一種高水分苜蓿青貯菌劑活性成分的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種苜蓿青貯菌劑植物乳桿菌的制備方法，其特征在于,所述植物乳桿菌的制備方法如下:(1)菌株的分離（2）菌株的純化（3）抑酵母試驗(yàn)（4）菌株的藥敏試驗(yàn)（5）菌株的鑒定。本發(fā)明的植物乳桿菌可以產(chǎn)生對(duì)多種病原菌和腐敗菌具有抑制作用的細(xì)菌素，該細(xì)菌素具有很好的酸穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。通過(guò)上述制造的活性成分制造的菌劑對(duì)高水分苜蓿青貯時(shí)，高水分苜蓿水分含量高達(dá)81.7%，青貯時(shí)間達(dá)到240天；同時(shí)提高青貯劑的抑菌效果和降低耐藥性借助青貯苜蓿進(jìn)入食物鏈而傳播的隱患。
【專利說(shuō)明】一種高水分苜蓿青貯菌劑活性成分的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種微生物添加劑的制備方法，尤其涉及一種苜蓿青貯菌劑植物乳桿 菌的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 植物乳桿菌，植物乳桿菌是乳酸菌的一種，最適生長(zhǎng)溫度為30~35,厭氧或兼性厭 氧，菌種為直或彎的桿狀，單個(gè)、有時(shí)成對(duì)或成鏈狀，最適PH 6. 5左右，屬于同型發(fā)酵乳 酸菌。此菌與別的乳酸菌的區(qū)別在于此菌的活菌數(shù)比較高，能大量的產(chǎn)酸，使水中的PH值 穩(wěn)定不升高，而且其產(chǎn)出的酸性物質(zhì)能降解重金屬。由于此菌是厭氧細(xì)菌(兼性好氧)，在繁 殖過(guò)程中能產(chǎn)出特有的乳酸桿菌素，乳酸桿菌素是一種生物型的防腐劑。在養(yǎng)殖中后期，由 于動(dòng)物的糞便和殘餌料增加，會(huì)下沉到池塘的底部，并且腐爛，滋生很多病菌，生成大量的 氨氮和亞硝酸鹽，使底部偷死現(xiàn)象嚴(yán)重。如果長(zhǎng)期使用植物乳酸桿菌，就能很好的抑制底部 糞便和殘餌料的腐爛，也就降低了氨氮和亞硝酸鹽的增加，大量減少了化工降解素的用量， 使養(yǎng)殖成本降低。
[0003] 隨著養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展以及糧食價(jià)格的攀升，開發(fā)品質(zhì)優(yōu)良、安全價(jià)廉的牧草飼 料已成為轉(zhuǎn)變養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)方式的內(nèi)在需求。苜蓿是草食動(dòng)物優(yōu)質(zhì)的飼草，其主要產(chǎn)品 是干草，但這種產(chǎn)品制作時(shí)常受到淋雨、落葉、價(jià)格昂貴的烘干設(shè)備以及消耗大量能源等 問(wèn)題的困擾，苜蓿青貯不僅可以免受以上困擾，還可減少養(yǎng)分損失以保持青綠飼料的營(yíng)養(yǎng) 特性。
[0004] 因此，很多技術(shù)公開了苜蓿青貯的方法，但由于苜蓿自身的營(yíng)養(yǎng)特征和菌落特征 導(dǎo)致現(xiàn)有公開的技術(shù)或方法中苜蓿青貯的效果不理想，主要問(wèn)題在于：一、一部分技術(shù)要求 青貯時(shí)，，需要苜蓿萎蔫或晾曬至65%以下的含水量，這種含水量的要求將導(dǎo)致面臨收獲 的雨季苜蓿無(wú)法進(jìn)行青貯；二、苜蓿自身附有大量的酵母菌和少量的乳酸菌，苜蓿在青貯過(guò) 程中需要使用繁殖快、抑菌強(qiáng)的乳酸菌添加劑，但添加乳酸菌劑的苜蓿青貯品在飼喂動(dòng)物 時(shí)將進(jìn)入食物鏈，降低抗生素抗性的風(fēng)險(xiǎn)，需評(píng)價(jià)乳酸菌劑的抗生素抗性，即乳酸菌劑對(duì) 抗生素的敏感性試驗(yàn)。 