一種常見(jiàn)鱘魚(yú)類(lèi)的pcr-rflp快速檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和分類(lèi)學(xué)領(lǐng)域，本發(fā)明公開(kāi)了一種常見(jiàn)鱘魚(yú)類(lèi)的PCR-RFLP快速檢測(cè)方法以及用于所述快速檢測(cè)方法的引物對(duì)和試劑盒，所述常見(jiàn)鱘魚(yú)類(lèi)的PCR-RFLP快速檢測(cè)方法包括以下步驟：步驟一，提取待檢測(cè)樣品的基因組DNA作為模板；步驟二，以所述基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)獲得PCR產(chǎn)物；步驟三，用限制性?xún)?nèi)切酶酶切所述PCR產(chǎn)物，獲得酶切產(chǎn)物；步驟四，將所述PCR產(chǎn)物和所述酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)電泳圖進(jìn)行物種鑒定。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，在保證魚(yú)種存活基礎(chǔ)上只需剪取少量鰭條或肌肉，快速準(zhǔn)確的進(jìn)行常見(jiàn)鱘魚(yú)類(lèi)魚(yú)種的鑒別，增加了鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度，極大提高了工作效率。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種常見(jiàn)鱘魚(yú)類(lèi)的PCR-RFLP快速檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和分類(lèi)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種常見(jiàn)鱘魚(yú)類(lèi)的PCR-RFLP快速檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鱘魚(yú)(sturgeon)隸屬于硬骨魚(yú)綱(Osteichthyes)、福鰭亞綱(Actinopterygii)、硬鱗總目(Ganoidomorpha)、鱘形目(Acipenseriformes),現(xiàn)在全世界共有2科6屬27種。我國(guó)境內(nèi)有2科3屬8種，分別為施氏鱘(Acipenser schrenckii )、達(dá)氏魚(yú)皇(Huso dauricus)、中華鱘(Acipenser sinensis)、達(dá)氏魚(yú)皇(Acipenser dabryanus)、白鱘(Psephurus gladius)、西伯利亞鱘(Acipenser baerii)、小體鱘(Acipenser ruthenus)、裸腹鱘(Acipenser nudiventris),鱘魚(yú)是一類(lèi)古老的軟骨硬鱗魚(yú),有“活化石”之稱(chēng)。這些古老的鱘魚(yú)類(lèi)均處于不同程度的瀕危狀態(tài)，甚至有的有滅絕的危險(xiǎn)。鱘魚(yú)卵營(yíng)養(yǎng)豐富，以其卵加工制成的鱘魚(yú)籽醬，價(jià)格昂貴，是國(guó)際公認(rèn)的奢侈食材，被比作“黑色黃金”。
[0003]目前國(guó)際上進(jìn)行鱘魚(yú)種類(lèi)鑒定主要采用的方法包括形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和遺傳學(xué)等方法。Congiu等使用AFLP分子標(biāo)記方法進(jìn)行了鱘魚(yú)及魚(yú)籽醬產(chǎn)品的鑒別應(yīng)用,Chelomina等使用RAPD分子標(biāo)記進(jìn)行施氏鱘自然種群中雜交種鑒別分析。以線粒體為材料來(lái)研究鱘魚(yú)類(lèi)進(jìn)化關(guān)系的研究報(bào)道相對(duì)也較多。主要集中在線粒體D-1oop序列部分、細(xì)胞色素B、12s rRNA、16s rRNA等基因。對(duì)線粒體DNA控制區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)，多個(gè)種的鱘魚(yú)線粒體DNA均存在異質(zhì)現(xiàn)象。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外常用線粒體DNA控制區(qū)序列以及微衛(wèi)星DNA標(biāo)記開(kāi)展鱘魚(yú)的分子鑒定。這些技術(shù)手段盡管能夠不同程度的對(duì)鱘魚(yú)和鱘魚(yú)產(chǎn)品進(jìn)行相對(duì)精確的鑒定，但是，也存在技術(shù)操作繁瑣、鑒定時(shí)間長(zhǎng)、設(shè)備昂貴等缺點(diǎn)，且對(duì)操作人員技術(shù)要求較高。
