用于檢測h4亞型禽流感病毒的rt-lamp引物組應用及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術領域】，涉及禽流感病毒的檢測，尤其涉及用于檢測H4亞型禽流感病毒的RT-LAMP引物組、該引物組的應用以及檢測H4亞型禽流感病毒的RT-LAMP試劑盒。一種用于檢測H4亞型禽流感病毒的RT-LAMP引物組，其特征在于，所述的RT-LAMP引物組其核苷酸序列分別如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示。本方案的有益效果是，本發(fā)明所提供的用于檢測H4亞型禽流感病毒的RT-LAMP引物組，具有簡單、快速、敏感性和特異性強的特點。
【專利說明】用于檢測H4亞型禽流感病毒的RT-LAMP引物組應用及試劑
合
Si
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術領域】，涉及禽流感病毒的檢測，尤其涉及用于檢測H4亞型禽流感病毒的RT-LAMP引物組、該引物組的應用以及檢測H4亞型禽流感病毒的RT-LAMP試劑盒。
【背景技術】
[0002]流感病毒(Influenza virus)屬于正粘病毒科流感病毒屬,根據(jù)NP蛋白和M蛋白的不同可將其分為甲、乙和丙三型。流感病毒基因組是由8條負鏈RNA節(jié)段組成，編碼11或12個蛋白，其中兩個糖蛋白血凝素蛋白HA和神經(jīng)氨酸酶蛋白NA較為重要，二者位于病毒粒子表面。病毒RNA與核糖核蛋白及三個RNA依賴的RNA聚合酶亞基PB2、PB1和PA相連。已知甲型流感病毒已在多種動物體內分離到，包括人、豬、馬、鯨、海豹和鳥類等。根據(jù)其血清學檢測，現(xiàn)已經(jīng)鑒定出17個HA亞型(H1-17)和9個NA亞型(N1-9)。
[0003]根據(jù)毒力大小的不同，流感病毒可分為低致病性禽流感(LPAI)和高致病性禽流感(HPAI)，已知的17個HA和9個NA亞型均能在水禽中分離到，其中僅H5和H7亞型的部分毒株屬于HPAI，其余均屬于LPAI。所有人類的流感病毒都可以引起禽類流感，但不是所有的禽流感病毒都可以引起人類流感。禽流感病毒中，H5、`H7、H9可以傳染給人，其中H5為高致病性。2005年，中國西部青海湖地區(qū)發(fā)生了水禽感染HPAI的H5N1，導致野鳥大面積死亡，所以要注意到遷徙鳥中的HPAI H5N1流感病毒的潛在危險。隨后，在東南亞不同地區(qū)都出現(xiàn)了基因型和抗原性不同的新型HPAI H5N1，并在家禽中廣泛流行。同時亦不能忽視家禽轉運和鳥類遷徙過程在HPAI H5N1的遠距離傳播中的作用，這也解釋了歐洲、中東和非洲地區(qū)等地區(qū)頻繁暴發(fā)禽流感的可能原因。
[0004]流感病毒的HA蛋白對受體的特異性和親和力是決定宿主嗜性和傳播能力的關鍵因素之一。1918年HlNl流感病毒會受HA蛋白上190和225位氨基酸的影響；D225G突變體下降了 α2，6唾液酸結合的親和力，導致與人氣管中杯狀細胞的結合力下降，從而使病毒在雪貂中的傳播能力下降。同時Η5Ν1病毒在識別不同的受體結合特性是由不同的氨基酸殘基引起的。同樣，在受體結合位點附近的殘基差異使其它禽或流行的流感病毒的受體結合特性變得更加復雜，表明在不同的HA亞型中受體的特異性是不同的。
[0005]我國一直被認為是禽流感的高發(fā)和易發(fā)地，經(jīng)常是多種亞型AIV并存的情形。LPAIV不像HPAIV可引起野鳥和家禽的大面積死亡，但仍然存在較多的潛在危險，如重組變異形成新的病毒等。因此LPAIV仍然需要相當?shù)闹匾暋?br> [0006]Η4亞型AIV屬于LPAIV，國內分離到的毒株較少，因此對之研究較少。國際上目前有韓國、俄羅斯等國家均報道分離到該亞型。哺乳動物分離到的該病毒是1999年在加拿大豬體內分離到一株Η4Ν6病毒，序列分析表明，其各病毒節(jié)段均為禽源，但HA基因的226L的特征使該病毒具有了感染豬的能力，由此暗示Η4亞型病毒可能在哺乳動物體內逐漸適應。[0007]目前，H4流感病毒檢測主要依賴病毒分離和分子生物學檢測，但是不能進行敏感特異快速的檢測方法。所以目前為止還沒有確定一種最具有臨床使用價值的基層分子生物學診斷方法。

