用于鑒定哈克尼西棉胞質(zhì)不育純合恢復(fù)系的標(biāo)記及方法【專利摘要】本發(fā)明涉及棉花分子育種【
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】，具體是一種用于鑒定哈克尼西棉胞質(zhì)不育純合恢復(fù)系的標(biāo)記及方法。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下有益效果：1）速度快：用本發(fā)明所述引物進行分子標(biāo)記鑒定，就可以很快鑒定出恢復(fù)系（株）的純合性，比傳統(tǒng)鑒定方法減少工作量70%以上；2）準(zhǔn)確率高：本發(fā)明所述引物具有簡單、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好等優(yōu)點，可快速鑒定恢復(fù)基因是否純合，真正從DNA水平上鑒定恢復(fù)基因的遺傳情況，提高了選擇的精確性，準(zhǔn)確率至少在97%以上；3）實用簡單：本發(fā)明所述的用于鑒定哈克尼西棉胞質(zhì)不育純合恢復(fù)系方法的整個程序易于操作，具有很好的科學(xué)研究和商業(yè)應(yīng)用前景?！緦＠f明】用于鑒定哈克尼西棉胞質(zhì)不育純合恢復(fù)系的標(biāo)記及方法【
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】[0001]本發(fā)明涉及棉花分子育種【
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】，具體是一種用于鑒定哈克尼西棉胞質(zhì)不育純合恢復(fù)系的標(biāo)記及方法?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]雜交棉是我國棉花獲得高產(chǎn)的重要途徑。人工雜交棉已經(jīng)在長江流域棉區(qū)和黃河流域棉區(qū)廣泛應(yīng)用。近年來隨著用工成本的增加，人工去雄雜交制種成本居高不下，雜交棉推廣受到影響。利用棉花胞質(zhì)雄性不育三系配套制種方式具有省工、種子純度高、成本較低等優(yōu)點。在我國棉花種植面積下滑的情況下，利用棉花胞質(zhì)雄性不育三系配套制種方式是棉花雜交種生產(chǎn)發(fā)展的必然趨勢，是保證總產(chǎn)基本穩(wěn)定的重要戰(zhàn)略手段。[0003]目前，以哈克尼西棉細胞質(zhì)雄性不育材料為基礎(chǔ)的三系配套材料已經(jīng)在我國得到成功應(yīng)用。但是，與人工制種相比，可用的親本資源仍然很少，特別是具有強恢復(fù)力的優(yōu)良恢復(fù)系材料仍然是三系雜交棉選育的主要限制因素。因此，在三系雜交棉選育過程中，具有強恢復(fù)力的優(yōu)良恢復(fù)系選育和改良一直是研究的重點和難點。而采用常規(guī)育種技術(shù)選育和改良新恢復(fù)系材料需要年限長，且每年轉(zhuǎn)育后都需要進行大量的田間測交和鑒定工作，以確?；謴?fù)基因在轉(zhuǎn)育和改良過程中沒有丟失，從而需要耗費大量的人力和財力。因此，如何通過分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，既穩(wěn)定可靠又快速簡便地進行恢復(fù)系選育和改良成為三系雜交棉發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0004]本發(fā)明為了解決哈克尼西棉胞質(zhì)不育恢復(fù)系田間測交和鑒定工作所需時間長、消耗大、準(zhǔn)確性差等問題，提供了一種用于鑒定哈克尼西棉胞質(zhì)不育純合恢復(fù)系的引物及方法，從而可以加快恢復(fù)系選育和改良進程，同時保證恢復(fù)系的純合性。[0005]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:用于鑒定哈克尼西棉胞質(zhì)不育純合恢復(fù)系的標(biāo)記(SSR標(biāo)記NAU5121)，其為核苷酸序列如SEQIDN0.1和2所示的引物。