一株高產(chǎn)克拉維酸的棒狀鏈霉菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株高產(chǎn)克拉維酸的棒狀鏈霉菌及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的高產(chǎn)克拉維酸的棒狀鏈霉菌具體為棒狀鏈霉菌(Streptomyces?clavuligerus)16CF10,它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC?No.7915。本發(fā)明以棒狀鏈霉菌(Streptomyces?clavuligerus)70116為出發(fā)菌株,對其進(jìn)行代謝工程改造,誘變后得到棒狀鏈霉菌(Streptomyces?clavuligerus)16CF10?CGMCC?No.7915。實驗證明,發(fā)酵培養(yǎng)該菌株,其產(chǎn)克拉維酸的量達(dá)到2.25g/L發(fā)酵液,較出發(fā)菌株棒狀鏈霉菌(Streptomyces?clavuligerus)70116提高了約51%,可見棒狀鏈霉菌(Streptomyces?clavuligerus)16CF10?CGMCC?No.7915具有廣闊工業(yè)應(yīng)用的前景。
【專利說明】一株高產(chǎn)克拉維酸的棒狀鏈霉菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域,涉及一株高產(chǎn)克拉維酸的棒狀鏈霉菌及其應(yīng)用?!颈尘凹夹g(shù)】
[0002]隨著抗生素的大量使用,病原菌耐藥性問題日益嚴(yán)重。青霉素、頭孢菌素等β -內(nèi)酰胺類抗生素的濫用導(dǎo)致部分病原菌產(chǎn)生β_內(nèi)酰胺酶,從而降解該類抗生素產(chǎn)生耐藥性。克拉維酸(clavulanic acid),又稱棒酸,是棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物??死S酸單獨作用時抗菌活性很弱,但它具有獨特的3R,5R立體構(gòu)像,使其具有光譜的、不可逆的β_內(nèi)酰酶抑制活性,也是第一個被發(fā)現(xiàn)并成功應(yīng)用于臨床的β_內(nèi)酰胺酶抑制劑。臨床應(yīng)用中,克拉維酸常與β_內(nèi)酰胺類抗生素如阿莫西林(311101;[(^11;[11)、替卡西林(1:;^31^;[11;[11)聯(lián)合用藥,制成酶抑制劑-抗生素的聯(lián)合制劑,可在不同程度上保護(hù)β-內(nèi)酰胺類抗生素不被β-內(nèi)酰胺酶分解失活,從而提高該抗生素對產(chǎn)酶耐藥菌的抗菌活性,提高臨床療效。由于其重要的臨床應(yīng)用價值,克拉維酸的市場需求廣大。目前克拉維酸的工業(yè)生產(chǎn)主要依靠微生物發(fā)酵。因此,改造克拉維酸產(chǎn)生菌獲得高產(chǎn)工程菌具有重要的工業(yè)應(yīng)用價值。
[0003]野生型棒狀鏈霉菌的克拉維酸產(chǎn)量很低,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足工業(yè)發(fā)酵的需要,所以目前工業(yè)應(yīng)用的菌株往往都是通過多輪物理、化學(xué)等誘變篩選得到的誘變株。隨著對克拉維酸生物合成基礎(chǔ)研究的深入,多種理性代謝工程改造手段成功的提高了野生菌株的克拉維酸產(chǎn)量,但還是無法超越工業(yè)上廣泛應(yīng)用的誘變菌株。因此,以工業(yè)應(yīng)用的誘變菌株作為出發(fā)菌株,通過代謝工程改造的手段提高其克拉維酸產(chǎn)量具有重要的實際應(yīng)用價值。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的是提供一株高產(chǎn)克拉維酸的棒狀鏈霉菌及其應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明所提供的棒狀鏈霉菌具體為棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)16CF10。該菌株是以棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)70116為出發(fā)菌株,對其進(jìn)行代謝工程改造,誘變后得到的新菌株。該菌株已于2013年07月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC,地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號,中國科學(xué)院微生物研究所),保藏登記號為CGMCC N0.7915。
[0006]本發(fā)明的再一個目的是提供一種菌劑。
[0007]本發(fā)明所提供的菌劑的活性成分為所述棒狀鏈霉菌(Streptomycesclavuligerus) 16CF10 CGMCC N0.7915。
[0008]所述棒狀鏈霉菌(Streptomycesclavuligerus)16CF10 CGMCC N0.7915或所述菌劑在制備克拉維酸中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0009]本發(fā)明的還一個目的是提供一種制備克拉維酸的方法。
[0010]本發(fā)明所提供的制備克拉維酸的方法,可包括如下步驟:發(fā)酵培養(yǎng)所述棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10 CGMCC N0.7915,收集發(fā)酵產(chǎn)物,獲得克拉維酸。[0011]在上述方法中,所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基)的組成如下:黃豆粉20±2g/L,糊精 10±lg/L,甘油 15±lmL/L,KH2PO40.6 ± 0.lg/L,3-(N-嗎啡啉)丙磺酸(MOPS) 8±lg/L,微量元素溶液1±0.2mL/L,余量為水;pH為7.0±0.2 ;所述微量元素中,溶劑為水,溶質(zhì)及其濃度如下=FeSO4.7H201.0±0.2g/L,MnCl2.4H201.0±0.2g/L,ZnSO4.7Η201.0±0.2g/L, CaCl2.3Η201.3±0.2g/L。
[0012]在本發(fā)明中,所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基)的組成具體如下:黃豆粉20g/L,糊精 10g/L,甘油 15mL/L, KH2PO40.6g/L,3_(N_ 嗎啡啉)丙磺酸(MOPS) 8g/L,微量元素溶液lmL/L,余量為水;pH為7.0±0.2 ;所述微量元素中,溶劑為水,溶質(zhì)及其濃度如下:FeSO4.7Η201.0g/L, MnCl2.4Η201.0g/L, ZnSO4.7Η201.0g/L, CaCl2.3Η201.3g/L。