【發(fā)明內容】

[0008]為了解決上述的技術問題，本發(fā)明提供了用于檢測H4亞型禽流感病毒的RT-LAMP引物組，還提供了上述的用于檢測H4亞型禽流感病毒RT-LAMP的試劑盒。
[0009]用于檢測H4亞型禽流感病毒的RT-LAMP引物組，該RT-LAMP引物組其核苷酸序列分別如 SEQ ID N0.K SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3, SEQ ID N0.4 所示。
[0010]上述的RT- LAMP引物組在制備檢測或診斷H4亞型禽流感病毒的生物試劑中的用途、在制備檢測或診斷鴨坦布蘇病毒的生物試劑中的應用也是本發(fā)明所要保護的范圍。
[0011]用于檢測H4亞型禽流感病毒RT-LAMP的試劑盒，包括反應混合液、酶混液和蒸餾水，該試劑盒還包括熒光檢測試劑及權利要求1所述的引物組。
[0012]H4亞型禽流感病毒RT-LAMP檢測的試劑盒在制備檢測或診斷H4亞型禽流感病毒的生物試劑中的應用、制備檢測或診斷鴨坦布蘇病毒的生物試劑中的應用也是本發(fā)明所要保護的范圍。
[0013]反轉錄-環(huán)介導等溫擴增(Reverse transcription loop-mediated isothermalamplification,RT-LAMP)技術是一種等溫核酸擴增新技術,其特點是針對祀基因的6個區(qū)域設計3對特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件(63 °C左右)保溫30~60分鐘，即可完成核酸擴增反應。與常規(guī)PCR相比，該方法不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程。該技術在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標上能媲美甚至優(yōu)于PCR技術，由于不依賴任何專門的 儀器設備可實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測，檢測成本遠低于熒光定量PCR，目前這一技術已經(jīng)被用于多種病原微生物的檢測。
[0014]LAMP技術具有一下特征:
1.引物設計
針對靶基因6個特異序列(3’端的F3c、F2c和Flc區(qū)以及5’端的B1、B2和B3區(qū))設計4條引物:上游內部引物(FIP)、上游外部引物(F3)、下游內部引物(BIP)、下游外部引物(B3)。后來添加了 2條環(huán)狀引物，上游環(huán)狀引物(LF)和下游環(huán)狀引物(LB)。國外已建立了LAMP引物設計的在線網(wǎng)站(http://primerexplorer.jp/e/),只要導入祀基因就能自動生成成組引物。挑選最優(yōu)組合即可。
[0015]2.擴增原理
60-65°C是雙鏈DNA復性及延伸的中間溫度，是一種動態(tài)活性溫度，因此，DNA在此溫度下合成是可能的。利用4種特異引物依靠一種高活性鏈置換DNA聚合酶，使得鏈置換DNA合成在不停地自我循環(huán)。