[0006]SSR標(biāo)記NAU5121引物:正向引物5’-AGGGCAAATTTCATCTCTCT-3’(SEQIDN0.1)反向引物5’-AAAGCTTGACCGAAATCAAC-3’(SEQIDN0.2)本發(fā)明所述SSR標(biāo)記NAU5121引物來自CMD網(wǎng)站www.cottonmarkers.0rg。[0007]本發(fā)明還提供了SSR標(biāo)記NAU5121在鑒定哈克尼西棉胞質(zhì)不育純合恢復(fù)系中的應(yīng)用。[0008]本發(fā)明采用SSR標(biāo)記NAU5121(SEQIDN0.1和2所示的引物)的鑒定方法為:用SEQIDN0.1和2所示的引物擴增待測哈克尼西棉樣本的基因組DNA;同時具有170bp處和190bp處的兩條擴增帶的樣本為具有恢復(fù)基因的雜合株，具有170bp處擴增帶且不具有190bp處擴增帶的樣本為哈克尼西棉胞質(zhì)不育純合恢復(fù)株，該恢復(fù)株擴繁獲得純合恢復(fù)系。以傳統(tǒng)方法(田間測交和鑒定)為驗證，證明采用本發(fā)明所述SSR標(biāo)記NAU5121對待測樣本是否為哈克尼西棉胞質(zhì)不育純合恢復(fù)系的鑒定，其準(zhǔn)確率為97%以上，SSR標(biāo)記NAU5121與哈克尼西棉胞質(zhì)不育恢復(fù)基因Rf1遺傳距離為0.4cM,為共顯性標(biāo)記，能夠快速鑒定可育株是否為純合恢復(fù)系，其次與傳統(tǒng)方法相比，哈克尼西棉胞質(zhì)不育恢復(fù)系的鑒定工作量減少70%。[0009]進一步，對于育種群體較大的后代，本發(fā)明還提供了一種快速鑒定哈克尼西棉胞質(zhì)不育純合恢復(fù)系的方法，該方法中提供了一種用于鑒定是否攜帶有恢復(fù)基因的標(biāo)記引物PFl，其為核苷酸序列如SEQIDN0.3和4所示的引物。[0010]標(biāo)記引物PFl:正向序列:5’-CAAGATATGGGTAAGCTTCC-3’(SEQIDN0.3)反向序列:5’-TAACAACATTAGGCTCGATTT-3’(SEQIDN0.4)上述針對育種群體較大后代的快速鑒定哈克尼西棉胞質(zhì)不育純合恢復(fù)系的方法，其具體步驟為:a.用SEQIDN0.3和4所示的引物擴增待測哈克尼西棉樣本的基因組DNA;同時具有1200bp處和1045bp處兩條擴增帶的樣本即為可育株，具有1045bp處擴增帶且不具有1200bp處擴增帶的樣本即為不育株；b.用SEQIDN0.1和2所示的引物擴增步驟a所述可育株的基因組DNA;同時具有170bp處和190bp處的兩條擴增帶的可育株為具有恢復(fù)基因的雜合株，具有170bp處擴增帶且不具有190bp處擴增帶的可育株為哈克尼西棉胞質(zhì)不育純合恢復(fù)株，該恢復(fù)株擴繁獲得純合恢復(fù)系。[0011]上述標(biāo)記引物PFl與恢復(fù)基因/共分離，其為顯性標(biāo)記，可準(zhǔn)確鑒定出恢復(fù)基因，同時在可育株與不育株中均在1045bp處一條共同擴增帶，也可以確定是否擴增成功；SSR標(biāo)記NAU5121引物與恢復(fù)基因/遺傳距離為0.4cM，為共顯性標(biāo)記，可快速鑒定攜帶恢復(fù)基因的可育株是否為純合；以傳統(tǒng)方法(田間測交和鑒定)為驗證，證明采用本發(fā)明所述兩個標(biāo)記引物共同使用，即可快速鑒定出純合恢復(fù)系，準(zhǔn)確率為99%以上。[0012]具體實施時，各鑒定方法中所述的待測哈克尼西棉樣本為經(jīng)過花粉育性調(diào)查獲得的可育株。經(jīng)過花粉育性調(diào)查后的樣本，縮短了鑒定工作量以及鑒定時間。[0013]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下有益效果:1)速度快:棉花三系恢復(fù)系選育過程中，正常的田間測交和鑒定試驗需要檢測大量的表型性狀，伴隨著投入大量的時間、人力和物力，若不及時快速地對恢復(fù)基因進行鑒定，勢必延緩棉花三系雜交種的培育進程。