鑒于上述苜蓿青貯用乳酸菌添加劑存在的問(wèn)題以及苜蓿青貯時(shí)的特征，現(xiàn)有技術(shù)不 能同時(shí)完成對(duì)高水分含量苜蓿進(jìn)行青貯，同時(shí)提高青貯劑的抑菌效果和降低耐藥性借助 青貯苜蓿進(jìn)入食物鏈而傳播的隱患的問(wèn)題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明目的在于提供一種高水分苜蓿青貯菌劑活性成 分的制備方法。本發(fā)明提供了一種苜蓿青貯菌劑植物乳桿菌的制備方法，其特征在于，所 述植物乳桿菌的制備方法如下： (1)菌株的分離：收集淤泥的浸出液，按體積比2:10的比例加入到無(wú)菌水中混勻，連續(xù) 稀釋，將各個(gè)稀釋度的菌液100微升分別涂布在MRS固體培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)45h ;挑 取透明圈較大的單菌落，在MRS固體培養(yǎng)基上連續(xù)劃線4次得到純的單菌落；挑取單菌落于 沒(méi)有添加碳酸鈣的MRS液體培養(yǎng)基中，觀察是否產(chǎn)氣，產(chǎn)氣菌株為異型發(fā)酵乳酸菌，不產(chǎn) 氣菌株為同型發(fā)酵乳酸菌； (2) 菌株的純化：接入液體LB培養(yǎng)基中，在14-26°C的條件下振蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期， 將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的菌液轉(zhuǎn)接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，14_26°C振蕩培養(yǎng)至穩(wěn)定期初期，將發(fā) 酵液離心，取上清，濾紙過(guò)濾，得粗菌液；用截留分子量為12KDa的膜包將粗菌液的體積濃 縮至原來(lái)的1/10 ;濃縮后的菌液加硫酸銨至65-70%飽和度，離心取上清，繼續(xù)加硫酸銨至 85-100%，離心取沉淀，在pH=7的KPB緩沖液透析中放置24h ;將透析后的菌液離心，取上 清液，上樣于已用pH=7的KPB緩沖液平衡好的CM-S印harose預(yù)裝柱，洗脫，收集有活性 的部分，即為植物乳桿菌，_20°C凍存； (3) 抑酵母試驗(yàn)：取出-20°C條件下保存的乳酸菌，取10微升注入MRS固體培養(yǎng)基上 涂布，在溫度37°C的條件下培養(yǎng)15h ;用接種環(huán)挑取MRS固體培養(yǎng)基上的單菌落，接種于 裝有IOmlMRS培養(yǎng)基的20ml試管中，在溫度37°C的條件下培養(yǎng)17h，得到活化的乳酸菌；按 1%的接種量，將活化的乳酸菌接入不含碳酸鈣MRS液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，裝液 量為100ml，37°C培養(yǎng)17h，此時(shí)，每毫升MRS液體培養(yǎng)基中至少含有0.993 X 101° cfu乳 酸菌；5000轉(zhuǎn)離心5min，收集上清液，獲得抑菌物一；將酵母菌于YH)液體培養(yǎng)基中28°C 靜止培養(yǎng)48h得到酵母菌培養(yǎng)液；雙層瓊脂平板打孔法測(cè)定上述抑菌物一的抑菌能力； (4) 菌株的藥敏試驗(yàn)：制備不同濃度的抗生素濾紙片，培養(yǎng)乳酸菌，采用濾紙片擴(kuò)散法 測(cè)定乳酸菌的藥敏性，得到8株對(duì)抗生素敏感且對(duì)酵母菌抑制效果好的菌株； (5) 菌株的鑒定：將上述步驟篩選得到的菌株進(jìn)行生物學(xué)特性和16S-23S rDNA間隔區(qū) 序列鑒定。