[0004]鑒于此，亟須開(kāi) 發(fā)出能夠快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出常見(jiàn)鱘魚(yú)的分子檢測(cè)技術(shù)，用于市場(chǎng)監(jiān)管、種質(zhì)鑒定等用途。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的之一在于提供一種常見(jiàn)鱘魚(yú)類(lèi)的PCR-RFLP快速檢測(cè)方法。本發(fā)明運(yùn)用了較少的試劑以及方便快捷容易操作的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，可以在較短時(shí)間內(nèi)，在不處死魚(yú)種的基礎(chǔ)上，只需剪取少量鰭條或肌肉，快速準(zhǔn)確的將小體鱘和達(dá)氏鰉從所述常見(jiàn)鱘魚(yú)類(lèi)中區(qū)分出來(lái)。
[0006]一種常見(jiàn)鱘魚(yú)類(lèi)的PCR-RFLP快速檢測(cè)用試劑盒，其特征在于，包括:
[0007]引物對(duì)；
[0008]PCR 常規(guī)試劑:Taq DNA 聚合酶、10 X buffer PCR 緩沖液、MgCl2 和 dNTPs ；
[0009]以及酶切試劑=IOXbuffer酶切緩沖液、100 X BSA、限制性?xún)?nèi)切酶Aval I和限制性?xún)?nèi)切酶Eagl-HF。
[0010]優(yōu)選的是，所述引物對(duì)為:
[0011]上游引物，其為SEQ ID N0.1所示的多核苷酸序列；[0012]下游引物，其為SEQ ID N0.2所示的多核苷酸序列。
[0013]一種常見(jiàn)鱘魚(yú)類(lèi)的PCR-RFLP快速檢測(cè)方法，其特征在于，使用權(quán)利要求2所述試劑盒用于常見(jiàn)鱘魚(yú)類(lèi)的PCR-RFLP快速檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0014]步驟一，提取待檢測(cè)樣品的基因組DNA作為模板；
[0015]步驟二，將所述基因組DNA使用所述試劑盒包含的試劑和所述引物對(duì)配制成PCR體系，配制成的PCR體系放入PCR擴(kuò)增儀中將進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)完成之后，將PCR產(chǎn)物放入4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0016]步驟三，用限制性?xún)?nèi)切酶酶切所述PCR產(chǎn)物，獲得酶切產(chǎn)物；
[0017]步驟四，將所述PCR產(chǎn)物和所述酶切產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳圖進(jìn)行物種鑒定。
[0018]優(yōu)選的是，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系為15 μ 1:即為在200 μ I PCR反應(yīng)管中加入 0.1 μ I 濃度為 2，500units/mL 的 Taq DNA 聚合酶，1.5 μ IlOXbufferPCR 緩沖液，
1.5 μ 125mM MgCl2,1.2 μ I 濃度為 IOpm/ μ I 的 dNTPs, 2 μ I 所述基因組 DNA, 0.5 μ I 濃度為lOpm/μ I的所述上游引物，0.5μ I濃度為IOpm/μ I的所述下游引物和7.7 μ I無(wú)菌水。
[0019]優(yōu)選的是，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，然后94°C變性30s、58°C退火30s、72°C延伸45s，從預(yù)熱、退火到延伸共反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，然后72°C延伸lOmin。
[0020]優(yōu)選的是，反應(yīng)體系一為在200μ I PCR反應(yīng)管中加入Iyg所述PCR產(chǎn)物，2 μ IlOXbuffer酶切緩沖液，0.2 μ 1100XBSA和0.5 μ I限制性?xún)?nèi)切酶Avail，加無(wú)菌水至20 μ 1，然后將所述酶切反應(yīng)體系在`37°C溫育反應(yīng)lh，65°C熱失活20min ；
[0021]反應(yīng)體系二為在200 μ I PCR反應(yīng)管中加入I μ g所述PCR產(chǎn)物，2μ IlOXbuffer酶切緩沖液，0.2 μ 1100 XBSA和0.5μ I限制性?xún)?nèi)切酶Eagl-HF，加無(wú)菌水至20 μ 1，然后將所述酶切反應(yīng)體系在37°C溫育反應(yīng)15min，65°C熱失活20min。
[0022]優(yōu)選的是，所述常見(jiàn)鱘魚(yú)種類(lèi)為中華鱘、施氏鱘、西伯利亞鱘、小體鱘、達(dá)氏鰉、歐煌、閃光鱘和俄羅斯鱘。
