一種快速聯(lián)合監(jiān)測總大腸菌群和大腸埃希氏菌的方法
【專利摘要】一種快速聯(lián)合監(jiān)測總大腸菌群和大腸埃希氏菌的方法，它是利用最大可能數(shù)雙重PCR（MPN?duplex PCR）方法對水質(zhì)糞便污染指示菌總大腸菌群和大腸埃希氏菌進行檢測。本發(fā)明方法簡單快速、只需4步實驗，檢出率比國標多管發(fā)酵法更高；特異性強，重復性好，能同時聯(lián)合定量監(jiān)測水中活的總大腸菌群和大腸埃希氏菌2種指示菌。本發(fā)明為水質(zhì)糞便污染指示菌總大腸菌群和大腸埃希氏菌快速聯(lián)合監(jiān)測提供了一種新的方法。
【專利說明】
一種快速聯(lián)合監(jiān)測總大腸菌群和大腸埃希氏菌的方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及細菌的檢測方法，尤其涉及一種快速聯(lián)合監(jiān)測水質(zhì)糞便污染指示菌總 大腸菌群和大腸埃希氏菌的方法。
【背景技術】
[0002] 水質(zhì)遭受糞便污染后易造成水源性傳染病的爆發(fā)。由于水中可能存在上百種水源 性病原、病原濃度通常較低、檢測方法相對繁瑣、耗時、需專業(yè)人員、設備和生物安全實驗室 等原因，日常監(jiān)測病原體在絕大數(shù)國家，特別是發(fā)展中國家很難實際推廣應用，主要還是監(jiān) 測糞便污染指示菌來間接評估水質(zhì)病原體的污染風險。實際上，每天全球成千上萬的水質(zhì) 評價主要基于測量糞便污染指示菌。大腸菌群和大腸埃希氏菌是最常用于水質(zhì)糞便污染監(jiān) 測的指示菌，目前是全世界各個國家水質(zhì)監(jiān)測和微生物安全評價的主要監(jiān)測指標。因此，一 種快速敏感測定水質(zhì)糞便污染指示菌的方法是監(jiān)控飲水、娛樂用水和食品生產(chǎn)用水安全的 關鍵。目前用于檢測水質(zhì)總大腸菌群和大腸埃希氏菌的方法包括缺存試驗、多管發(fā)酵法、濾 膜法、酶底物法、孔定量盤法、聚合酶鏈反應(PCR)等多種方法，其中多管發(fā)酵法、濾膜法、酶 底物法作為國標法廣泛用于水質(zhì)總大腸菌群和大腸埃希氏菌的日常水質(zhì)微生物監(jiān)測。但是 多管發(fā)酵法和濾膜法等傳統(tǒng)培養(yǎng)方法步驟多、繁瑣、耗時(至少3天）、不能同時聯(lián)合監(jiān)測2種 及以上指示菌。而PCR方法雖然具有敏感快速檢測細菌的特點，但不能定量檢測水中多種活 的細菌。因此，PCR方法目前沒有用于日常水質(zhì)糞便污染指示菌總大腸菌群和大腸埃希氏菌 的監(jiān)測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于建立一種簡單、敏感、特異，且快速同時聯(lián)合監(jiān)測水質(zhì)糞便污染 指示菌活的總大腸菌群和大腸埃希氏菌的方法。
[0004] 本發(fā)明目的通過如下技術方案實現(xiàn)：
[0005] -種快速聯(lián)合監(jiān)測總大腸菌群和大腸埃希氏菌的方法，其特征在于：它是利用最 大可能數(shù)雙重PCR(MPN-duple X PCR)方法對水質(zhì)糞便污染指示菌活的總大腸菌群和大腸埃 希氏菌進行檢測。
[0006] 優(yōu)選地說，本發(fā)明方法是首先對總大腸菌群和大腸埃希氏菌引物的特異性檢測， 再進行水樣的多管預培養(yǎng)、細菌DNA的提取、PCR同時擴增總大腸菌群和大腸埃希氏菌特異 性基因等步驟;所述對總大腸菌群和大腸埃希氏菌引物的特異性選擇中采用的引物是總大 腸菌群的上游引物F5 ' ATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCC3 '，下游引物R5 ' GGTTTATGCAGCAA CGAGACGTCA3'，擴增的基因長度為264bp;大腸埃希氏菌的上游引物F5' AAAACGGCAAGAAAAAGCAG3'，下游引物R5'ACGCGTGGTTACAGT CTTGCG3'，擴增的基因長度為 147bp〇