[0006] 上述的一種苜蓿青貯菌劑植物乳桿菌的制備方法，其特征在于，所述的步驟（1) 或（3)中MRS液體培養(yǎng)基為：蛋白胨12g，牛肉膏8g，酵母膏6g，L-光胱胺酸鹽酸鹽0.08 g，檸檬酸氫三銨3g，葡萄糖25g，吐溫80mL，乙酸鈉6g，維生素 K2 3g，磷酸氫二鉀3g，硫酸鎂 〇. 8g，碳酸鈣12 g，硫酸錳0. 3g，瓊脂20g，蒸餾水lOOOmL，pH值6-7 ; 上述的一種苜蓿青貯菌劑植物乳桿菌的制備方法，其特征在于，所述的步驟（1)或（3) 中MRS固體培養(yǎng)基每升的組分及含量為：MRS液體培養(yǎng)基中加入質(zhì)量百分比1.5%瓊脂粉， pH 值為 6.5，121°C 滅菌 20min。
[0007] 上述的一種苜蓿青貯菌劑植物乳桿菌的制備方法，其特征在于，所述的步驟（2) 中的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：酵母粉〇. 3g/L，葡萄糖I. 2g/L，硫酸銨2. 5g/L，磷酸氫二鉀 I. 5g/L，氯化鉀(λ 8g/L，硫酸亞鐵(λ 03g/L，硫酸鎂(λ 8g/L，pH=8-9。
[0008] 上述的一種苜蓿青貯菌劑植物乳桿菌的制備方法，其特征在于，所述步驟（3)中雙 層瓊脂平板打孔法測(cè)定是指，將30ml的MRS固體培養(yǎng)基注入直徑25cm的培養(yǎng)皿中，冷卻 Ih ;取IOmL酵母菌培養(yǎng)液加到150ml冷卻至45°C的YPD半固體培養(yǎng)基中，搖勻，并迅速倒在 底層MRS培養(yǎng)基上；在底層MRS培養(yǎng)基的上面、間隔相等距離處放置3個(gè)被剪短的Iml移液 器Tip頭；該被剪短Tip頭的高為lcm，直徑為0. 8cm ;冷卻注入的YPD半固體培養(yǎng)基，時(shí) 間為lh，此時(shí)，制成雙層培養(yǎng)基；取出Tip頭，制成用于放置抑菌物的洞口；取相同濃度 的上述乳酸菌抑菌物一，體積數(shù)為150微升，加入其中兩孔中；剩余一個(gè)作為對(duì)照，加入 150微升的滅菌俄水；37°C培養(yǎng)48h，測(cè)定和記錄乳酸菌對(duì)酵母菌的抑菌圈直徑； 上述的一種苜蓿青貯菌劑植物乳桿菌的制備方法，其特征在于，所述步驟（4)中制備不 同濃度的抗生素濾紙片是指，將鏈霉素、環(huán)丙沙星和慶大霉素均配置成85 Pg/ml、35(^g/ml 和1200Pg/ml的三個(gè)濃度梯度，阿莫西林、紅霉素和頭孢拉定均配置成0. 650 Pg/ml、2〇Pg/ ml和8〇Pg/ml的三個(gè)濃度梯度，以濾紙制備直徑為0. 8cm的圓形濾紙片，將它們放入上述 抗生素溶液中，得到不同濃度的抗生素濾紙片。
[0009] 上述的一種苜蓿青貯菌劑植物乳桿菌的制備方法，其特征在于，所述步驟（4)中 培養(yǎng)乳酸菌是指，取出_20°C條件下保存的乳酸菌，取5微升注入MRS固體培養(yǎng)基上，涂 布，在溫度37°C的條件下培養(yǎng)15h，用接種環(huán)挑取MRS固體培養(yǎng)基上的單菌落，接種于裝 有5mlMRS培養(yǎng)基的IOml試管中，在溫度37°C的條件下培養(yǎng)17h得到活化的乳酸菌，將活 化的乳酸菌按1%的接種量接入裝有MRS液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，裝液量為100ml， 37°C培養(yǎng)17h，得到乳酸菌液，此時(shí)，每毫升MRS液體培養(yǎng)基中至少含有0.993 X 101° cfu乳酸菌，用無(wú)菌水稀釋每毫升乳酸菌的菌液濃度為I. 5 X IO8 cfu。
[0010] 上述的高水分苜蓿青貯菌劑活性成分的制備方法，其特征在于，所述步驟（5)中 16S-23S rDNA間隔區(qū)的序列鑒定是指，菌株WN5的16S-23S rDNA間隔區(qū)的核苷酸序列與植 物乳桿菌WCFSl (AL935263)的同源性最高，其同源性為98%。
