一種溫和高效破碎大腸桿菌細胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種溫和高效破碎大腸桿菌細胞的方法，步驟如下：大腸桿菌細胞懸浮于重懸緩沖液中，并且用10～50mMEDTA溶液于4℃處理過夜，離心收集菌體沉淀，再利用高滲緩沖液與低滲緩沖液重復處理三次，可以使大腸桿菌細胞總體破碎率達到99.2%以上。本發(fā)明細胞破碎工藝操作簡便，設備要求低，易于放大生產(chǎn)，對大腸桿菌破碎率高，并且同時得到細胞內(nèi)可溶性及不溶性成分。
【專利說明】一種溫和高效破碎大腸桿菌細胞的方法
[0001]
【技術(shù)領域】
[0002]本發(fā)明涉及生物、醫(yī)藥及食品工業(yè)【技術(shù)領域】，更具體涉及一種溫和高效破碎大腸桿菌細胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0003]大腸桿菌是基因工程中最常用的一種原核微生物，已經(jīng)廣泛用于表達生產(chǎn)重組胰島素、干擾素、白介素等多種極具醫(yī)藥價值的活性蛋白質(zhì)產(chǎn)品。由于很多重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物都存在于大腸桿菌細胞內(nèi)部，必須對大腸桿菌細胞破壁后才能使這些產(chǎn)物被釋放出來，從而進行后續(xù)的分離純化。因此，如何簡便高效的破碎大腸桿菌細胞成為提取重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物的關鍵性步驟。
[0004]大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，其細胞壁的最外層是厚約8-lOnm的由類脂A、核心多糖和0-特異側(cè)鏈所組成的脂多糖層，內(nèi)層是一層肽聚糖層，這樣的結(jié)構(gòu)使其變得難以破碎。目前常用的破碎方法主要有機械法和非機械法兩大類。機械法包括珠磨法、高壓勻漿法、超聲破碎法和X-press法，這些方法需要珠磨破碎機和高壓勻漿機等專用設備，同時伴有高能、高溫、高噪音、高剪切力的四高危害，而且易使產(chǎn)品變性失活。非機械法中的酶法反應條件溫和，有利于保持產(chǎn)品的活性，但是因為溶菌酶價格較高，同時溶菌酶自身也影響后續(xù)重組蛋白質(zhì)的分離，限制了該法的應用；化學滲透法、滲透壓法和凍融法對大腸桿菌細胞的破碎效率較低，只適用于分離一些小分子量的產(chǎn)物；此外，鹽酸胍等化學試劑破碎細胞還容易引起重組蛋白質(zhì)失活破壞，并影響隨后的分離純化步驟，因此，目前工業(yè)生產(chǎn)中均較少使用非機械法破碎大腸桿 菌細胞。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種溫和高效破碎大腸桿菌細胞的方法。該方法所用工藝簡單快捷，條件溫和，無需復雜設備，可以使大腸桿菌細胞的破碎率達到99.5%，收集上清與沉淀可以分別得到大腸桿菌中的可溶性成分與不溶性成分。
[0007]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:
(1)配制足量重懸緩沖液(50mMTrisCl, IOOmM NaCl，pH 8.0)、高滲緩沖液(20mMTrisCl，2.5mM EDTA, pH 8.0，并加入蔗糖至其質(zhì)量體積濃度為200g/L)及低滲緩沖液(20mMTrisCl,2.5mM EDTA,pH 8.0)；