[0013]在上述方法中,在發(fā)酵培養(yǎng)前,還包括利用種子培養(yǎng)基培養(yǎng)所述棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10 CGMCC N0.7915 獲得種子液的步驟,再將所述種子液接種到上述發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
[0014]所述種子培養(yǎng)基與所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成完全相同。
[0015]所述“利用種子培養(yǎng)基培養(yǎng)所述棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)16CF10 CGMCC N0.7915”,培養(yǎng)溫度為28°C,培養(yǎng)時間為48h,培養(yǎng)方式為旋轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速為250rpm,旋轉(zhuǎn)半徑與NBS Excella E25型號搖床的旋轉(zhuǎn)半徑相同)。
[0016]在上述方法中,所述發(fā)酵培養(yǎng)可為搖瓶發(fā)酵培養(yǎng);所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)時間為48-96h (如72h);所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為28°C ;所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的震蕩轉(zhuǎn)速為200-300rpm,如250rpm,(旋轉(zhuǎn)半徑與NBS Excella E25型號搖床的旋轉(zhuǎn)半徑相同)。
[0017]在本發(fā)明的一個實施例中,進(jìn)行所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)時,所用搖床的型號為NBSExcella E25。
[0018]在上述方法中,所述發(fā)酵培養(yǎng)也可為發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng);所述發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)時間為6-7天(如6天);所述發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為28°C ;所述發(fā)酵培養(yǎng)過程中的通氣量為0.5-1.0V / V.min,如0.5V / V.min (所述通氣量以每分鐘內(nèi)通過單位體積培養(yǎng)液的空氣體積比來表示);所述發(fā)酵培養(yǎng)過程中的攪拌轉(zhuǎn)速為300-500rpm,如400rpm。
[0019]在本發(fā)明的一個實施例中,進(jìn)行所述發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)時,所用發(fā)酵罐的型號為NBSBioFlo/CelliGen 115。
[0020]本發(fā)明的又一個目的是提供所述菌劑的制備方法。
[0021]所述菌劑的制備方法,具體可包括如下步驟:將所述棒狀鏈霉菌(Streptomycesclavuligerus) 16CF10 CGMCC N0.7915作為活性成分,得到所述菌劑。
[0022]本發(fā)明以棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 70116為出發(fā)菌株,對其進(jìn)行代謝工程改造,誘變后得到棒狀鏈霉菌(Sti^ptomyces clavuligerus) 16CF10 CGMCCN0.7915。發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)該菌株144h (6天),發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)克拉維酸的量達(dá)到2.25g/L發(fā)酵液,較出發(fā)菌株棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 70116提高了約51%,該菌株具有廣闊工業(yè)應(yīng)用的前景。
[0023]保藏說明
[0024]菌種名稱:棒狀鏈霉菌
[0025]拉丁名:(Streptomycesclavuligerus)
[0026]菌株編號:16CF10[0027]保藏機(jī)構(gòu):中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0028]保藏機(jī)構(gòu)簡稱:CGMCC
[0029]地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號
[0030]保藏日期:2013年07月12日
[0031]保藏中心登記入冊編號:CGMCC N0.7915
【專利附圖】
【附圖說明】
[0032]圖1 為搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10 CGMCCN0.7915發(fā)酵72h后發(fā)酵液中克拉維酸產(chǎn)量的測定結(jié)果。以發(fā)酵液中克拉維酸色譜峰的峰面積表示。
[0033]圖2 為棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10 CGMCC N0.7915 菌株發(fā)酵液和克拉維酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高效液相色譜圖。其中,I表示棒狀鏈霉菌(Streptomycesclavuligerus) 16CF10 CGMCC N0.7915菌株發(fā)酵液;2表示克拉維酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
