一種所述真菌不會自然產(chǎn)生的類胡蘿卜素的能力， 其中所述至少一種產(chǎn)類胡蘿卜素修飾增加或降低產(chǎn)類胡蘿卜素多肽的表達或活性，所述產(chǎn)類胡蘿卜素多肽選自由以下多肽組成的群組:類異戊二烯生物合成多肽、類胡蘿卜素生物合成多肽、類異戊二烯生物合成競爭劑多肽和其組合，且其中: (i)所述類異戊二烯生物合成多肽選自由以下組成的群組=HMG-CoA還原酶多肽和GGPP合酶多肽；和/或 (?)所述類胡蘿卜素生物合成多肽選自由以下組成的群組:類胡蘿卜素酮酶多肽和類胡蘿卜素羥化酶多肽；和/或 (iii)所述類異戊二烯生物合成競爭劑多肽是角鯊烯合酶多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耶氏酵母屬真菌，其中所述耶氏酵母屬真菌為解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要 求1所述的耶氏酵母屬真菌，其中所述真菌含有至少一種產(chǎn)油修飾。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的耶氏酵母屬真菌，其中所述至少一種產(chǎn)油修飾改變所述真菌的產(chǎn)油能力。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的耶氏酵母屬真菌，其中所述至少一種產(chǎn)油修飾增加至少一種產(chǎn)油多肽的表達或活性。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的耶氏酵母屬真菌，其中所述至少一種產(chǎn)油修飾降低至少一種產(chǎn)油多肽的表達或活性。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的耶氏酵母屬真菌，其中所述至少一種產(chǎn)油修飾增加至少一種產(chǎn)油多肽的表達或活性，并且降低至少一種其它產(chǎn)油多肽的表達或活性。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的耶氏酵母屬真菌，其中所述至少一種產(chǎn)油多肽選自由以下多肽組成的群組:乙酰輔酶A羧化酶多肽、丙酮酸脫羧酶多肽、異檸檬酸脫氫酶多肽、ATP-檸檬酸裂解酶多肽、蘋果酸酶多肽、AMP脫氨酶多肽和其組合。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的耶氏酵母屬真菌，其中所述至少一種產(chǎn)油多肽為至少一種選自由表1到表6中任一表中的多肽組成的群組的多肽。
10.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的耶氏酵母屬真菌，其中所述至少一種產(chǎn)油修飾包含在所述真菌中表達至少一種異源產(chǎn)油多肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的耶氏酵母屬真菌，其中所述至少一種產(chǎn)油修飾包含表達至少一種編碼所述至少一種異源產(chǎn)油多肽的異源基因。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的耶氏酵母屬真菌，其中所述至少一種異源產(chǎn)油多肽包含至少兩種異源產(chǎn)油多肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的耶氏酵母屬真菌，其中所述至少兩種異源產(chǎn)油多肽是來自單一原始生物體。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的耶氏酵母屬真菌，其中所述至少兩種異源產(chǎn)油多肽是來自至少兩種不同的原始生物體。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耶氏酵母屬真菌，其中所述至少ー種產(chǎn)類胡蘿卜素修飾賦予所述真菌產(chǎn)生占其細胞干重至少約I%的水平的所述至少ー種類胡蘿卜素的能力。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耶氏酵母屬真菌，其中所述至少ー種產(chǎn)類胡蘿卜素修飾賦予所述真菌產(chǎn)生至少ー種所述真菌不會自然產(chǎn)生的類胡蘿卜素的能力。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耶氏酵母屬真菌，其中所述真菌另外包含至少ー種產(chǎn)油修飾，其中所述產(chǎn)油修飾改變所述真菌的產(chǎn)油能力或賦予所述真菌產(chǎn)油能力。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耶氏酵母屬真菌，其中所述至少ー種類胡蘿卜素選自由蝦青素、(6-胡蘿卜素、角黃素、玉米黃素、葉黃素、番茄紅素和其組合組成的群組。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耶氏酵母屬真菌，其中所述至少ー種類胡蘿卜素主要為蝦青素。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耶氏酵母屬真菌，其中所述至少ー種產(chǎn)類胡蘿卜素修飾增加至少ー種產(chǎn)類胡蘿卜素多肽的表達或活性并且降低至少ー種其它產(chǎn)類胡蘿卜素多肽的表達或活性。