[0023]優(yōu)選的是，區(qū)分小體鱘或達(dá)氏鰉與中華鱘、施氏鱘、西伯利亞鱘、歐煌、閃光鱘或俄羅斯鱘中任一種。
[0024]優(yōu)選的是，采用所述Avail限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行所述酶切反應(yīng)后可將小體鱘和達(dá)氏鰉從所述常見(jiàn)鱘魚(yú)類(lèi)中區(qū)分出來(lái)，再采用所述Eagl-HF限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行所述酶切反應(yīng)可將小體鱘與達(dá)氏鰉區(qū)分開(kāi)。
[0025]優(yōu)選的是，所述限制性?xún)?nèi)切酶Aval I的酶切位點(diǎn)為中華鱘、施氏鱘、西伯利亞鱘、歐煌、閃光鱘或俄羅斯鱘所述PCR產(chǎn)物中多核苷酸序列5'的第196和197個(gè)堿基之間的磷酸二酯鍵，小體鱘和達(dá)氏鰉沒(méi)有所述酶切位點(diǎn)；在區(qū)分小體鱘和達(dá)氏鰉的基礎(chǔ)上，所述的限制性?xún)?nèi)切酶Eagl-HF酶切位點(diǎn)為中華鱘、施氏鱘、西伯利亞鱘、歐煌、閃光鱘、俄羅斯鱘和達(dá)氏鰉所述PCR產(chǎn)物中多核苷酸序列5'的第522和523個(gè)堿基之間的磷酸二酯鍵，小體鱘沒(méi)有所述酶切位點(diǎn)；中華鱘、施氏鱘、西伯利亞鱘、小體鱘、達(dá)氏鰉、歐煌、閃光鱘和俄羅斯鱘所述PCR產(chǎn)物中擴(kuò)增多核苷酸序列分別為SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ IDN0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9 和 SEQ ID N0.10 所示序列。
[0026]本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明方法根據(jù)小體鱘或達(dá)氏鰉與中華鱘、施氏鱘、西伯利亞鱘、歐煌、閃光鱘或俄羅斯鱘線粒體DNA之間存在的位點(diǎn)差異，通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)和酶切的檢測(cè)方法對(duì)小體鱘或達(dá)氏鰉與中華鱘、施氏鱘、西伯利亞鱘、歐煌、閃光鱘或俄羅斯鱘進(jìn)行鑒別。本發(fā)明方法只需提取待檢測(cè)樣本的基因組DNA，所述引物對(duì)即可特異性的結(jié)合線粒體DNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。本發(fā)明運(yùn)用了較少的試劑以及方便快捷容易操作的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，可以在較短時(shí)間內(nèi)，在不處死魚(yú)種的基礎(chǔ)上，只需剪取少量鰭條或肌肉，快速準(zhǔn)確的鑒別出魚(yú)種。本發(fā)明有利于實(shí)際生產(chǎn)部門(mén)，科研部門(mén)快速鑒定所取樣本，增加了鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度，極大提高了工作效率。
[0027]本發(fā)明所涉及到的術(shù)語(yǔ)定義
[0028]除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。雖然在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中可使用與本文所述者類(lèi)似或等效的任何方法、裝置和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法、裝置和材料。
[0029]術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸(DNA)、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸(RNA)及其聚合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語(yǔ)涵蓋含有天然核苷酸的已知類(lèi)似物的核酸，所述類(lèi)似物具有類(lèi)似于參考核酸的結(jié)合特性并以類(lèi)似于天然產(chǎn)生的核苷酸的方式進(jìn)行代謝。除非另外特定限制，否則所述術(shù)語(yǔ)也意指寡核苷酸類(lèi)似物，其包括PNA (肽核酸)、在反義技術(shù)中所用的DNA類(lèi)似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限于)簡(jiǎn)并密碼子取代)和互補(bǔ)序列以及明確指定的序列。