(2)室溫下收集大腸桿菌菌液，離心收集大腸桿菌菌體，按照每克濕重的大腸桿菌菌體用125ml重懸緩沖液的比例加入重懸緩沖液，并且使菌體懸浮均勻；
(3)向所得重懸菌液中按照菌液與EDTA溶液體積比為9:1~49:1的比例加入pH 8.0的0.5M EDTA溶液，至EDTA最終濃度達到10~50mM，混勻后于4°C靜置過夜，8000rpm離心IOmin,分別收集上清液與菌體沉淀；
(4)向所得菌體沉淀中按照每克沉淀用100ml高滲緩沖液的比例加入高滲緩沖液，并使菌體懸浮均勻；放置20分鐘，混勻后于6000rpm離心，收集高滲緩沖液處理后所得菌體沉淀；
(5)向高滲緩沖液處理所得菌體沉淀中按照每克沉淀用100ml低滲緩沖液的比例加入低滲緩沖液，并使菌體懸浮均勻；放置20分鐘，混勻后于6000rpm離心，分別收集低滲緩沖液處理后所得上清液與菌體沉淀；
(6)繼續(xù)按照步驟4、步驟5所述用高滲緩沖液與低滲緩沖液的操作流程重復處理步驟4所得菌體沉淀2次，分別收集所得上清液與菌體沉淀。
[0008]按照上述步驟處理大腸桿菌細胞，可以使其破碎率達到99.2%。合并上述各步驟所得上清液，即得大腸桿菌細胞內(nèi)的可溶性成分，沉淀中為大腸桿菌細胞內(nèi)的不溶性成分。
[0009]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
I本發(fā)明所用工藝操作簡單易行，破碎效果好，無需使用任何昂貴破菌儀器和設備，成本低廉，易于放大生產(chǎn)規(guī)模，有較好的應用潛力和實際應用價值；
2本發(fā)明所用工藝未使用任何有毒有害化學物質(zhì)，確保產(chǎn)品質(zhì)量的安全性；
3本發(fā)明所用分離步驟中無相變發(fā)生，有利于保護所需分離蛋白質(zhì)產(chǎn)物的生物學活性。
【具體實施方式】
[0013]以下通過實施例對本發(fā)明做進一步的描述:
實施例1
室溫下離心大腸桿菌菌液，收取大腸桿菌細胞菌體50毫克，按照每毫克濕重的大腸桿菌菌體用1.25ml重懸緩沖液(50mM TrisCl, IOOmM NaCl,pH 8.0)的比例加入重懸緩沖液，并且使菌體懸浮均勻；向所得重懸菌液中加入PH 8.0的0.5M EDTA溶液，至EDTA最終濃度達到IOmM,混勻后于4°C靜置過夜，8000rpm離心IOmin,分別收集上清液與菌體沉淀；向所得菌體沉淀中按照每克沉淀用100ml高滲緩沖液(20mM TrisCl, 2.5mM EDTA，pH 8.0，并加入蔗糖至其質(zhì)量體積濃度為200g/L)的比例加入高滲緩沖液，并使菌體懸浮均勻；放置20分鐘，混勻后于6000rpm離心，收集高滲緩沖液處理后所得菌體沉淀；向高滲緩沖液處理所得菌體沉淀中按照每克沉淀用100ml低滲緩沖液(20mM TrisCl, 2.5mM EDTA,pH 8.0)的比例加入低滲緩沖液，并使菌體懸浮均勻；放置20分鐘，混勻后于6000rpm離心，分別收集低滲緩沖液處理后所得上清液與菌體沉淀；向步驟4所得菌體沉淀繼續(xù)按照步驟3、步驟4所述實驗流程用高滲緩沖液與低滲緩沖液重復處理2次，分別收集所得上清液與菌體沉淀。
[0014]大腸桿菌細胞經(jīng)上述EDTA法與滲透壓法聯(lián)合處理后，取Iml樣品離心，離心管底部無肉眼可見的菌體細胞沉淀，同時上清顯示為澄清。分別取120微升破碎前及破碎后樣品，進行菌落形成實驗檢測，結(jié)果表明，破碎前樣品形成菌落2250個，破碎后樣品形成菌落18個，細胞破碎率達到99.2%。
