扇貝致病性燦爛弧菌Vibrio splendidus的快速檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說(shuō)是一種扇貝致病性燦爛弧菌Vibrio?splendidus的快速檢測(cè)方法。以待檢測(cè)的過(guò)濾海水樣品中細(xì)菌基因組總DNA為模版，利用細(xì)菌16SrDNA保守區(qū)域和致病性燦爛弧菌金屬蛋白酶基因的特異性的引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增和定量分析檢測(cè)養(yǎng)殖環(huán)境中扇貝致病性燦爛弧菌Vibrio?splendidus；檢測(cè)方法包括細(xì)菌基因組DNA提取、熒光定量PCR檢測(cè)。其優(yōu)點(diǎn)是快速、特異性強(qiáng)、細(xì)菌密度檢測(cè)范圍寬、定量結(jié)果能接近于真實(shí)情況。
【專(zhuān)利說(shuō)明】扇貝致病性燦爛弧菌Vibr io splendidus的快速檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說(shuō)是一種扇貝致病性燦爛弧菌Vibriosplendidus的快速檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]燦爛弧菌(Vibrio splendidus)廣泛存在于海洋環(huán)境中，是引起水產(chǎn)動(dòng)物感染致病的主要病原菌，能引起水產(chǎn)貝類(lèi)動(dòng)物的組織潰爛、發(fā)育異常和幼苗的大批死亡，危害十分巨大。已有的研究表明，胞外金屬蛋白酶(Metalloprotease)是燦爛弧菌危害水產(chǎn)動(dòng)物的主要致病因子即感染致病的根源。該金屬蛋白酶基因位于燦爛弧菌基因組的I號(hào)染色體上屬于單拷貝基因，這一特點(diǎn)便于進(jìn)行定量分析。
[0003]目前，針對(duì)燦爛弧菌的檢測(cè)方法主要包括生理生化檢測(cè)方法、熒光抗體技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、rRNA基因探針雜交技術(shù)和PCR檢測(cè)技術(shù)等。但這些方法存在較多的缺點(diǎn)和不足:生理生化檢測(cè)十分耗時(shí)耗力、結(jié)果不穩(wěn)定；熒光抗體技術(shù)需要較昂貴的儀器設(shè)備；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)靈敏度不高，且易受干擾；rRNA基因在物種中非常保守，使得技術(shù)特異性不強(qiáng)；普通PCR方法難以達(dá)到定量分析的要求。與以上技術(shù)相比，熒光定量PCR技術(shù)在檢測(cè)靈敏度和定量分 析手段上都有著傳統(tǒng)方法無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的在于提供一種扇貝致病性燦爛弧菌Vibrio splendidus的快速檢測(cè)方法。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0006]一種扇貝致病性燦爛弧菌Vibrio splendidus的快速檢測(cè)方法，以待檢測(cè)的過(guò)濾海水樣品中細(xì)菌基因組總DNA為模版，利用細(xì)菌16SrDNA保守區(qū)域和致病性燦爛弧菌金屬蛋白酶基因的特異性的引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增和定量分析檢測(cè)養(yǎng)殖環(huán)境中扇貝致病性燦爛弧菌Vibrio splendidus ;其中所述的引物為:
[0007]16S rDNA:
[0008]上游引物I6Srtf:5’ -AGAACCTTACCTACTCTTGACATCC-3’，
[0009]下游引物16Srtr:5’ -CCCAACATTTCACAACACGA-3’ ；
[0010]金屬蛋白酶基因:
[0011]上游引物spfl:5’ -ATGGCACAAGGGATCAGCGG-3’，
[0012]下游引物spf2:5 ’ -GGATAAGAGGAAGCGATAAAGAA-3，。
[0013]所述熒光定量PCR快速檢測(cè)反應(yīng)體系為反應(yīng)總體積為10微升，包括基因組DNA1-4 微升，SYBR Premix Ex Taq3.5 微升，ROX Reference Dye 0.2 微升，引物各 0.15 微升(濃度10微摩爾/升)，最后加滅菌去離子水至10微升。
