檢測(cè)彌散粘附性大腸埃希氏菌的引物、探針及方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于檢測(cè)彌散粘附性大腸埃希氏菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物和探針以及使用其進(jìn)行檢測(cè)的方法，引物和探針的核苷酸序列分別如SEQ?ID?No.2，SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4所示。本發(fā)明還提供了檢測(cè)彌散粘附性大腸埃希氏菌的試劑盒。本發(fā)明的檢測(cè)方法及其試劑盒具有檢測(cè)準(zhǔn)確，靈敏度高，特異性強(qiáng)，簡(jiǎn)便快速的優(yōu)點(diǎn)，具有良好的臨床標(biāo)本檢測(cè)能力。
【專利說明】檢測(cè)彌散粘附性大腸埃希氏菌的引物、探針及方法和試劑
合
Sl
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬微生物檢測(cè)領(lǐng)域，涉及檢測(cè)彌散粘附性大腸埃希氏菌的引物、探針及方法和試劑盒
【背景技術(shù)】
[0002]大腸埃希氏菌是人類腸道中正常菌群的一部分，但某些血清型的菌株能引起尿道感染、菌血癥、腦膜炎和腹瀉等臨床癥狀，這些通常是由五種致瀉性大腸埃希氏菌引起，包括產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌(STEC)、腸產(chǎn)毒性大腸埃希氏菌(ETEC)、腸致病性大腸埃希氏菌(EPEC)、腸侵襲性大腸埃希氏菌(EIEC)和腸集聚性大腸埃希氏菌(EAEC)。其中，EPEC和EAEC均為黏附性大腸埃希氏菌(AEC)，EPEC是定位粘附(LA)模式，EAEC是集聚性粘附(AA)模式。最新研究發(fā)現(xiàn)一種新的粘附性大腸埃希氏菌，在體外表現(xiàn)出對(duì)HEP-2細(xì)胞彌散性粘附的特征，這與以前兩種AEC有著顯著的差別，稱之為“彌散粘附性大腸埃希氏菌(DAEC)”。
[0003]研究表明，DAEC主要感染1-5歲兒童，引起水樣腹瀉，但不引起嬰兒腹瀉，這與其他致瀉性大腸埃希氏菌也有顯著的不同。通過血清學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)DAEC主要集中在0:86，0:127, 0:142, 0:158四個(gè)血清型，這與EPEC經(jīng)常出現(xiàn)的血清型有部分交叉(Diffuselyadherent Escherichia coli strains isolated from children and adults constitutetwo different populations, BMC M`icrobiology2013, 13:22)0
[0004]DAEC檢測(cè)最經(jīng)典和準(zhǔn)確的方法是體外培養(yǎng)，觀察待檢DAEC菌株對(duì)HEp_2細(xì)胞的致病變特征來(lái)判定其致病性，一般典型的特征是出現(xiàn)彌散性粘附(DA)，不同于定位粘附和聚集性粘附。此方法雖然準(zhǔn)確，但是操作繁瑣，不適合開展大規(guī)模樣品的篩查，也不能滿足應(yīng)急檢測(cè)的需求。血清學(xué)鑒定和分類只能提供傳統(tǒng)意義上基于O抗原對(duì)大腸埃希氏菌的分型，無(wú)法解決致瀉型的區(qū)分。
[0005]隨后發(fā)展起來(lái)的DNA探針技術(shù)，從分子水平上探討DAEC的毒力因子，篩選出afa基因家族和AID1-1可能是導(dǎo)致DAEC彌散性粘附的特征性毒力因子，主要使用daaC探針和AID1-1 探針(Molecular Characterization of a Fimbrial Adhesin, F1845, MediatingDiffuse Adherence of Diarrhea-Associated Escherichia coli to HEp_2CeIIs, JOURNALOF BACTERIOLOGY,Aug.1989, p.4281-4289;Cloning and Express ion of anAdhesin(AIDA-1) Involved in Diffuse Adherence of Enteropathogenic Escherichiacoli, INFECTION AND IMMUNITY, Mayl989, p.1506-1511)，其中 daaC 探針是 afa基因家族的重要成員，在彌散性粘附因子表達(dá)方面起到重要的作用，daaC探針檢測(cè)與HEp-2細(xì)胞病變鑒定的一致率超過75% ;而AID1-1探針作為分子檢測(cè)標(biāo)志，研究表明與HEp-2細(xì)胞病變鑒定的一致率僅有2%。此方法涉及到基因組提取技術(shù)、基因重組技術(shù)、克隆構(gòu)建與篩選技術(shù)、分子雜交技術(shù)等，步驟相當(dāng)繁瑣和復(fù)雜，也不適用于大規(guī)模樣品的篩查。