[0015]實施例2· 室溫下離心大腸桿菌菌液，收取大腸桿菌細胞菌體50毫克，按照每毫克濕重的大腸桿菌菌體用1.25ml重懸緩沖液(50mM TrisCl, IOOmM NaCl,pH 8.0)的比例加入重懸緩沖液，并且使菌體懸浮均勻；向所得重懸菌液中加入pH 8.0的0.5M EDTA溶液，至EDTA最終濃度達到50mM,混勻后于4°C靜置過夜，8000rpm離心IOmin,分別收集上清液與菌體沉淀；向所得菌體沉淀中按照每克沉淀用100ml高滲緩沖液(20mM TrisCl, 2.5mM EDTA，pH 8.0，并加入蔗糖至其質(zhì)量體積濃度為200g/L)的比例加入高滲緩沖液，并使菌體懸浮均勻；放置20分鐘，混勻后于6000rpm離心，收集高滲緩沖液處理后所得菌體沉淀；向高滲緩沖液處理所得菌體沉淀中按照每克沉淀用100ml低滲緩沖液(20mM TrisCl, 2.5mM EDTA,pH 8.0)的比例加入低滲緩沖液，并使菌體懸浮均勻；放置20分鐘，混勻后于6000rpm離心，分別收集低滲緩沖液處理后所得上清液與菌體沉淀；向步驟4所得菌體沉淀繼續(xù)按照步驟3、步驟4所述實驗流程用高滲緩沖液與低滲緩沖液重復處理2次，分別收集所得上清液與菌體沉淀。
[0016]大腸桿菌細胞經(jīng)上述EDTA法與滲透壓法聯(lián)合處理后，取Iml樣品離心，離心管底部無肉眼可見的菌體細胞沉淀，同時上清顯示為澄清。分別取120微升破碎前及破碎后樣品，進行菌落形成實驗檢測，結(jié)果表明，破碎前樣品形成菌落2380個，破碎后樣品形成菌落7個，細胞破碎率達到99.7%。`
【權(quán)利要求】
1.一種溫和高效破碎大腸桿菌細胞的方法，按照下述步驟進行: (1)配制足量重懸緩沖液、高滲緩沖液及低滲緩沖液； (2)室溫下收集大腸桿菌菌液，離心收集大腸桿菌菌體，按照每克濕重的大腸桿菌菌體用125ml重懸緩沖液的比例加入重懸緩沖液，并且使菌體懸浮均勻； (3)向所得重懸菌液中按照菌液與EDTA溶液體積比為9:1~49:1的比例加入pH 8.0的0.5M EDTA溶液，至EDTA最終濃度達到10~50mM，混勻后于4°C靜置過夜，8000rpm離心IOmin,分別收集上清液與菌體沉淀； (4)向所得菌體沉淀中按照每克沉淀用100ml高滲緩沖液的比例加入高滲緩沖液，并使菌體懸浮均勻；放置20分鐘，混勻后于6000rpm離心，收集高滲緩沖液處理后所得菌體沉淀； (5)向高滲緩沖液處理所得菌體沉淀中按照每克沉淀用100ml低滲緩沖液的比例加入低滲緩沖液，并使菌體懸浮均勻；放置20分鐘，混勻后于6000rpm離心，分別收集低滲緩沖液處理后所得上清液與菌體沉淀； (6)繼續(xù)按照步驟4、步驟5所述用高滲緩沖液與低滲緩沖液的操作流程重復處理步驟4所得菌體沉淀2次，分別收集所得上清液與菌體沉淀； 合并上述各步驟所得上清液，即得大腸桿菌細胞內(nèi)的可溶性成分，沉淀中為大腸桿菌細胞內(nèi)的不溶性成分。
2.根據(jù)權(quán)利要 求1中所述的一種溫和高效破碎大腸桿菌細胞的方法，其特征在于其中所述的重懸緩沖液為50mM Tris*Cl, IOOmM NaCl, pH 8.0 ;高滲緩沖液為20mM Tris*Cl,2.5mM EDTA，pH 8.0，并加入蔗糖至其質(zhì)量體積濃度為200g/L ;低滲緩沖液為20mMTris*Cl,2.5mM EDTA, pH 8.0。
【文檔編號】C12R1/19GK103667064SQ201310429369
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月22日
【發(fā)明者】聞崇煒, 寧德剛 申請人:江蘇大學