[0007] 具體地說，一種快速聯(lián)合監(jiān)測總大腸菌群和大腸埃希氏菌的方法，具體流程見附 圖1，按如下步驟：
[0008] (1)總大腸菌群和大腸埃希氏菌引物的特異性選擇:所述引物是總大腸菌群的上 游引物F5 ' ATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCC3 '，下游引物R5 ' GGTTTATGCAGCAACGAGACGTCA3 '，擴 增的基因長度為264bp;大腸埃希氏菌的上游引物F5 ' AAAACGGCAAGAAAAAGCAG3 '，下游引物 R5 ' ACGCGTGGTTACAGTCTTGCG3 '，擴增的基因長度為 147bp。
[0009] (2)水樣的多管預培養(yǎng):將采集的水樣按十倍法稀釋，從10°到10-4五個稀釋倍數(shù)中 取1 Ο*3，1 0-1，1 0-2或1 0-1，1 0-2，1 〇_3三個濃度梯度，每個濃度梯度取lmL水樣接種到五支裝有預 培養(yǎng)基的試管中，在37°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8-18小時，培養(yǎng)液用于提取細菌DNA。
[0010] (3)細菌DNA的提取:細菌DNA的提取采取煮沸法，取1.5mL的多管預培養(yǎng)菌液于離 心管中，在常溫下6000r/min離心4min，細菌沉淀物用無菌去離子水洗滌2次，然后將細菌沉 淀物重新懸浮于〇.5mL無菌去離水中。細菌懸液煮沸凍融2次后常溫12000r/min離心10min， 上清液用于PCR擴增模板。
[0011] (4)PCR同時擴增總大腸菌群和大腸埃希氏菌特異性基因：將總大腸菌群和大腸埃 希氏菌特異性引物和煮沸法提取的細菌DNA模板4yL到30yL含有1倍緩沖液、0.2mM的四種脫 氧核苷酸、1.5mM的Mg 2+、0.4mM的引物、1.5單位的DNA聚合酶、0.8mg/mL的牛血清白蛋白的 PCR擴增體系中，在PCR擴增儀中按照"94°C變性3分鐘，94°C變性30秒、50°C退火30秒、72°C 延伸10秒，共35個循環(huán)"的擴增程序對總大腸菌群的特異性lacZ基因和大腸埃希氏菌特異 性uidA結構基因進行同時擴增，10yL擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖、80V電壓電泳檢測。總大腸菌 群lacZ基因的特異性已在文獻【Bej，A.K.，DiCesare，J.L.Haff，L.and Atlas， R.M. . 1990. Detect ion of col iform bacteria in water by polymerase chain reaction and gene probes.Appl.Environ.Microbiol.56:307_314·】中得到了證明，大腸 埃希氏菌uidA結構基因的特異性已在文獻【Bej，A.K.，DiCesare，J.L.Haff，L.and Atlas， R.M..1991.Detection of Escherichia coli and Shigella spp. in water by using the polymerase chain reaction and gene probes for uid.Appl .Environ.Microbiol · 57:1013-1017.】中得到了證明。