[0011] 上述的高水分苜蓿青貯菌劑活性成分的制備方法，其特征在于所述步驟（5)中菌 株的生物學(xué)特性鑒定是指，植物乳桿菌對(duì)熱的穩(wěn)定性和對(duì)酸的穩(wěn)定性。
[0012] 上述的一種苜蓿青貯菌劑植物乳桿菌的制備方法，其特征在于，所述Yro液體培 養(yǎng)基每升的組分及含量為：酵母粉10克，蛋白胨20克，葡萄糖20克；所述YPD半固體培 養(yǎng)基每升的組分及含量為：酵母粉10克，蛋白胨20克，葡萄糖20克，0. 7%的瓊脂粉。
[0013] 本發(fā)明有益效果在于： 本發(fā)明的植物乳桿菌可以產(chǎn)生對(duì)多種病原菌和腐敗菌具有抑制作用的細(xì)菌素，該細(xì)菌 素具有很好的酸穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，在121°C高溫下處理30分鐘不影響其抑菌活性，抑菌 譜廣等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)上述制造的活性成分制造的菌劑對(duì)高水分苜蓿青貯時(shí)，高水分苜蓿水分 含量高達(dá)81. 7%，青貯時(shí)間達(dá)到240天，青貯后的苜蓿的莖葉完整保存于植株上、含水量與 青貯前相差很少，蛋白質(zhì)含量還有所提高；同時(shí)提高青貯劑的抑菌效果和降低耐藥性借助 青貯苜蓿進(jìn)入食物鏈而傳播的隱患?？梢詰?yīng)用為具有廣闊應(yīng)用前景的天然食品防腐劑和飼 料添加劑。

【具體實(shí)施方式】
[0014] 下述實(shí)施例中，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料，如無(wú)特殊說(shuō) 明，均可從商業(yè)途徑獲得；所述百分含量或濃度，如無(wú)特殊說(shuō)明均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。
[0015] 下述實(shí)施例中所用的培養(yǎng)基如下：MRS液體培養(yǎng)基為：蛋白胨12g，牛肉膏8g，酵 母膏6g，L-光胱胺酸鹽酸鹽0. 08 g，朽1檬酸氫三銨3g，葡萄糖25g，吐溫80mL，乙酸鈉6g, 維生素 K23g，磷酸氫二鉀3g，硫酸鎂0.8g，碳酸鈣12 g，硫酸錳0.3g，瓊脂20g，蒸餾水 1000mL，pH值6-7;MRS固體培養(yǎng)基每升的組分及含量為：MRS液體培養(yǎng)基中加入質(zhì)量百分 比1. 5%瓊脂粉，pH值為6. 5，121°C滅菌20min ;發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：酵母粉0. 3g/L，葡 萄糖I. 2g/L，硫酸銨2. 5g/L，磷酸氫二鉀I. 5g/L，氯化鉀0. 8g/L，硫酸亞鐵0. 03g/L，硫酸鎂 0. 8g/L，pH=8-9 ;YH)液體培養(yǎng)基每升的組分及含量為：酵母粉10克，蛋白胨20克，葡萄 糖20克；所述YPD半固體培養(yǎng)基每升的組分及含量為：酵母粉10克，蛋白胨20克，葡萄 糖20克，0. 7%的瓊脂粉。
[0016] 實(shí)施例1 1、 菌株的分離： 收集青島勝利橋附近淤泥的浸出液按體積比2:10的比例加入到無(wú)菌水中混勻進(jìn)行連 續(xù)稀釋，將各個(gè)稀釋度的菌液100微升分別涂布在MRS固體培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)45h ; 挑取透明圈較大的單菌落，在MRS固體培養(yǎng)基上連續(xù)劃線4次得到純的單菌落；挑取單菌落 于沒(méi)有添加碳酸鈣的MRS液體培養(yǎng)基中，觀察是否產(chǎn)氣，產(chǎn)氣菌株為異型發(fā)酵乳酸菌，不 產(chǎn)氣菌株為同型發(fā)酵乳酸菌； 2、 