[0030]術(shù)語(yǔ)“PCR”意指聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction),簡(jiǎn)稱(chēng)PCR。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火(復(fù)性)及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)等 特點(diǎn)。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究，還可用于疾病的診斷或任何有DNA、RNA的地方.聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,簡(jiǎn)稱(chēng)PCR)又稱(chēng)無(wú)細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。
[0031]術(shù)語(yǔ)“PCR-RFLP檢測(cè)方法”意指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)_限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè)方法，是一種采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增目的DNA片段，然后將待檢測(cè)的DNA片段用限制性?xún)?nèi)切酶酶切，限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別并切割特異的序列，然后將酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，再由限制酶圖譜(restriction map)分析此段序列的特異酶切位點(diǎn),藉由片段的多樣性來(lái)比對(duì)不同來(lái)源基因序列的差異性。
[0032]術(shù)語(yǔ)“引物”意指一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn)，除非特定限制，否則所述術(shù)語(yǔ)涵蓋自然中生物的DNA復(fù)制和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中人工合成的引物(通常為DNA引物)。之所以需要引物是因?yàn)樵贒NA合成中DNA聚合酶僅僅可以把新的核苷酸加到已有的DNA鏈上。除非特定限制，否則上游引物為在DNA復(fù)制時(shí)，作為DNA模板3'端的復(fù)制起始點(diǎn)的引物，下游引物為在DNA復(fù)制時(shí)，作為DNA模板5'端的復(fù)制起始點(diǎn)的引物。
[0033]術(shù)語(yǔ)“瓊脂糖凝膠電泳”意指一種用瓊脂或瓊脂糖作支持介質(zhì)的電泳方法。借助瓊脂糖凝膠的分子篩作用，多核苷酸片段因其分子量或分子形狀不同，電泳移動(dòng)速度有差異而分離，是基因操作中常用的重要方法。
[0034]術(shù)語(yǔ)“限制性?xún)?nèi)切酶”意指一類(lèi)在生物體內(nèi)存有的酶，它們能將外來(lái)的DNA切斷，即能夠限制異源DNA的侵入并使之失去活力，但對(duì)自己的DNA卻無(wú)損害作用，這樣可以保護(hù)細(xì)胞原有的遺傳信息。本發(fā)明中所述限制性?xún)?nèi)切酶為Avail和限制性?xún)?nèi)切酶Eagl-HF。[0035]術(shù)語(yǔ)“DNA聚合酶”意指一類(lèi)在細(xì)胞復(fù)制DNA的過(guò)程中起重要作用的酶，以DNA為復(fù)制模板，從將DNA由5’端點(diǎn)開(kāi)始復(fù)制到3’端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成及其相輔的活性。本發(fā)明中所述TaqDNA聚合酶可用長(zhǎng)鏈Taq DNA聚合酶，在長(zhǎng)鏈DNA的合成中效果更好。
[0036]術(shù)語(yǔ)“緩沖液”意指一類(lèi)當(dāng)往某些溶液中加入一定量的酸和堿時(shí)，有阻礙溶液pH變化作用的溶液。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0037]圖1為本發(fā)明所述中華鱘、施氏鱘、西伯利亞鱘、小體鱘、達(dá)氏鰉、歐煌、閃光鱘和俄羅斯鱘的所述PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0038]圖2為本發(fā)明所述中華鱘、施氏鱘、西伯利亞鱘、小體鱘、達(dá)氏鰉、歐煌、閃光鱘和俄羅斯鱘的所述限制性?xún)?nèi)切酶Avail酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0039]圖3為本發(fā)明所述中華鱘、施氏鱘、西伯利亞鱘、小體鱘、達(dá)氏鰉、歐煌、閃光鱘和俄羅斯鱘的所述限制性?xún)?nèi)切酶Eagl-HF酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0040]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說(shuō)明書(shū)文字能夠據(jù)以實(shí)施。