[0014]所述PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性30秒；95°C變性5秒，60°C退火/延伸30秒，收集SYBR Green熒光，40個(gè)循環(huán)。[0015]以待測(cè)養(yǎng)殖環(huán)境中的DNA樣品作為模板，分別利用16SrDNA和金屬蛋白酶的熒光定量PCR引物，在同一體系下進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果用2_τ分別計(jì)算出16SrDNA和金屬蛋白酶濃度的相對(duì)值C16s和Cspf ;而后再利用根據(jù)所得結(jié)果得出金屬蛋白酶基因在環(huán)境樣品DNA中所占16SrDNA基因的比例V=Cspf/C16S ;最后利用16SrDNA標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的16SrDNA基因的絕對(duì)拷貝數(shù)N16s，根據(jù)上述結(jié)果計(jì)算出金屬蛋白酶的相對(duì)拷貝數(shù)Mspf=N16SXV。
[0016]所述16SrDNA標(biāo)準(zhǔn)曲線:
[0017]I)利用引物16Srtf和16Srtr，通過(guò)PCR反應(yīng)從待測(cè)養(yǎng)殖環(huán)境DNA樣品中擴(kuò)增細(xì)菌總的16S rDNA，根據(jù)PCR純化產(chǎn)物的濃度計(jì)算16S rDNA的拷貝數(shù)；
[0018]2)根據(jù)上述計(jì)算得出的拷貝數(shù)，用無(wú)菌水將16S rDNA稀釋成不同數(shù)量級(jí)的拷貝數(shù)；根據(jù)上述拷貝數(shù)梯度，利用16Srtf和16Srtr進(jìn)行SYBR Green熒光染料法熒光定量PCR反應(yīng)，根據(jù)熒光定量PCR的結(jié)果繪制16S rDNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0019]本發(fā)明提供了擴(kuò)增燦爛弧菌金屬蛋白酶的特異性引物，從而提供了一種快速檢測(cè)致病性燦爛弧菌的方法，同已有的檢測(cè)技術(shù)相比具有如下優(yōu)勢(shì):
[0020]快速性:沒(méi)有后處理，不用電泳、拍照，實(shí)施縮短反應(yīng)時(shí)間；
[0021]檢測(cè)范圍寬:因目標(biāo)基因?yàn)閱慰截?，所以檢測(cè)上線可達(dá)到107CFU/mL，可完全滿足野外調(diào)查的需要；
[0022]特異性強(qiáng):目標(biāo)基因的PCR基因產(chǎn)物同源性極低，且檢測(cè)方法不存在非特異性擴(kuò)增的可能，保證檢測(cè)的準(zhǔn)確可靠性。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的16SrDNA拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。(熒光定量PCR反應(yīng)中16SrDNA拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。該標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-2.898，擬合度R2為0.9965。) [0024]圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的大連蝦夷扇貝養(yǎng)殖環(huán)境中致病性燦爛弧菌所占比例。(大連蝦夷扇貝養(yǎng)殖環(huán)境中致病性燦爛弧菌所占比例。)
[0025]圖3本發(fā)明實(shí)施例提供的大連蝦夷扇貝養(yǎng)殖環(huán)境DNA中16SrDNA和金屬蛋白酶的拷貝數(shù)。(大連蝦夷扇貝養(yǎng)殖環(huán)境DNA中16SrDNA和金屬蛋白酶的拷貝數(shù)。其中，紅色線為環(huán)境樣品中細(xì)菌總16SrDNA的拷貝數(shù)；藍(lán)色線為環(huán)境樣品中燦爛弧菌金屬蛋白酶的拷貝數(shù)。)
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面的實(shí)驗(yàn)例中將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。
[0027]實(shí)驗(yàn)例1:燦爛弧菌定量檢測(cè)引物的特異性分析:
[0028]通過(guò)使用燦爛弧菌金屬蛋白酶定量檢測(cè)引物能夠特異性的檢測(cè)燦爛弧菌中金屬蛋白酶基因。