菌株的純化：接入液體LB培養(yǎng)基中，在14-26°C的條件下振蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期， 將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的菌液轉(zhuǎn)接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，20°C振蕩培養(yǎng)至穩(wěn)定期初期，將發(fā)酵 液離心，取上清，濾紙過(guò)濾，得粗菌液；用截留分子量為12KDa的膜包將粗菌液的體積濃 縮至原來(lái)的1/10 ;濃縮后的菌液加硫酸銨至65%飽和度，離心取上清，繼續(xù)加硫酸銨至 85%，離心取沉淀，在pH=7的KPB緩沖液透析中放置24h ;將透析后的菌液離心，取上清液， 上樣于已用pH=7的KPB緩沖液平衡好的CM-S印harose預(yù)裝柱，洗脫，收集有活性的部 分，即為植物乳桿菌，_20°C凍存； 3、 抑酵母試驗(yàn)： 乳酸菌的活化：取出_20°C條件下保存的乳酸菌，取10微升注入MRS固體培養(yǎng)基上涂 布，在溫度37°C的條件下培養(yǎng)15h ;用接種環(huán)挑取MRS固體培養(yǎng)基上的單菌落，接種于裝 有IOmlMRS培養(yǎng)基的20ml試管中，在溫度37°C的條件下培養(yǎng)17h，得到活化的乳酸菌；按 1%的接種量，將活化的乳酸菌接入不含碳酸鈣MRS液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，裝液 量為100ml，37°C培養(yǎng)17h，此時(shí)，每毫升MRS液體培養(yǎng)基中至少含有0.993 X 101° cfu乳 酸菌；5000轉(zhuǎn)離心5min，收集上清液，獲得抑菌物一；將酵母菌于YH)液體培養(yǎng)基中28°C 靜止培養(yǎng)4?得到酵母菌培養(yǎng)液； 雙層瓊脂平板打孔法測(cè)定上述抑菌物一的抑菌能力： 將30ml的MRS固體培養(yǎng)基注入直徑25cm的培養(yǎng)皿中，冷卻Ih ;取IOmL酵母菌培養(yǎng)液 力口到150ml冷卻至45°C的YPD半固體培養(yǎng)基中，搖勻，并迅速倒在底層MRS培養(yǎng)基上；在底 層MRS培養(yǎng)基的上面、間隔相等距離處放置3個(gè)被剪短的Iml移液器Tip頭；該被剪短Tip 頭的高為lcm，直徑為0. 8cm ;冷卻注入的YH)半固體培養(yǎng)基，時(shí)間為lh，此時(shí)，制成雙層 培養(yǎng)基；取出Tip頭，制成用于放置抑菌物的洞口；取相同濃度的上述乳酸菌抑菌物一，體 積數(shù)為150微升，加入其中兩孔中；剩余一個(gè)作為對(duì)照，加入150微升的滅菌俄水；37°C 培養(yǎng)48h，測(cè)定和記錄乳酸菌對(duì)酵母菌的抑菌圈直徑； 4、 菌株的藥敏試驗(yàn)： 制備不同濃度的抗生素濾紙片是指，將鏈霉素、環(huán)丙沙星和慶大霉素均配置成85 Pg/ ml、35〇Pg/ml和1200Pg/ml的三個(gè)濃度梯度，阿莫西林、紅霉素和頭孢拉定均配置成0. 650 Pg/ml、2〇Pg/ml和8〇Pg/ml的三個(gè)濃度梯度，以濾紙制備直徑為0. 8cm的圓形濾紙片，將 它們放入上述抗生素溶液中，得到不同濃度的抗生素濾紙片； 乳酸菌的培養(yǎng)：取出-20°C條件下保存的乳酸菌，取5微升注入MRS固體培養(yǎng)基上， 涂布，在溫度37°C的條件下培養(yǎng)15h，用接種環(huán)挑取MRS固體培養(yǎng)基上的單菌落，接種于 裝有5mlMRS培養(yǎng)基的IOml試管中，在溫度37°C的條件下培養(yǎng)17h得到活化的乳酸菌，將活 化的乳酸菌按1%的接種量接入裝有MRS液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，裝液量為100ml， 37°C培養(yǎng)17h，得到乳酸菌液，此時(shí)，每毫升MRS液體培養(yǎng)基中至少含有0. 993 X 101° cfu乳酸菌，用無(wú)菌水稀釋每毫升乳酸菌的菌液濃度為I. 5 X IO8 cfu。