[0034]圖3為發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)過程中不同時間點取樣的發(fā)酵液中克拉維酸產(chǎn)量及棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10 CGMCC N0.7915 的生長情況測定結(jié)果。其中,A表示出發(fā)菌株棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 70116發(fā)酵液中克拉維酸色譜峰的峰面積;B表不棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10 CGMCCN0.7915發(fā)酵液中克拉維酸色譜峰的峰面積;C表示出發(fā)菌株棒狀鏈霉菌(Streptomycesclavuligerus) 70116利用二苯胺法測定生物量的光吸收值(A595)山表示棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)16CF10 CGMCC N0.7915 利用二苯胺法測定生物量的光吸收值(A595)。
【具體實施方式】
[0035]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明,均為常規(guī)方法。
[0036]下述實施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業(yè)途徑得到。
[0037]棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 70116:為“李佳.1.報告基因法篩選克拉維酸高產(chǎn)菌2.報告基因法比較兩種放線菌啟動子的活性.首都師范大學(xué),碩士論文,2009”一文中記載的“棒狀鏈霉菌(Sti^ptomyces clavuligerus)工業(yè)菌株70116”,為海正藥業(yè)贈送。
[0038]克拉維酸標(biāo)準(zhǔn)品=Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品,其產(chǎn)品目錄號為33454。
[0039]實施例1、棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10的獲得及鑒定
[0040]一、棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10 的獲得
[0041]利用組成型表達(dá)的紅霉素啟動子(ermE*p)通過整合型載體對靶基因glpFl和ceas2在工業(yè)菌株棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)70116中分別進(jìn)行過表達(dá),研究其對克拉維酸產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明這些靶基因的單獨過表達(dá)都有利于工業(yè)菌株中克拉維酸產(chǎn)量的提高。
[0042]接著,本發(fā)明的發(fā)明人構(gòu)建同時監(jiān)測雙靶點表達(dá)的報告質(zhì)粒,將靶基因glpFl與ceas2兩兩組合后構(gòu)建載體導(dǎo)入工業(yè)菌株棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)70116。接著通過NTG誘變后篩選報告基因同時高表達(dá)的誘變株,得到其中一株重組菌,將其命名為菌株16CF10。
[0043]二、棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10 的鑒定
[0044]從以下幾個方面鑒定步驟一得到的菌株16CF10:
[0045]1、形態(tài)學(xué)特征鑒定[0046]接種YD固體培養(yǎng)基,培養(yǎng)過程中觀察形態(tài)變化。3天左右長出基內(nèi)菌絲,5-7天產(chǎn)生白色氣生菌絲,10-14天產(chǎn)生灰綠色孢子。
[0047]2、生理生化特性分析
[0048]革蘭氏陽性細(xì)菌。
[0049]3、RpoD基因和gap I基因序列同源性分析
[0050]對菌株16CF10的rpoD基因和gapl基因進(jìn)行序列測定,其RpoD基因的測序結(jié)果為序列表中序列1,其gapl基因的測序結(jié)果為序列表中序列2。同時對出發(fā)菌株棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 70116 的 rpoD 基因和 gapl 基因序列進(jìn)行測序。
[0051]在線BLAST比對的結(jié)果表明,菌株16CF10的rpoD基因和gapl基因的序列與出發(fā)菌株棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 70116的rpoD基因和gapl基因序列同源性為100%,同時與NCBI上公開的野生型棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) ATCC27064 菌株的 rpoD 基因(GenBank:ADWJ01000053.1)和 gapl 基因(GenBank:DQ178995.1)序列同源性也為100%。
[0052]鑒于上述形態(tài)、生理生化特征分析和rpoD和gapl基因序列同源性分析結(jié)果,將步驟一得到的菌株16CF10鑒定為棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)。該菌株已于2013年07月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJi址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號),保藏編號為CGMCC N0.7915。
[0053]實施例2、發(fā)酵棒狀鏈霉菌(Streptomycesclavuligerus)16CF10 CGMCC N0.7915生產(chǎn)克拉維酸
[0054]固體YD培養(yǎng)基:溶劑為水,溶質(zhì)及其濃度如下:酵母提取物(Difco公司產(chǎn)品)
4.0g/L ;麥芽糖提取物(0XID 公司產(chǎn)品)10g/L ;葡萄糖 4.0g/L ;MgCl2 2.0g/L ;CaCl2 1.5g/L;瓊脂 2.0g/L ;pH7.50
[0055]種子培養(yǎng)基(與發(fā)酵培養(yǎng)基相同):黃豆粉20g/L ;糊精(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品,其產(chǎn)品目錄號為69009992)10g/L ;甘油15mL/L ;KH2PO4 0.6g/L ;3-(N-嗎啡啉)丙磺酸(MOPS)8.0g/L ;微量元素lmL/L ;pH7.0±0.2。各濃度為相應(yīng)組分在培養(yǎng)基中的終濃度。其中,微量元素配方如下(100ml) =FeSO4.7H20 IOOmg ;MnCl2.4H20 IOOmg ;ZnSO4.7H20IOOmg ;CaCl2.3H20 130mg ;余量為水。