[0029]分別將燦爛弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌、溶藻膠弧菌、嗜水氣單胞菌、銅綠假單胞菌以及惡臭假單胞菌進(jìn)行培養(yǎng)后提取全基因組DNA，作為PCR反應(yīng)的模板。利用燦爛弧菌金屬蛋白酶定量檢測(cè)引物和上述模板進(jìn)行普通PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5分鐘；95°C變性30秒，60°C復(fù)性30秒，72°C延伸30秒，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10分鐘。PCR反應(yīng)結(jié)束后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠檢測(cè)。結(jié)果表明，只有燦爛弧菌為模板的樣品中有特異性條帶，其他樣品中菌無(wú)反應(yīng)條帶。將燦爛弧菌樣品中的特異性條帶進(jìn)行序列測(cè)定分析，確定為燦爛弧菌的金屬蛋白酶基因。說(shuō)明燦爛弧菌金屬蛋白酶定量檢測(cè)引物有較好的特異性。
[0030]實(shí)驗(yàn)例2:燦爛弧菌定量檢測(cè)引物的靈敏度分析:
[0031]通過(guò)使用燦爛弧菌金屬蛋白酶定量檢測(cè)引物能夠高靈敏性的檢測(cè)燦爛弧菌。
[0032]將燦爛弧菌用2216E液體培養(yǎng)基于18°C振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，使用平板計(jì)數(shù)的方法確定菌液的濃度為4X IO9CFU/毫升，使用無(wú)菌的生理鹽水將燦爛弧菌的菌液按照10的倍數(shù)進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)瑵舛确謩e為4X IO8CFU/毫升、4X IO7CFU/毫升、4X IO6CFU/毫升、4X IO5CFU/毫升、4 X IO4CFU/ 毫升、4 X IO3CFU/ 毫升、4 X IO2CFU/ 毫升、4 X IO1CFU/ 毫升、4CFU/ 毫升。利用以上各稀釋度的菌液作為模板進(jìn)行普通PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5分鐘；95°C變性30秒，60°C復(fù)性30秒，72°C延伸30秒，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10分鐘。
[0033]PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)其靈敏度能夠達(dá)到檢測(cè)每毫升最低4CFU的菌體。該引物的靈敏度能夠有效地對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境和養(yǎng)殖動(dòng)物個(gè)體中致病性燦爛弧菌進(jìn)行定性和定量的檢測(cè)。
[0034]實(shí)施例3:對(duì)大連扇貝養(yǎng)殖環(huán)境中燦爛弧菌所占總細(xì)菌比例的檢測(cè)情況
[0035]分別取3、5、7、8、9、11月的大連蝦夷扇貝養(yǎng)殖環(huán)境中采集水體樣品，水樣經(jīng)過(guò)
0.22 μ m濾膜富集環(huán)境中的微生物，將濾膜上的總DNA進(jìn)行提取后，測(cè)定各月份環(huán)境樣品DNA的濃度。
[0036]進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)前將各月份環(huán)境樣品DNA的濃度都稀釋到Ing/ μ 1，將稀釋好的樣品分別用16SrDNA和金屬蛋白酶基因的引物進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性30秒；95°C變性5秒，60°C退火/延伸30秒，收集SYBR Green熒光，40個(gè)循環(huán)。分別根據(jù)PCR結(jié)果中16SrDNA和金屬蛋白酶基因擴(kuò)增指數(shù)Ct值，用2_τ計(jì)算出16SrDNA和金屬蛋白酶濃度的相對(duì)值C16s 和Cspf ;再利用公式V=Cspf/C16S得出金屬蛋白酶基因在環(huán)境樣品DNA中所占16SrDNA基因的比例。根據(jù)每個(gè)月份金屬蛋白酶基因和16SrDNA相對(duì)拷貝數(shù)的比值，能夠代表環(huán)境中致病性燦爛弧菌占細(xì)菌總數(shù)的比例(附圖2)。