[0012] 為了減少兩對引物在一個PCR擴增體系互相影響、導致錯配、準確率不高、擴增效 率不高的技術問題，對水樣稀釋濃度、預培養(yǎng)時間、DNA模板提取的細菌培養(yǎng)液用量，PCR擴 增時模板用量、Mg 2+濃度、引物選擇和使用濃度、DNA聚合酶濃度、模板變性、退火和延伸時間 等進行一系列試驗優(yōu)化，避免了兩對引物間和其它非特異性模板的干擾，并進行了特異性 實驗。
[0013] (5)數(shù)據(jù)處理：分別記錄三個濃度梯度預培養(yǎng)試管對應的總大腸菌群和大腸埃希 氏菌PCR陽性試管數(shù)，然后根據(jù)總大腸菌群和大腸埃希氏菌PCR陽性試管數(shù)用最大可能數(shù)法 分別查表即可獲得水樣中總大腸菌群和大腸埃希氏菌的最大可能活細菌數(shù)。
[0014] 本發(fā)明具有如下的有益效果：
[0015] 本發(fā)明方法簡單快速、只需4步實驗，檢出率比國標多管發(fā)酵法更高;特異性強，在 實施例中沒有其它干擾條帶;重復性好，在實施例中本方法與國標多管發(fā)酵法具有顯著的 相關性;能同時聯(lián)合定量監(jiān)測水中活的總大腸菌群和大腸埃希氏菌2種指示菌;本方法的實 證效果見附圖2。本方法在2009年10月到2012年9月3年期間應用于三峽水庫水質(zhì)糞便污染 指示菌總大腸菌群和大腸埃希氏菌的現(xiàn)場監(jiān)測，并與國標多管發(fā)酵法進行了比較研究。結 果發(fā)現(xiàn)，所建立的新方法與國標多管發(fā)酵法具有顯著的相關性，說明本方法應用生產(chǎn)具有 可靠性，比國標多管發(fā)酵等方法更簡單、敏感、快速，12小時內(nèi)能同時獲得總大腸菌群和大 腸埃希氏菌的監(jiān)測數(shù)據(jù)，大大減少了水質(zhì)糞便污染指示菌總大腸菌群和大腸埃希氏菌監(jiān)測 時間，有利于對水質(zhì)糞便污染采取及時有效防控措施。本發(fā)明為水質(zhì)糞便污染指示菌活的 總大腸菌群和大腸埃希氏菌快速聯(lián)合監(jiān)測提供了一種新的方法。
【附圖說明】
[0016] 圖1:本發(fā)明方法的流程圖。
[0017] 圖2:本方法實證效果圖;M:DNA標準;泳道1-24為水中活的總大腸菌群和大腸埃希 氏菌2種指示菌;條帶264bp為總大腸菌群;條帶147bp為大腸埃希氏菌。
[0018] 圖3:本方法與國標多管發(fā)酵法同時檢測200個水樣的相關性;橫坐標為國際多管 發(fā)酵法;縱坐標為本方法。
【具體實施方式】
[0019] 下面通過實施例對本發(fā)明進行具體的描述，有必要在此指出的是以下實施例只用 于對本發(fā)明進行進一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領域的技術人員可 以根據(jù)上述本
【發(fā)明內(nèi)容】
對本發(fā)明做出一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整。
[0020] 實施例1
[0021] 2009年10月到2012年9月3年期間從三峽水庫萬州段5個監(jiān)測點采集了200個水樣。 5個監(jiān)測點包括一個水廠取水點、城市上游、城市下游和兩條支流回水區(qū)。2009年10月到 2012年9月間每月用采水器從監(jiān)測點采集1-2次水樣，水樣用無菌塑料瓶置于4°C暗箱中立 即運回實驗室用本方法和國標多管發(fā)酵法進行檢測。將采集的水樣按十倍法稀釋，從10°到 1 0-4五個稀釋倍數(shù)中取10*3，1 0-1，1 0-2或1 0-1，1 0-2，1 0-3三個濃度，每個濃度梯度取lmL水樣接 種到五支裝有預培養(yǎng)基的試管中，37°C在普通恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8-18小時。