[0041]實(shí)施例1:
[0042]提取待檢測(cè)樣品的基因組DNA，推薦采用DNA提取試劑盒提取基因組DNA:
[0043]a)分別剪取已知 中華鱘、施氏鱘、西伯利亞鱘、小體鱘、達(dá)氏鰉、歐煌、閃光鱘和俄羅斯鱘約0.5g鰭條，剪碎，分別放入1.5mL離心管中并編號(hào)為I?8 ;
[0044]b)加入0.45mL三羥甲基甲胺基乙磺酸(TES)混勻，再加入50 μ I質(zhì)量濃度為10%的十二烷基磺酸鈉(SDS)，5.0 μ I濃度為20mg/mL蛋白酶K，充分混勻后，于56°C保溫4_6h，每2h搖I次。
[0045]c)保溫4-6h后，將步驟b)中含混合液的1.5mL離心管放置到室溫，加入等體積飽和酹(500 μ I),顛倒混勻，12000rpm,離心IOmin,分離水相和有機(jī)相，小心吸取上層含核酸的水相，到一個(gè)新的1.5mL離心管中。
[0046]d)將步驟c)分離出的水相的1.5mL離心管中加入等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1),顛倒混勻，12000rpm,離心IOmin,取上層清液轉(zhuǎn)移到新的1.5mL離心管中。
[0047]e)將步驟d)中最終得到的上清液的1.5mL離心管中加入等體積氯仿:異戊醇(24:1),顛倒混勻，12000rpm,離心IOmin,取上層清液到一個(gè)新的1.5mL離心管中。
[0048]f)將步驟e)中最終得到的上清液的1.5mL離心管中加入2.5倍體積的_20°C預(yù)冷的無(wú)水乙醇沉淀基因組DNA，觀察到1.5mL離心管中上清液逐漸產(chǎn)生渾濁。
[0049]g) 12000rpm,離心IOmin,基因組DNA析出，附著在離心管底部,去除乙醇。
[0050]h)-20°C保存的75%乙醇洗滌，12000rpm，離心5min，去除乙醇，55°C干燥基因組DNA。
[0051]i)加入20 μ I無(wú)菌水溶解基因組DNA，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0052]實(shí)施例2:[0053]常見(jiàn)鱘魚(yú)種類(lèi)的快速檢測(cè)
[0054]使用本發(fā)明方法及所述試劑盒進(jìn)行常見(jiàn)鱘魚(yú)種類(lèi)的快速檢測(cè)，包括以下具體步驟:
[0055]步驟一，將實(shí)施例1中提取的上述基因組DNA使用SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示引物對(duì)和所述試劑盒包含的試劑配制成PCR體系，即為在200 μ IPCR反應(yīng)管中加入所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)反應(yīng)體系為15 μ 1:加入0.1μ I濃度為2，500units/mL的Taq DNA聚合酶，
1.5 μ 110 X PCR 緩沖液，1.5μ I 濃度為 IOpm/ μ I 的 dNTPs, 1.2 μ 125mM MgCl2, 2 μ I 所述基因組DNA,0.5 μ I濃度為lOpm/μ I的所述上游引物,0.5 μ I濃度為lOpm/μ I的所述下游引物和7.7μ I無(wú)菌水。
[0056]將上述PCR體系裝于200 μ I PCR管中，將裝有PCR體系的PCR管放入PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，然后94°C變性30s、58°C退火30s、72°C延伸45s，從變性、退火到延伸共35個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin，反應(yīng)完成之后，將PCR產(chǎn)物放入4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0057]步驟二，取200 μ I PCR反應(yīng)管中加入Iyg所述PCR產(chǎn)物，2 μ 110Xbuffer酶切緩沖液，0.2 μ 1100 XBSA和0.5μ I限制性?xún)?nèi)切酶Avail，加無(wú)菌水至20 μ 1，然后將所述酶切反應(yīng)體系在37°C溫育反應(yīng)lh，65°C熱失活20min ;其中IOX酶切緩沖液PH值為7.5，成分
為 IOOpm/ μ I Tris-HCl, 50pm/ μ I NaCl, IOpm/ μ IMgCl2,0.025% Triton ； x-1 OOo