21.根據(jù)權(quán)利要求1或20所述的耶氏酵母屬真菌，其中所述至少ー種產(chǎn)類胡蘿卜素修飾包含表達至少ー種異源產(chǎn)類胡蘿卜素多肽。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的耶氏酵母屬真菌，其中所述至少ー種產(chǎn)類胡蘿卜素修飾包含表達至少一種編碼所述至少ー種異源產(chǎn)類胡蘿卜素多肽的異源基因。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所·述的耶氏酵母屬真菌，其中所述至少ー種異源產(chǎn)類胡蘿卜素多肽包含至少兩種異源產(chǎn)類胡蘿卜素多肽。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的耶氏酵母屬真菌，其中所述至少兩種異源產(chǎn)類胡蘿卜素多肽是來自單ー原始生物體。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的耶氏酵母屬真菌，其中所述至少兩種異源產(chǎn)類胡蘿卜素多肽是來自至少兩種不同的原始生物體。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-7和15-20中任ー權(quán)利要求所述的耶氏酵母屬真菌，其特征在于所述真菌積累細胞質(zhì)體形式的脂質(zhì)。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的耶氏酵母屬真菌，其中所述至少ー種類胡蘿卜素積累于所述細胞質(zhì)油體中。
28.—種解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)菌株,其包含ー種或ー種以上產(chǎn)類胡蘿卜素修飾，使得所述菌株積累占其細胞干重1%到10%的至少ー種類胡蘿卜素，其中所述解脂耶氏酵母菌株包含選自由表達以下異源多肽的修飾組成的群組的產(chǎn)類胡蘿卜素修飾:HMG-CoA還原酶多肽、GGPP合酶多肽、類胡蘿卜素酮酶多肽、類胡蘿卜素羥化酶多肽和角鯊烯合酶多肽。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的菌株，其另ー特征在于，其積累占其細胞干重20%到50%的脂質(zhì)。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的菌株，其中所述菌株積累占其細胞干重20%到50%的細胞質(zhì)油體形式的脂質(zhì)。
31.根據(jù)權(quán)利要求28至30中任ー權(quán)利要求所述的菌株，其中所述菌株積累占其細胞干重-1o%的e-胡蘿卜素。
32.根據(jù)權(quán)利要求28至30中任ー權(quán)利要求所述的菌株，其中所述菌株積累占其細胞干重1% -10%的蝦青素或葉黃素。
33.一種產(chǎn)生類胡蘿卜素的方法，所述方法包含以下步驟: a.在允許產(chǎn)生所述類胡蘿卜素的條件下，培養(yǎng)前述權(quán)利要求中任ー權(quán)利要求所述的耶氏酵母屬真菌； b.和分離所述所產(chǎn)生的類胡蘿卜素。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述分離步驟包含分離培養(yǎng)基以獲得至少ー個富含類胡蘿卜素的部分。
35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中:所述培養(yǎng)步驟包含在允許將所述類胡蘿卜素積累于細胞質(zhì)油體中的條件下培養(yǎng)所述耶氏酵母屬真菌，且所述分離步驟包含分離從所述細胞質(zhì)油體得到的油。
36.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述類胡蘿卜素選自由以下物質(zhì)組成的群組:蝦青素、(6-胡蘿卜素、角黃素、玉米黃素、葉黃素、番茄紅素和其組合。
37.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述類胡蘿卜素包含蝦青素。
38.一種制備含有類胡蘿卜素的食品或飼料添加劑的方法，所述方法包含以下步驟: a.在允許產(chǎn)生所述類胡蘿卜素的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求1至32中任ー權(quán)利要求所述的耶氏酵母屬真菌；· b.分離所述類胡蘿卜素；和 c.將所述經(jīng)分離的類胡蘿卜素與ー種或ー種以上其它食品或飼料添加劑組分組合。
【文檔編號】C12N15/80GK103589650SQ201310334980
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2006年3月20日 優(yōu)先權(quán)日:2005年3月18日
【發(fā)明者】理查德·貝利, 凱文·T·馬登, 喬舒亞·特魯哈特 申請人:米克羅比亞公司