取1.5mL多管預 培養(yǎng)菌液于離心管中，常溫下6000r/min離心4min，細菌沉淀物用無菌去離子水洗滌2次，然 后將細菌沉淀物重新懸浮于0.5mL無菌去離水中。細菌懸液煮沸凍融2次后常溫12000r/min 離心10min，上清液作為DNA模板用于PCR擴增。將總大腸菌群和大腸埃希氏菌特異性引物和 DNA模板加入到OyL含有1倍緩沖液、0.2mM的四種脫氧核苷酸、1.5mM的Mg2+、0.4mM的引物、 1.5單位的DNA聚合酶、0.8mg/mL的牛血清白蛋白的PCR擴增體系，在Bio-rad PTC-200基因 擴增儀(美國伯樂公司）中按照"94 °C變性3分鐘，94 °C變性30秒、50 °C退火30秒、72 °C延伸10 秒，共35個循環(huán)"的擴增程序進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物根據(jù)10yL擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖、80V 電壓進行電泳檢測，電泳槽和電泳儀為北京六一儀器廠。分別記錄三個濃度梯度預培養(yǎng)試 管對應的總大腸菌群和大腸埃希氏菌PCR陽性試管數(shù)，然后根據(jù)總大腸菌群和大腸埃希氏 菌PCR陽性試管數(shù)用最大可能數(shù)法分別查表即可獲得水樣中總大腸菌群和大腸埃希氏菌的 最大可能活細菌數(shù)。
[0022] 為了驗證本方法的簡便、快速、準確性定量檢測待測水樣中的總大腸菌群和大腸 埃希氏菌，用本方法檢測的樣品同時用生活飲用水標準檢驗方法微生物指標（GB/ T5750.12-2006)中的國標多管發(fā)酵法對水樣中的總大腸菌群和大腸埃希氏菌進行平行檢 測，所有試劑材料均按國標規(guī)定準備。本方法比國標多管發(fā)酵法更敏感，200份水樣用本方 法和國標多管發(fā)酵法同時檢測，結果94份水樣總大腸菌群檢測結果相同、45份水樣國標多 管發(fā)酵法檢測結果更高、59份水樣本方法檢測結果更高；77份水樣大腸埃希氏菌檢測結果 相同、38份水樣國標多管發(fā)酵法檢測結果更高、80份水樣本方法檢測結果更高，見表1。本方 法檢測水樣中總大腸菌群和大腸埃希氏菌的平均濃度要比國標多管發(fā)酵法高，見表2。本方 法與國標多管發(fā)酵法在同時檢測水樣中總大腸菌群和大腸埃希氏菌時具有顯著的強相關 性，其相關性系數(shù)分別為0.88和0.89,見圖3。本方法比國標多管發(fā)酵法簡單、敏感，12小時 能同時獲得總大腸菌群和大腸埃希氏菌2種糞便污染指示菌的監(jiān)測數(shù)據(jù)，而國標多管發(fā)酵 法需要3-4天才能完成總大腸菌群和大腸埃希氏菌的檢測?，F(xiàn)場驗證研究顯示本方法是一 種能用于地表水總大腸菌群和大腸埃希氏菌定量聯(lián)合監(jiān)測的快速、簡單基因檢測方法。
[0023] 表1用本方法與國標多管發(fā)酵法同時檢測水樣中總大腸菌群和大腸埃希氏菌的比 較
[0024]
[0025] 林兩種方法敏感性差異極顯著(P<0 · 01)。
[0026] 表2國標多管發(fā)酵法與本方法同時監(jiān)測地表水水樣中總大腸菌群和大腸埃希氏菌 的平均濃度
[0027]
[0028] **肉柙萬'/云走并顯者u義尾恆驗），Ρ<υ·(Π 。
【主權項】