[0058]步驟三，將步驟一中所述PCR產(chǎn)物和步驟二中所述酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠濃度為3.0?3.5%，電泳結(jié)束后，用凝膠成像儀攝像采集電泳圖(如圖1和圖2所示)，圖中M為標(biāo)識(shí)物，標(biāo)識(shí)物中包含2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、IOObp大小的多核苷酸序列，在瓊脂糖凝膠電泳圖中2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、IOObp從上到下排列，從電泳圖1可得出`I?8號(hào)樣本都獲得了擴(kuò)增的目的DNA的片段，大小為666bp ;電泳圖2中編號(hào)I'?3'和6'?8'號(hào)各自獲得一條電泳條帶，大小仍為666bp,編號(hào)4'和5'號(hào)獲得兩條條帶，大小分別為196bp和470bp ；
[0059]步驟四，分析檢測(cè)結(jié)果，4'和5'號(hào)樣本的條帶位置沒(méi)有發(fā)生變化，說(shuō)明沒(méi)有發(fā)生酶切，I'?3'和6'?8'號(hào)樣本的條帶位置和數(shù)量都發(fā)生了變化，說(shuō)明發(fā)生了酶切反應(yīng)。檢測(cè)結(jié)果為I?3號(hào)和6?8號(hào)樣本對(duì)應(yīng)的是中華鱘、施氏鱘、西伯利亞鱘、歐煌、閃光鱘或俄羅斯鱘，4和5號(hào)樣本對(duì)應(yīng)的是小體鱘和達(dá)氏鰉。
[0060]步驟五，重復(fù)步驟二和步驟三，其中所述酶切反應(yīng)體系為在200 μ I PCR反應(yīng)管中加入I μ g所述PCR產(chǎn)物，2 μ IlOXbuffer酶切緩沖液，0.2 μ 1100XBSA和0.5 μ I限制性?xún)?nèi)切酶Eagl-HF，加無(wú)菌水至20 μ I，然后將所述酶切反應(yīng)體系在37°C溫育反應(yīng)15min，65°C熱失活20min。
[0061]分析檢測(cè)結(jié)果，如圖3所示，4'，號(hào)樣本的條帶位置沒(méi)有發(fā)生變化，說(shuō)明沒(méi)有發(fā)生酶切，I''?3''和5''?8''號(hào)樣本的條帶位置和數(shù)量都發(fā)生了變化，說(shuō)明發(fā)生了酶切反應(yīng)，酶切條帶為522bp和144bp。檢測(cè)結(jié)果為4號(hào)樣本對(duì)應(yīng)的是小體鱘，5號(hào)樣本對(duì)應(yīng)的是達(dá)氏鰉。
[0062]盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開(kāi)如上，但其并不僅僅限于說(shuō)明書(shū)和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與 描述的圖例。
【權(quán)利要求】
1.一種常見(jiàn)鱘魚(yú)類(lèi)的PCR-RFLP快速檢測(cè)用試劑盒，其特征在于，包括: 引物對(duì)； PCR 常規(guī)試劑:Taq DNA 聚合酶、10 X buffer PCR 緩沖液、MgCl2 和 dNTPs ； 以及酶切試劑:10 X buffer酶切緩沖液、100 X BSA、限制性?xún)?nèi)切酶Aval I和限制性?xún)?nèi)切酶Eag1-HF。
2.如權(quán)利要求1所述常見(jiàn)鱘魚(yú)類(lèi)的PCR-RFLP快速檢測(cè)用試劑盒，其特征在于，所述引物對(duì)為: 上游引物，其為SEQ ID N0.1所示的多核苷酸序列； 下游引物，其為SEQ ID N0.2所示的多核苷酸序列。
3.—種常見(jiàn)鱘魚(yú)類(lèi)的PCR-RFLP快速檢測(cè)方法，其特征在于，使用權(quán)利要求2所述試劑盒用于常見(jiàn)鱘魚(yú)類(lèi)的PCR-RFLP快速檢測(cè)方法，包括以下步驟: 步驟一，提取待檢測(cè)樣品的基因組DNA作為模板； 步驟二，將所述基因組DNA使用所述試劑盒包含的試劑和所述引物對(duì)配制成PCR體系，配制成的PCR體系放入PCR擴(kuò)增儀中將進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)完成之后，將PCR產(chǎn)物放入4°C保存?zhèn)溆茫? 步驟三，用限制性?xún)?nèi)切酶酶切所述PCR產(chǎn)物，獲得酶切產(chǎn)物； 步驟四，將所述PCR產(chǎn)物和所述酶切產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳圖進(jìn)行物種鑒定。
4.如權(quán)利要求3所述的常見(jiàn)鱘魚(yú)類(lèi)的PCR-RFLP快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系為15μ 1:即為在200μ IPCR反應(yīng)管中加入0.1μ I濃度為2，500units/mL 的 Taq DNA 聚合酶，L 5 μ IlOXbuffer PCR 緩沖液，1.5μ I 25mMMgCl2,1.2 μ I濃度為IOpm/ μ I的dNTPs，2 μ I所述基因組DNA，0.5 μ I濃度為IOpm/ μ I的所述上游引物，0.5μ I濃度為lOpm/μ I的所述下游引物和7.7μ I無(wú)菌水。