[0006]普通PCR技術(shù)出現(xiàn)后，普通PCR檢測(cè)DAEC的方法在操作步驟和操作時(shí)間上都大為縮短，檢測(cè)靈敏度也有所提高，適合進(jìn)行中大量樣品的快速篩查，但是普通PCR技術(shù)需要打開PCR管進(jìn)行產(chǎn)物分析，這增加了 PCR產(chǎn)物污染的可能性，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，另外，普通PCR技術(shù)的靈敏度還不夠高，對(duì)DAEC菌量低的樣品可能無(wú)法檢測(cè)，造成假陰性結(jié)果。
[0007]在DNA探針技術(shù)的基礎(chǔ)上，普通PCR技術(shù)應(yīng)用到DAEC的分子檢測(cè)中去，還有另外一種PCR技術(shù)——多重PCR技術(shù)，能夠在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)鑒定六種致瀉性大腸埃希氏菌，包括DAEC的鑒定。這些PCR技術(shù)在檢測(cè)DAEC時(shí)多采用afa家族基因(EnterotoxigenicEscherichia coli and Diffusely Adherent E coli as Likely Causes of a Proportionof Pathogen-Negative Travelers’ Diarrhea—A PCR-Based Study, Journal of TravelMedicine，Volumel5，Issue6，2008，412 - 418;Single Multiplex PCR Assay To IdentifySimultaneously the Six Categories of Diarrheagenic Escherichia coli Associatedwith Enteric Infections，JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY，Oct.2005，p.5362 - 536
5)。但此種方法最大的問題是因擴(kuò)增目標(biāo)基因增多犧牲了檢測(cè)靈敏度，所以普通多重PCR方法只適合于菌株的鑒定而不是快速篩查。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)彌散粘附性大腸埃希氏菌的特異性引物和探針序列，并在這套序列的基礎(chǔ)上建立一種基于實(shí)時(shí)熒光PCR的特異敏感的快速檢測(cè)方法，提供一個(gè)彌散粘附性大腸埃希氏菌(DAEC)快速檢測(cè)試劑盒。
[0009]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供了設(shè)計(jì)和篩選特異性引物和探針的技術(shù)方案:
[0010]1、選擇檢測(cè)DAEC的目標(biāo)基因
[0011 ] 根據(jù)以往的研究數(shù)據(jù)，afa基因家族是DAEC致病性的分子基礎(chǔ)，afa基因家族包括daaA、daaB、daaC、daaD、daaE、daaF等成員，其中daaC和daaE是DAEC的檢測(cè)用目標(biāo)基因。本發(fā)明將選擇daaC基因用于DAEC檢測(cè)的目標(biāo)基因。
[0012]2、設(shè)計(jì)檢測(cè)DAEC的引物和探針
[0013]本發(fā)明主要是通過檢測(cè)DAEC的毒力基因daaC達(dá)到篩檢DAEC的目的。
[0014]在Genbank中查找daaC基因的全長(zhǎng)序列，把所有daaC基因全長(zhǎng)序列導(dǎo)入Mega4軟件中，比對(duì)分析獲得daaC基因的保守序列區(qū)段。把保守序列區(qū)段輸入primer express3軟件中，設(shè)計(jì)3-5套引物探針備用方案。引物和探針設(shè)計(jì)時(shí)要考慮到Tm值、GC含量，同時(shí)盡可能避免出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)、引物二聚體等情況。
[0015]3、對(duì)daaC基因的引物探針備用方案進(jìn)行Blast分析
[0016]在Genbank中對(duì)所有引物探針備用方案進(jìn)行BLAST分析，獲得特異性好的引物探針備用方案作為實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證用方案。
[0017]4、對(duì)每一個(gè)可用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方案進(jìn)行PCR驗(yàn)證，確定引物探針的可用性，包括特異性評(píng)估和敏感性評(píng)估。
[0018]基于上述技術(shù)方案，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)彌散粘附性大腸埃希氏菌的特異性引物，其核苷酸序列為:
[0019]上游引物:GGCCACGGAGAGTTATCAGTTT，
[0020]下游引物:AGCAGAAAAGCCGGAATGC。
[0021]進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供與所屬引物配合使用的熒光探針。其中探針的5’標(biāo)記熒光基因FAM，3’標(biāo)記淬滅基因BHQ1。
[0022]探針序列為:Fam-TATCCCTCAGGTGGCACTGCGTCC-BHQ1。
[0023]本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)彌散粘附性大腸埃希氏菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。該方法通過檢測(cè)彌散粘附性大腸埃希氏菌致病特征性afa基因家族基因片段，能夠快速的篩查這種新型的粘附性大腸埃希氏菌——彌散粘附性大腸埃希氏菌，其實(shí)現(xiàn)的技術(shù)方案如下:
[0024]1、引物探針合成
[0025]在基因合成公司合成所有的寡聚核苷酸序列。
[0026]2、DNA模板準(zhǔn)備
[0027]PCR擴(kuò)增彌散粘附性大腸埃希氏菌afa基因家族中daaC基因序列(GenBank: JN688153.1)保守序列840bp，并將其連接到pRB322質(zhì)粒上，命名為pRB322-daaC，作為方法建立的模板。
[0028]3、構(gòu)建和優(yōu)化實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系
[0029]在確定PCR反應(yīng)體系中引物探針序列后，還需要從引物探針濃度、退火溫度、反應(yīng)體系配置、反應(yīng)條件等方面分別進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)體系的配置如下:
[0030]Hotstar DNA 聚合酶 1-2U，5XPCR buffer (Tris-HCl IOOmM (PH8.3), KC1250mM,Tween-200.2%) 5 μ L, IOmM dNTP0.5 -1.5 μ L，25mM MgCl22 -5 μ L，引物探針混合物1.25 μ L，DNA模板2 μ L，超純水補(bǔ)至25 μ L。
[0031]引物探針混合物的濃度配比見表I。
[0032]表I引物探針混合物成分配比表
[0033]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測(cè)彌散粘附性大腸埃希氏菌的特異性引物，其核苷酸序列為: 上游弓 I 物:GGCCACGGAGAGTTATCAGTTT， 下游引物:AGCAGAAAAGCCGGAATGC。
2.與權(quán)利要求1所述引物配合使用的熒光探針，其核苷酸序列為: Fam-TATCCCTCAGGTGGCACTGCGTCC-BHQI。
3.一種彌散粘附性大腸埃希氏菌的檢測(cè)方法，其特征在于，以樣品總DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物和權(quán)利要求2所述的探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。
4.含有權(quán)利要求1所述引物和/或權(quán)利要求2所述探針的試劑盒。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括:陽(yáng)性對(duì)照，DNA聚合酶，反應(yīng)體系緩沖液，Mg2+，dNTP和超純水。
6.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，其工作反應(yīng)體系為=HotstarDNA聚合酶 1-2U，5XPCR buffer (Tris-HClIOOmM(PH8.3), KC1250mM, Tween-200.2%) 5 μ L, IOmMdNTP0.5-1.5 μ L，25mM MgCl22-5 μ L，引物探針混合物1.25 μ L，DNA模板2 μ L，超純水補(bǔ)至25 μ L0
7.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，其工作程序?yàn)? 95°C預(yù)變性lOmin，I個(gè)循環(huán)；95°C變`性30s，55_62°C退火延伸30-60s，40個(gè)循環(huán)；4°C保持。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103451305SQ201310424938
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月17日
【發(fā)明者】王雷, 莫莎, 王曉艷, 張志強(qiáng) 申請(qǐng)人:北京卓誠(chéng)惠生生物科技有限公司