1. 一種快速聯(lián)合監(jiān)測總大腸菌群和大腸埃希氏菌的方法，其特征在于：它是利用最大 可能數(shù)雙重PCR(MPN-duplex PCR)方法對水質(zhì)糞便污染指示菌活的總大腸菌群和大腸埃希 氏菌進行同時檢測。2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于:首先對總大腸菌群和大腸埃希氏菌引物的特 異性選擇，再進行水樣的多管預培養(yǎng)、細菌DNA的提取、PCR同時擴增總大腸菌群和大腸埃希 氏菌特異性基因等步驟;所述對總大腸菌群和大腸埃希氏菌引物的特異性選擇中采用的引 物是總大腸菌群的上游引物F5 ' ATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCC3 '，下游引物R5 ' GGTTTATGCAGCAACGAGACGTCA3 '，擴增的基因長度為264bp;大腸埃希氏菌的上游引物F5 ' AAAACGGCAAGAAAAAGCAG3 '，下游引物R5 ' ACGCGTGGTTACAGTCTTGCG3 '，擴增的基因長度為 147bp〇3. -種快速聯(lián)合監(jiān)測總大腸菌群和大腸埃希氏菌的方法，其特征在于，按如下步驟： (1) 總大腸菌群和大腸埃希氏菌引物的特異性選擇:所述引物是總大腸菌群的上游引 物F5 ' ATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCC3 '，下游引物R5 ' GGTTTATGCAGCAACGAGACGTCA3 '，擴增的 基因長度為264bp;大腸埃希氏菌的上游引物F5 ' AAAACGGCAAGAAAAAGCAG3 '，下游引物R5 ' ACGCGTGGTTACAGTCTTGCG3 '，擴增的基因長度為147bp; (2) 水樣的多管預培養(yǎng):將采集的水樣按十倍法稀釋，從IOt3到HT4五個稀釋倍數(shù)中取 lO'HT1，KT2或ΚΓ^ΠΓ2, KT3三個濃度梯度，每個濃度梯度取ImL水樣接種到五支裝有預培 養(yǎng)基的試管中，在37°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8-18小時，培養(yǎng)液用于提取細菌DNA; (3) 細菌DNA的提取:細菌DNA的提取采取煮沸法，取1.5mL的多管預培養(yǎng)菌液于離心管 中，在常溫下6000r/min離心4min，細菌沉淀物用無菌去離子水洗滌2次，然后將細菌沉淀物 重新懸浮于〇.5mL無菌去離水中；細菌懸液煮沸凍融2次后常溫12000r/min離心10min，上清 液用于PCR擴增模板； (4) PCR同時擴增總大腸菌群和大腸埃希氏菌特異性基因：將總大腸菌群和大腸埃希氏 菌特異性引物和煮沸法提取的細菌DNA模板4yL到30yL含有1倍緩沖液、0.2mM的四種脫氧核 苷酸、1.5mM的Mg 2+、0.4mM的引物、1.5單位的DNA聚合酶、0.8mg/mL的牛血清白蛋白的PCR擴 增體系中，在PCR擴增儀中按照"94°C變性3分鐘，94°C變性30秒、50°C退火30秒、72°C延伸10 秒，共35個循環(huán)"的擴增程序對總大腸菌群的特異性IacZ基因和大腸埃希氏菌特異性UidA 結構基因進行同時擴增，IOyL擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖、80V電壓電泳檢測； (5) 數(shù)據(jù)處理:分別記錄三個濃度梯度預培養(yǎng)試管對應的總大腸菌群和大腸埃希氏菌 PCR陽性試管數(shù)，然后根據(jù)總大腸菌群和大腸埃希氏菌PCR陽性試管數(shù)用最大可能數(shù)法分別 查表即可獲得水樣中總大腸菌群和大腸埃希氏菌的最大可能活細菌數(shù)。
【文檔編號】C12Q1/06GK105907874SQ201610408358
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月12日
【發(fā)明人】肖國生
【申請人】重慶三峽學院