[0016]擴增分兩個階段。第I階段為起始階段，上游內部引物FIP的F2序列首先與模板F2c結合，在鏈置換DNA聚合酶作用下向前延伸啟動鏈置換合成。外部引物F3與模板F3c結合并延伸，置換出完整的FIP連接的互補單鏈，F(xiàn)IP上的Flc與此單鏈上的Fl為互補結構，自我堿基配對形成環(huán)狀結構，以此鏈為模板。下游引物BIP與B3先后啟動類似于FIP和F3的合成，形成啞鈴狀結構的單鏈，迅速以3’末端的Fl區(qū)段為起點.以自身為模板，進行DNA合成延伸形成莖環(huán)狀結構，該結構是LAMP基因擴增循環(huán)的起始結構。第2階段是擴增循環(huán)階段.以莖環(huán)狀結構為模板，F(xiàn)IP與莖環(huán)的F2c區(qū)結合，開始鏈置換合成，解離出的單鏈核酸上也會形成環(huán)狀結構，迅速以3’末端的BI區(qū)段為起點，以自身為模板.進行DNA合成延伸及鏈置換.形成長短不一的2條新莖環(huán)狀結構的DNA，BIP引物上的B2與其雜交，啟動新一輪擴增，且產(chǎn)物DNA長度增加一倍。在反應體系中添加2條環(huán)狀引物LF和LB，它們也分別與莖環(huán)狀結構結合啟動鏈置換合成，周而復始，擴增的最后產(chǎn)物是具有不同個數(shù)莖環(huán)結構、不同長度DNA的混合物，且產(chǎn)物DNA為擴增靶序列的交替反向重復序列。
[0017]3.產(chǎn)物檢測
(I)電泳檢測=LAMP的產(chǎn)物可以用瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下觀察，由于產(chǎn)物是混合物，故呈現(xiàn)出特異的梯狀條帶，經(jīng)限制性內切酶酶切之后呈現(xiàn)單一靶序列條帶III。
[0018](2)熒光檢測:SYBR Green I熒光染料只與雙鏈DNA小溝結合，當它與DNA雙鏈結合時，肉眼觀察熒光染料由橘黃色變?yōu)榫G色，紫外線下可以發(fā)出熒光。在一個體系內，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量，熒光強度檢測可以用實時定量PCR儀進行。
[0019](3)濁度檢測:是其特有也是最常用最便捷的檢測方法。在核酸大量合成時.從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2+結合，產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂的白色沉淀，其具有極高的特異性。只要用肉眼觀察或濁度儀在400 nm光下檢測濁度就能夠判斷擴增與否，并對起始模板定量，達到實時定量的檢測。
[0020]LAMP 引物
【權利要求】
1.一種用于檢測H4亞型禽流感病毒的RT-LAMP引物組，其特征在于，所述的RT-LAMP引物組其核苷酸序列分別如SEQ ID N0.K SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4所/Jn ο
2.如權利要求1所述的RT-LAMP引物組在制備檢測或診斷H4亞型禽流感病毒的生物試劑中的用途。
3.如權利要求1所述的RT-LAMP引物組在制備檢測或診斷鴨坦布蘇病毒的生物試劑中的應用。
4.一種用于檢測H4亞型禽流感病毒RT-LAMP的試劑盒，包括反應混合液、酶混液和蒸餾水，其特征在于，所述的試劑盒還包括熒光檢測試劑及權利要求1所述的引物組。
5.權利要求4所述的H4亞型禽流感病毒RT-LAMP檢測的試劑盒在制備檢測或診斷H4亞型禽流感病毒的生物試劑中的應用。
6.權利要求4所述的H4亞型禽流感病毒RT-LAMP檢測的試劑盒在制備檢測或診斷鴨坦布蘇病毒的生物試劑中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103614490SQ201310499617
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年10月22日 優(yōu)先權日:2013年10月22日
【發(fā)明者】王友令, 楊金興, 袁小遠, 徐懷英, 張玉霞, 劉軍河, 韓曉珺, 董偉峰 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所