[0056]一、搖瓶培養(yǎng)棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10 CGMCC N0.7915生產(chǎn)克拉維酸
[0057]1、種子液培養(yǎng)
[0058]將實施例1 得到的棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10 CGMCCN0.7915接種到固體YD培養(yǎng)基上,于28°C培養(yǎng)7天后收集孢子接種到種子培養(yǎng)基中,250rpm (搖床型號NBS Excella E25),28°C培養(yǎng)48h后得到種子液。同時設(shè)置出發(fā)菌株棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 70116 作為對照。
[0059]2、搖瓶培養(yǎng)[0060]將步驟I得到的種子液接種到搖瓶(250mL搖瓶中含50mL發(fā)酵培養(yǎng)基)中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),接種量為5% (體積分?jǐn)?shù))。
[0061]發(fā)酵條件:溫度28°C,旋轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng),轉(zhuǎn)速250rpm (搖床型號NBS Excella E25),發(fā)酵72h。
[0062]發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液中克拉維酸產(chǎn)量。實驗重復(fù)三次,結(jié)果取平均值。
[0063]3、測定方法
[0064]采用高效液相色譜法測定發(fā)酵液中克拉維酸的產(chǎn)量,具體如下:
[0065]A.色譜條件
[0066]色譜條件:色譜柱為反相C18柱;流動相為6% (體積百分含量)甲醇+94% (體積百分含量)0.1M磷酸二氫鈉水溶液(冰醋酸調(diào)節(jié)pH3.68);洗脫程序為等度洗脫;流速為Iml/min ;進(jìn)樣體積為50 μ L ;檢測波長為312nm。
[0067]B.待測發(fā)酵液中克拉維酸含量的測定
[0068]發(fā)酵樣品衍生處理:配置咪唑試劑(咪唑試劑:溶解8.25g咪唑到65ml水中,用5M鹽酸調(diào)PH到6.8±0.05后,用水增容至100ml ),待測發(fā)酵液與等體積咪唑試劑混合后,37°C反應(yīng)30min后HPLC分析克拉維酸產(chǎn)量。
[0069]將經(jīng)過如上處理的待測發(fā)酵液按照步驟A所述的色譜條件進(jìn)行高效液相色譜分析,以濃度確定的克拉維
【權(quán)利要求】
1.棒狀鏈霉菌(Streptomycesclavuligerus) 16CF10,它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC N0.7915。
2.一種菌劑,其特征在于:所述菌劑的活性成分為權(quán)利要求1所述的棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10 CGMCC N0.7915。
3.權(quán)利要求1 所述的棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10 CGMCCN0.7915或權(quán)利要求2所述的菌劑在制備克拉維酸中的應(yīng)用。
4.一種制備克拉維酸的方法,包括如下步驟:發(fā)酵培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10 CGMCC N0.7915,收集發(fā)酵產(chǎn)物,獲得克拉維酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基的組成如下:黃豆粉 20±2g/L,糊精 10±lg/L,甘油 15±lmL/L,KH2PO40.6±0.lg/L,3-(N-嗎啡啉)丙磺酸(MOPS) 8±lg/L,微量元素溶液 1±0.2mL/L,余量為水;pH 為 7.0±0.2 ; 所述微量元素溶液,溶劑為水,溶質(zhì)及其濃度如下=FeSO4.7H201.0±0.2g/L,MnCl2.4Η201.0±0.2g/L, ZnSO4.7Η201.0±0.2g/L, CaCl2.3Η201.3±0.2g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法,其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)為搖瓶發(fā)酵培養(yǎng);所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)時間為48-96h ;所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為28°C ;所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的震蕩轉(zhuǎn)速為200-300rpm。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法,其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)為發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng);所述發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)時間為6-7天;所述發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為28°C ;所述發(fā)酵培養(yǎng)過程中的通氣量為0.5-1.0V / V.π?η;所述發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)的攪拌轉(zhuǎn)速為300_500rpm。
8.權(quán)利要求2所述菌劑的制備方法,包括如下步驟:將權(quán)利要求1所述的棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus) 16CF10 CGMCC N0.7915 作為活性成分,得到所述菌劑。
【文檔編號】C12P17/18GK103468607SQ201310363352
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年8月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月20日
【發(fā)明者】楊克遷, 趙友寶, 向四海 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所