而本發(fā)明只需要提取恢復(fù)系分離后代材料的DNA，用本發(fā)明所述引物進行分子標(biāo)記鑒定，就可以很快鑒定出恢復(fù)系(株)的純合性，比傳統(tǒng)鑒定方法減少工作量70%以上；2)準(zhǔn)確率高:哈克尼西胞質(zhì)不育恢復(fù)基因的表達易受環(huán)境因素影響，花粉育性不能準(zhǔn)確、真實地反應(yīng)恢復(fù)基因的遺傳情況；本發(fā)明所述引物具有簡單、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好等優(yōu)點，很容易通過PCR快速擴增和瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，而且分子鑒定不受環(huán)境因素的影響，并且與目標(biāo)基因緊密連鎖或共分離，可快速鑒定恢復(fù)基因是否純合，真正從DNA水平上鑒定恢復(fù)基因的遺傳情況，提高了選擇的精確性，準(zhǔn)確率至少在97%以上；3)實用簡單:本發(fā)明所述的用于鑒定哈克尼西棉胞質(zhì)不育純合恢復(fù)系方法的整個程序易于操作，具有很好的科學(xué)研究和商業(yè)應(yīng)用前景。【專利附圖】【附圖說明】[0014]圖1為特異標(biāo)記PFl引物選擇可育和不育單株的分析結(jié)果示意圖，圖中S表示不育型，F(xiàn)表示可育型，X表示擴增失敗樣本。[0015]圖2為SSR標(biāo)記NAU5121引物鑒定純合恢復(fù)系的分析結(jié)果示意圖，圖中Pl表示不育系親本，P2表示恢復(fù)系親本，B表示純合恢復(fù)系，H表示雜合恢復(fù)系?！揪唧w實施方式】[0016]材料的制備與方法:(1X19RX晉棉50)BC3F2:以哈克尼西棉胞質(zhì)不育的恢復(fù)系為母本，晉棉50為父本(輪回親本)，與恢復(fù)系雜交I代、回交3代后，BC3F1分離群體中的可育株自交加代獲得BC3F2分離群體。[0017](19RXGK44)F2:以哈克尼西棉胞質(zhì)不育的恢復(fù)系為母本，GK44為父本，與恢復(fù)系雜交2代后，獲得(19RXGK44)F2。[0018](2)花粉育性調(diào)查:育性調(diào)查方法參照J(rèn)ustus(JustusN,LeinweberCL.Aheritablepartiallymalesterilecharacterincotton.JHered(1960)51(4):191-192)的方法，以手捻破花藥是否出現(xiàn)花粉粒為區(qū)分可育和不育的標(biāo)準(zhǔn)。[0019](3)分子標(biāo)記檢測方法:DNA提取參照CTAB法(PatersonAH,BrubakerCL,WendelJF.ArapidmethodforextractionofcottoniGossypiumspp.)genomicDNAsuitableforRFLPorPCRanalysis.PlantMolBiolRep,1993,11,2:122-127)，改進為無液氮電鉆研磨法，每株取I片未展開嫩葉放入1.5ml的離心管中，并加入預(yù)冷的新鮮配制的提取緩沖液600μI進行提取。PCR反應(yīng)體系15μ?，包括20ng總DNA、0.2mmol/LdNTP、0.5UTaqDNA聚合酶、IXTaqDNA聚合酶buffer、正向和反向引物各0.33μmol/L、MgCl22mmol/L0PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min;94°C變性30s、55°C退火30s、72°C延伸70s，30次循環(huán)；72°C補平延伸IOmin0特異標(biāo)記PFl的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖膠電泳，電壓降3V/cm，電泳lh，溴化乙錠染色；SSR標(biāo)記NAU5121的PCR產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，70W恒功率電泳40min，銀染顯影。