[0037]根據(jù)16SrDNA拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每個(gè)月份環(huán)境中細(xì)菌總的16SrDNA基因的絕對(duì)拷貝數(shù)N16s，該數(shù)值能夠真實(shí)反應(yīng)環(huán)境中細(xì)菌總數(shù)的情況。根據(jù)金屬蛋白酶基因和16SrDNA的比值，再利用公式Mspf=N16sXV計(jì)算出各月樣品中金屬蛋白酶的相對(duì)拷貝數(shù)，能夠較為準(zhǔn)確的鑒定出致病性燦爛弧菌的數(shù)量(附圖3)。
【權(quán)利要求】
1.一種扇貝致病性燦爛弧菌Vibrio splendidus的快速檢測(cè)方法,其特征在于:以待檢測(cè)的過(guò)濾海水樣品中細(xì)菌基因組總DNA為模版，利用細(xì)菌16SrDNA保守區(qū)域和致病性燦爛弧菌金屬蛋白酶基因的特異性的引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增和定量分析檢測(cè)養(yǎng)殖環(huán)境中扇貝致病性燦爛弧菌Vibrio splendidus ;其中所述的引物為:
16S rDNA:
上游引物 16Srtf:5’ -AGAACCTTACCTACTCTTGACATCC-3’，
下游引物 16Srtr:5’ -CCCAACATTTCACAACACGA-3’ ； 金屬蛋白酶基因:
上游引物 spfl:5’ -ATGGCACAAGGGATCAGCGG-3’， 下游引物 spf2:5，-GGATAAGAGGAAGCGATAAAGAA-3’。
2.按權(quán)利要求1所述的扇貝致病性燦爛弧菌的快速檢測(cè)方法，其特征在于:所述熒光定量PCR快速檢測(cè)反應(yīng)體系為反應(yīng)總體積為10微升，包括基因組DNA1-4微升，SYBR PremixEx Taq3.5微升，ROX Reference Dye0.2微升，引物各0.15微升(濃度10微摩爾/升)，最后加滅菌去離子水至10微升。
3.按權(quán)利要求1所述的扇貝致病性燦爛弧菌的快速檢測(cè)方法，其特征在于:所述PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性30秒；95°C變性5秒，60°C退火/延伸30秒，收集SYBR Green熒光，40個(gè)循環(huán)。
4.按權(quán)利要求1所述的扇貝致病性燦爛弧菌的快速檢測(cè)方法，其特征在于:以待測(cè)養(yǎng)殖環(huán)境中的DNA樣品作為模.板，分別利用16SrDNA和金屬蛋白酶的熒光定量PCR引物，在同一體系下進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果用2_τ分別計(jì)算出16SrDNA和金屬蛋白酶濃度的相對(duì)值C16s和Cspf ;而后再利用根據(jù)所得結(jié)果得出金屬蛋白酶基因在環(huán)境樣品DNA中所占16SrDNA基因的比例V=Cspf/C16S ;最后利用16SrDNA標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的16SrDNA基因的絕對(duì)拷貝數(shù)N16s，根據(jù)上述結(jié)果計(jì)算出金屬蛋白酶的相對(duì)拷貝數(shù)Mspf=N16SXV。
5.按權(quán)利要求4所述的扇貝致病性燦爛弧菌的快速檢測(cè)方法，其特征在于:所述16SrDNA標(biāo)準(zhǔn)曲線: 1)利用引物16Srtf和16Srtr，通過(guò)PCR反應(yīng)從待測(cè)養(yǎng)殖環(huán)境DNA樣品中擴(kuò)增細(xì)菌總的16S rDNA，根據(jù)PCR純化產(chǎn)物的濃度計(jì)算16S rDNA的拷貝數(shù)； 2)根據(jù)上述計(jì)算得出的拷貝數(shù)，用無(wú)菌水將16SrDNA稀釋成不同數(shù)量級(jí)的拷貝數(shù)；根據(jù)上述拷貝數(shù)梯度，利用16Srtf和16Srtr進(jìn)行SYBR Green熒光染料法熒光定量PCR反應(yīng)，根據(jù)熒光定量PCR的結(jié)果繪制16S rDNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103468806SQ201310409878
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月10日
【發(fā)明者】宋林生, 邱麗梅, 劉瑞, 張峘 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所