5.如權(quán)利要求3所述的常見(jiàn)鱘魚(yú)類(lèi)的PCR-RFLP快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，然后94°C變性30s、58°C退火30s、72°C延伸45s，從預(yù)熱、退火到延伸共反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，然后72°C延伸lOmin。
6.如權(quán)利要求3所述的常見(jiàn)鱘魚(yú)類(lèi)的PCR-RFLP快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述酶切反應(yīng)的反應(yīng)體系為20μ 1: 反應(yīng)體系一為在200 μ IPCR反應(yīng)管中加入I μ g所述PCR產(chǎn)物，2 μ IlOXbuffer酶切緩沖液，0.2 μ 1100 XBSA和0.5μ I限制性?xún)?nèi)切酶Avail，加無(wú)菌水至20 μ 1，然后將所述酶切反應(yīng)體系在37°C溫育反應(yīng)lh，65°C熱失活20min ； 反應(yīng)體系二為在200 μ IPCR反應(yīng)管中加入I μ g所述PCR產(chǎn)物，2 μ IlOXbuffer酶切緩沖液，0.2 μ 1100 XBSA和0.5μ I限制性?xún)?nèi)切酶Eagl-HF，加無(wú)菌水至20 μ 1，然后將所述酶切反應(yīng)體系在37°C溫育反應(yīng)15min，65°C熱失活20min。
7.如權(quán)利要求3所述的常見(jiàn)鱘魚(yú)類(lèi)的PCR-RFLP快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述常見(jiàn)鱘魚(yú)種類(lèi)為中華鱘、施氏鱘、西伯利亞鱘、小體鱘、達(dá)氏鰉、歐煌、閃光鱘和俄羅斯鱘。
8.如權(quán)利要求7所述的常見(jiàn)鱘魚(yú)類(lèi)的PCR-RFLP快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述常見(jiàn)鱘魚(yú)類(lèi)的PCR-RFLP快速檢測(cè)方法可用于區(qū)分小體鱘或達(dá)氏鰉與中華鱘、施氏鱘、西伯利亞鱘、歐煌、閃光鱘或俄羅斯鱘中任一種。
9.如權(quán)利要求8所述的常見(jiàn)鱘魚(yú)類(lèi)的PCR-RFLP快速檢測(cè)方法，其特征在于，采用所述限制性?xún)?nèi)切酶Avail進(jìn)行所述酶切反應(yīng)后可將小體鱘和達(dá)氏鰉從所述常見(jiàn)鱘魚(yú)類(lèi)中區(qū)分出來(lái)，再采用所述限制性?xún)?nèi)切酶Eagl-HF進(jìn)行所述酶切反應(yīng)可將小體鱘與達(dá)氏鰉區(qū)分開(kāi)。
10.如權(quán)利要求9所述的常見(jiàn)鱘魚(yú)類(lèi)的PCR-RFLP快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述限制性?xún)?nèi)切酶Avail的酶切位點(diǎn)為中華鱘、施氏鱘、西伯利亞鱘、歐煌、閃光鱘或俄羅斯鱘所述PCR產(chǎn)物中多核苷酸序列5'的第196和197個(gè)堿基之間的磷酸二酯鍵，小體鱘和達(dá)氏鰉沒(méi)有所述酶切位點(diǎn)；在區(qū)分小體鱘和達(dá)氏鰉的基礎(chǔ)上，所述的限制性?xún)?nèi)切酶Eagl-HF酶切位點(diǎn)為中華鱘、施氏鱘、西伯利亞鱘、歐煌、閃光鱘、俄羅斯鱘和達(dá)氏鰉所述PCR產(chǎn)物中多核苷酸序列5'的第522和523個(gè)堿基之間的磷酸二酯鍵，小體鱘沒(méi)有所述酶切位點(diǎn)；中華鱘、施氏鱘、西伯利亞鱘、小體鱘、達(dá)氏鰉、歐煌、閃光鱘和俄羅斯鱘所述PCR產(chǎn)物中擴(kuò)增多核苷酸序列分別為 SEQ ID N0.3, SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5, SEQ ID N0.6, SEQ ID N0.7, SEQ IDN0.8、SEQ ID N0.9 和 SEQ I·D N0.10 所示序列。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103436612SQ201310364483
【公開(kāi)日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年8月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月20日
【發(fā)明者】徐鵬, 劉曉勇, 劉園園, 孫效文 申請(qǐng)人:徐鵬