[0017] 5、濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定上述乳酸菌的藥敏性：將20ml的不添加碳酸鈣的MRS固體 培養(yǎng)基注入直徑25cm的培養(yǎng)皿中，冷卻Ih;吸取100微升的每ml濃度為I. 5 X IO8 cfu 的乳酸菌液于培養(yǎng)基中央，涂板；取4張濾紙片，這4張濾紙片分別為3張同種抗生素但 濃度不同的抗生素濾紙片，第4張濾紙片為不含抗生素的對(duì)照；待瓊脂表面吸收乳酸菌 后，貼間隔均勻適中的上述4張濾紙片于每個(gè)培養(yǎng)皿的瓊脂表面；靜置5分鐘后，翻轉(zhuǎn) 平皿，37°C靜止培養(yǎng)24h，測(cè)定和記錄抗生素對(duì)乳酸菌的抑菌圈直徑。
[0018] 結(jié)果得到8株對(duì)抗生素敏感且對(duì)酵母菌抑制效果好的菌株. 6、菌株的鑒定 (1)菌株的生物學(xué)特性： a、 植物乳桿菌對(duì)熱的穩(wěn)定性 挑取活化的植物乳桿菌單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，密封，30°C靜置培養(yǎng)24h，發(fā) 酵液以12000rpm，4°C離心15min，收集上清液，上清液用0. 22μπι孔徑的無(wú)菌濾膜過(guò)濾，除 去菌體及其它雜質(zhì)。獲得植物乳桿菌的無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液。
[0019] 將植物乳桿菌的pH6. 0無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液分別放置在60°C、80°C、100°C和121°C 處理15min和30min，按照步驟一所述的牛津杯雙層平板法，在30°C條件下做抑菌試驗(yàn)，確 定不同溫度處理后對(duì)細(xì)菌素抑制藤黃微球菌活性的影響。
[0020] 結(jié)果如表5所示，結(jié)果表明植物乳桿菌對(duì)熱穩(wěn)定，在121°C高溫下處理30分鐘， 仍然保持很高的抑菌活性，可以應(yīng)用于高溫滅菌的食品或飼料中。
[0021] 表5.不同溫度處理對(duì)細(xì)菌素抑制藤黃微球菌（Micrococcus Iuteus) 28001活性 的影響

【權(quán)利要求】
1. 一種苜蓿青貯菌劑植物乳桿菌的制備方法，其特征在于，所述植物乳桿菌的制備方 法如下： (1) 菌株的分離：收集淤泥的浸出液，按體積比2:10的比例加入到無(wú)菌水中混勻，連續(xù) 稀釋，將各個(gè)稀釋度的菌液1〇〇微升分別涂布在MRS固體培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)45h ;挑 取透明圈較大的單菌落，在MRS固體培養(yǎng)基上連續(xù)劃線4次得到純的單菌落；挑取單菌落于 沒(méi)有添加碳酸鈣的MRS液體培養(yǎng)基中，觀察是否產(chǎn)氣，產(chǎn)氣菌株為異型發(fā)酵乳酸菌，不產(chǎn) 氣菌株為同型發(fā)酵乳酸菌； (2) 菌株的純化：接入液體LB培養(yǎng)基中，在14-26°C的條件下振蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期， 將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的菌液轉(zhuǎn)接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，14_26°C振蕩培養(yǎng)至穩(wěn)定期初期，將發(fā) 