[0020]實施例12010年夏季在山西省農(nóng)科院棉花研究所農(nóng)場種植(19RX晉棉50)BC3F2分離群體，種植8行，每行23-25株。由于母本來源于胞質(zhì)不育的恢復(fù)系，在后代出現(xiàn)育性分離，該分離群體共有196株，首先捻破花藥，鑒定單株育性，其中可育株125株，在可育株中，選取SSR標(biāo)記NAU5121引物擴增出的具有170bp處擴增帶且不具有190bp處擴增帶的單株共48株。[0021]2010年冬季在海南進行田間測交和鑒定上述具有170bp處擴增帶且不具有190bp處擴增帶的單株，結(jié)果顯示其中有47株證實為純合恢復(fù)株，準(zhǔn)確率為97.9%。[0022]實施例22010年夏季在山西省農(nóng)科院棉花研究所農(nóng)場種植(19RXGK44)F2分離群體，種植20行，每行23-25株。該分尚群體共有483株,在開花前對該分尚群體單株提取DNA。在該分離群體中，選取標(biāo)記PFl引物擴增出的具有1200bp處和1045bp處兩條擴增帶的單株共349株，僅有1045bp帶型的有126株，無擴增帶型的有8株，PCR擴增結(jié)果見圖1;用SSR標(biāo)記NAU5121引物對349株做第二輪鑒定，具有170bp處擴增帶且不具有190bp處擴增帶的單株共117株，PCR擴增結(jié)果見圖2，將117個單株與不育系測交組合。[0023]2010年冬季海南對上述117個僅具有170bp處擴增帶的單株田間測交F1進行育性恢復(fù)鑒定，結(jié)果顯示其中116株證實為純合恢復(fù)系(株)，準(zhǔn)確率為99.1%。【權(quán)利要求】1.用于鑒定哈克尼西棉胞質(zhì)不育純合恢復(fù)系的標(biāo)記，其為核苷酸序列如SEQIDN0.1和2所示的引物。2.權(quán)利要求1所述的標(biāo)記在鑒定哈克尼西棉胞質(zhì)不育純合恢復(fù)系中的應(yīng)用。3.用于鑒定哈克尼西棉胞質(zhì)不育純合恢復(fù)系的方法，其特征在于，步驟為:用SEQIDN0.1和2所示的引物擴增步驟待測哈克尼西棉樣本的基因組DNA;同時具有170bp處和190bp處的兩條擴增帶的樣本為具有恢復(fù)基因的雜合株，具有170bp處擴增帶且不具有190bp處擴增帶的樣本為哈克尼西棉胞質(zhì)不育純合恢復(fù)株，該恢復(fù)株擴繁獲得純合恢復(fù)系。4.用于鑒定哈克尼西棉胞質(zhì)不育純合恢復(fù)系的方法，其特征在于，步驟為:a.用SEQIDN0.3和4所示的引物擴增待測哈克尼西棉樣本的基因組DNA;同時具有1200bp處和1045bp處兩條擴增帶的哈克尼西棉樣本即為可育株，具有1045bp處擴增帶且不具有1200bp處擴增帶的哈克尼西棉樣本即為不育株；b.用SEQIDN0.1和2所示的引物擴增步驟a所述可育株的基因組DNA;同時具有170bp處和190bp處的兩條擴增帶的可育株為具有恢復(fù)基因的雜合株，具有170bp處擴增帶且不具有190bp處擴增帶的可育株為哈克尼西棉胞質(zhì)不育純合恢復(fù)株，該恢復(fù)株擴繁獲得純合恢復(fù)系。5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的用于鑒定哈克尼西棉胞質(zhì)不育純合恢復(fù)系的方法，其特征在于，所述的待測哈克尼西棉樣本為經(jīng)過花粉育性調(diào)查獲得的可育株?！疚臋n編號】C12Q1/68GK103468805SQ201310409805【公開日】2013年12月25日申請日期:2013年9月11日優(yōu)先權(quán)日:2013年9月11日【發(fā)明者】李朋波,曹美蓮,吳翠翠,楊六六,曹彩榮,劉惠民,王長彪申請人:山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所