酵液離心，取上清，濾紙過(guò)濾，得粗菌液；用截留分子量為12KDa的膜包將粗菌液的體積濃 縮至原來(lái)的1/10 ;濃縮后的菌液加硫酸銨至65-70%飽和度，離心取上清，繼續(xù)加硫酸銨至 85-100%，離心取沉淀，在pH=7的KPB緩沖液透析中放置24h ;將透析后的菌液離心，取上 清液，上樣于已用pH=7的KPB緩沖液平衡好的CM-S印harose預(yù)裝柱，洗脫，收集有活性 的部分，即為植物乳桿菌，_20°C凍存； (3) 抑酵母試驗(yàn)：取出-20°C條件下保存的乳酸菌，取10微升注入MRS固體培養(yǎng)基上 涂布，在溫度37°C的條件下培養(yǎng)15h ;用接種環(huán)挑取MRS固體培養(yǎng)基上的單菌落，接種于 裝有l(wèi)OmlMRS培養(yǎng)基的20ml試管中，在溫度37°C的條件下培養(yǎng)17h，得到活化的乳酸菌；按 1%的接種量，將活化的乳酸菌接入不含碳酸鈣MRS液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，裝液 量為100ml，37°C培養(yǎng)17h，此時(shí)，每毫升MRS液體培養(yǎng)基中至少含有0.993 X 101° cfu乳 酸菌；5000轉(zhuǎn)離心5min，收集上清液，獲得抑菌物一；將酵母菌于YH)液體培養(yǎng)基中28°C 靜止培養(yǎng)48h得到酵母菌培養(yǎng)液；雙層瓊脂平板打孔法測(cè)定上述抑菌物一的抑菌能力； (4) 菌株的藥敏試驗(yàn)：制備不同濃度的抗生素濾紙片，培養(yǎng)乳酸菌，采用濾紙片擴(kuò)散法 測(cè)定乳酸菌的藥敏性，得到8株對(duì)抗生素敏感且對(duì)酵母菌抑制效果好的菌株； (5) 菌株的鑒定：將上述步驟篩選得到的菌株進(jìn)行生物學(xué)特性和16S-23S rDNA間隔區(qū) 序列鑒定。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種苜蓿青貯菌劑植物乳桿菌的制備方法，其特征在于，所 述的步驟（1)或（3)中MRS液體培養(yǎng)基為：蛋白胨12g，牛肉膏8g，酵母膏6g，L-光胱胺酸 鹽酸鹽0. 08 g，檸檬酸氫三銨3g，葡萄糖25g，吐溫80mL，乙酸鈉6g，維生素 K2 3g，磷酸氫 二鉀3g，硫酸鎂0? 8g，碳酸鈣12 g，硫酸錳0? 3g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，pH值6-7。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種苜蓿青貯菌劑植物乳桿菌的制備方法，其特征在于，所 述的步驟（1)或（3)中MRS固體培養(yǎng)基每升的組分及含量為：MRS液體培養(yǎng)基中加入質(zhì)量 百分比1.5%瓊脂粉，pH值為6. 5，121 °C滅菌20min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種苜蓿青貯菌劑植物乳桿菌的制備方法，其特征在于，所 述的步驟（2)中的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：酵母粉0. 3g/L，葡萄糖1. 2g/L，硫酸銨2. 5g/L，磷 酸氫二鉀1. 5g/L，氯化鉀0? 8g/L，硫酸亞鐵0? 03g/L，硫酸鎂0? 8g/L，pH=8-9。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種苜蓿青貯菌劑植物乳桿菌的制備方法，其特征在于，所 述步驟（3)中雙層瓊脂平板打孔法測(cè)定是指，將30ml的MRS固體培養(yǎng)基注入直徑25cm的培 養(yǎng)皿中，冷卻lh ;取10mL酵母菌培養(yǎng)液加到150ml冷卻至45°C的YPD半固體培養(yǎng)基中，搖 勻，并迅速倒在底層MRS培養(yǎng)基上；在底層MRS培養(yǎng)基的上面、間隔相等距離處放置3個(gè)被 剪短的lml移液器Tip頭；該被剪短Tip頭的高為lcm，直徑為0. 8cm ;冷卻注入的YPD半 固體培養(yǎng)基，時(shí)間為lh，此時(shí)，制成雙層培養(yǎng)基；取出Tip頭，制成用于放置抑菌物的洞 口；取相同濃度的上述乳酸菌抑菌物一，體積數(shù)為150微升，加入其中兩孔中；剩余一個(gè) 作為對(duì)照，加入150微升的滅菌俄水；37°C培養(yǎng)48h，測(cè)定和記錄乳酸菌對(duì)酵母菌的抑菌圈 直徑； 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種苜蓿青貯菌劑植物乳桿菌的制備方法，其特征在于，所述 步驟（4)中制備不同濃度的抗生素濾紙片是指，將鏈霉素、環(huán)丙沙星和慶大霉素均配置成 85 Mg/ml、35〇Mg/ml和1200Mg/ml的三個(gè)濃度梯度，阿莫西林、紅霉素和頭孢拉定均配置成 0. 650 Mg/ml、2〇Mg/ml和8〇Mg/ml的三個(gè)濃度梯度，以濾紙制備直徑為0. 8cm的圓形濾紙 片，將它們放入上述抗生素溶液中，得到不同濃度的抗生素濾紙片。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種苜蓿青貯菌劑植物乳桿菌的制備方法，其特征在于，所 述步驟（4)中培養(yǎng)乳酸菌是指，取出-20°C條件下保存的乳酸菌，取5微升注入MRS固體 培養(yǎng)基上，涂布，在溫度37°C的條件下培養(yǎng)15h，用接種環(huán)挑取MRS固體培養(yǎng)基上的單菌 落，接種于裝有5mlMRS培養(yǎng)基的10ml試管中，在溫度37°C的條件下培養(yǎng)17h得到活化 的乳酸菌，將活化的乳酸菌按1%的接種量接入裝有MRS液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，裝 液量為100ml，37°C培養(yǎng)17h，得到乳酸菌液，此時(shí)，每毫升MRS液體培養(yǎng)基中至少含有 0.993 X 101° cfu乳酸菌，用無(wú)菌水稀釋每毫升乳酸菌的菌液濃度為1.5 X 108cfu。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的高水分苜蓿青貯菌劑活性成分的制備方法，其特征在于，所 述步驟（5)中16S-23S rDNA間隔區(qū)的序列鑒定是指，菌株WN5的16S-23S rDNA間隔區(qū)的 核苷酸序列與植物乳桿菌WCFS1 (AL935263)的同源性最高，其同源性為98%。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的高水分苜蓿青貯菌劑活性成分的制備方法，其特征在于所述 步驟（5)中菌株的生物學(xué)特性鑒定是指，植物乳桿菌對(duì)熱的穩(wěn)定性和對(duì)酸的穩(wěn)定性。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種苜蓿青貯菌劑植物乳桿菌的制備方法，其特征在于，所 述YH)液體培養(yǎng)基每升的組分及含量為：酵母粉10克，蛋白胨20克，葡萄糖20克；所述 YPD半固體培養(yǎng)基每升的組分及含量為：酵母粉10克，蛋白胨20克，葡萄糖20克，0. 7% 的瓊脂粉。
【文檔編號(hào)】C12R1/25GK104431646SQ201310427807
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月21日
【發(fā)明者】宋波 申請(qǐng)人:青島藍(lán)農(nóng)谷農(nóng)產(chǎn)品研究開發(fā)有限公司