本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域的重組病毒載體疫苗，具體涉及一種能夠表達(dá)具H7N9亞型禽流感病毒(Avian Influenza virus,AIV)血凝素HA蛋白的重組火雞皰疹病毒(HVT)，該重組病毒可用于免疫家禽預(yù)防H7N9亞型禽流感病毒中的用途。

背景技術(shù)：

感染人的H7N9亞型禽流感于2013年首次爆發(fā)我國華東的長(zhǎng)三角地區(qū)，是一株三源重組的新型禽流感病毒，對(duì)家禽不致病或低致病性。截止目前已經(jīng)擴(kuò)散至全國除西藏和內(nèi)蒙古自治區(qū)外的所有地區(qū)，珠江三角區(qū)是繼長(zhǎng)三角地區(qū)后的又一新的爆發(fā)疫源地。根據(jù)WHO的統(tǒng)計(jì)顯示，截止到2016年6月13日，一共有781例人感染H7N9的案例，其中死亡313人，死亡率在40％左右。根據(jù)flutracters的追蹤報(bào)道，截止到2016年7月，H7N9感染人的案例已經(jīng)突破800。其增長(zhǎng)速度直逼自從2003年以來人感染H5亞型禽流感數(shù)量已經(jīng)高達(dá)851例，由此可見人感染H7N9的數(shù)量增長(zhǎng)勢(shì)頭迅猛，對(duì)公共衛(wèi)生的危害不容小覷。由于家禽感染不發(fā)病，感染的病例多有與活期接觸的流行病史，因此，活禽市場(chǎng)的家禽的H7N9疫情狀態(tài)具有直接對(duì)公共衛(wèi)生健康的影響巨大。并且人感染H7N9的高峰季節(jié)也與家禽的流行規(guī)律息息相關(guān)。然而目前臨床尚無針對(duì)H7N9的家禽疫苗用于防控此類疾病，因此亟需研制新型的疫苗來保護(hù)家禽，降低疫情對(duì)公共的危害。

火雞皰疹病毒(Herpesvirus of Turkey,HVT)是一種典型無致病性的α皰疹病毒。因HVT與雞馬立克病毒(Marek's disease virus，MDV)在遺傳學(xué)和血清學(xué)上具有相關(guān)性，自1970年以來，HVT Fc-126株作為MD疫苗被廣泛使用。該疫苗具有不會(huì)引發(fā)致瘤發(fā)生、保護(hù)效果良好、在體內(nèi)持續(xù)存在、可以凍干、便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)戎T多優(yōu)點(diǎn)，在MD的防控過程中發(fā)揮了重要的作用。近年來，HVT作為病毒載體方面的研究取得了許多進(jìn)展，因HVT與其它禽病毒載體相比具有許多獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，包括：HVT對(duì)雞及其他動(dòng)物無致病性，安全性好；可以在動(dòng)物體內(nèi)持續(xù)存在、有利于外源基因的持續(xù)表達(dá)、刺激機(jī)體產(chǎn)生較高的抗體水平；HVT可引起高強(qiáng)度的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、免疫出現(xiàn)早、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、接種一次可達(dá)到終生免疫；HVT重組疫苗具有生產(chǎn)成本低、可以凍干、易于貯存和運(yùn)輸；HVT具有很強(qiáng)的細(xì)胞結(jié)合特性、病毒于細(xì)胞間傳播、因此作為重組疫苗，可以突破母源抗體的干擾等[Bublot,M.,et al.,Use of a vectored vaccine against infectious bursal disease of chickens in the face of high-titred maternally derived antibody.J Comp Pathol,2007.137Suppl 1:p.S81-4.]。目前，傳染性法氏囊病毒等多種禽病保護(hù)性抗原均已在HVT載體中成功表達(dá)[Tsukamoto,K.,et al.,Complete,Long-Lasting Protection against Lethal Infectious Bursal Disease Virus Challenge by a Single Vaccination with an Avian Herpesvirus Vector Expressing VP2Antigens.Journal of Virology,2002.76(11):p.5637-5645.]。應(yīng)用上述水平制備的VaxxitexRHVT+IBD重組疫苗已經(jīng)獲得生產(chǎn)許可，成為商品化的以皰疹病毒為載體的動(dòng)物源性疫苗，使HVT成為最具有開發(fā)前景的病毒載體。其技術(shù)核心利用同源重組原理：通過外源基因兩側(cè)的非必需區(qū)同源臂與HVT基因組相對(duì)應(yīng)區(qū)段進(jìn)行同源交換，從而將外源基因?qū)牖蚪M中。1992年Morgan等人首次利用同源重組方法構(gòu)建了表達(dá)NDV(F)基因的重組HVT，該重組病毒既能抵抗致死性MDV的攻擊，又能預(yù)防新城疫，其保護(hù)率接近傳統(tǒng)疫苗的保護(hù)效果[Morgan,R.W.,et al.,Protection of chickens from Newcastle and Marek's diseases with a recombinant herpesvirus of turkeys vaccine expressing the Newcastle disease virus fusion protein.Avian Dis,1992.36(4):p.858-70.]。后來，Gao等人使用上述方法將AIV H5N1(HA)基因插入到HVT基因組不同的位置中，構(gòu)建了兩株rHVT重組病毒，疫苗試驗(yàn)表明這兩株重組病毒均可以同時(shí)抵抗AI和MD[Gao,H.,et al.,Expression of HA of HPAI H5N1Virus at US2Gene Insertion Site of Turkey Herpesvirus Induced Better Protection than That at US10Gene Insertion Site.PLoS ONE,2011.6(7):p.e22549.]。

內(nèi)源性啟動(dòng)子具有克服針對(duì)抗原的母源抗體干擾作用。MDV基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，是受到嚴(yán)格調(diào)控的。如當(dāng)病毒感染細(xì)胞時(shí)，病毒基因的表達(dá)分為3個(gè)時(shí)期：立即早期、遲早期和晚期。但是，以MDV構(gòu)建重組病毒時(shí)，異源的強(qiáng)啟動(dòng)子受到病毒的調(diào)控較少，在重組病毒免疫的早期，該啟動(dòng)子所控制地保護(hù)抗原基因大量表達(dá)，與機(jī)體中針對(duì)該抗原的母源抗體發(fā)生反應(yīng)，使得針對(duì)該抗原的母源抗體下降，從而降低了機(jī)體對(duì)某種疾病的早期保護(hù)。Sonoda等(Sonoda,Kengo,et al."Development of an effective polyvalent vaccine against both Marek's and Newcastle diseases based on recombinant Marek's disease virus type 1in commercial chickens with maternal antibodies."Journal of virology 74.7(2000):3217-3226.)利用MDVI型自身的gB啟動(dòng)子構(gòu)建重組病毒，表達(dá)NDV的F基因，免疫商品雞，可以提供100％的保護(hù)，同時(shí)，并不影響重組病毒的穩(wěn)定性。因此，進(jìn)一步證實(shí)了MDV I型自身的gB啟動(dòng)子受到嚴(yán)格地調(diào)控，可以避免母源抗體的干擾，保證了免疫保護(hù)力。

影響外源基因表達(dá)水平的因素很多，而密碼子的選擇是其中重要的參數(shù)之一，基因表達(dá)水平與嗜好密碼子的使用程度之間存在強(qiáng)的相關(guān)性。每個(gè)氨基酸平均有三個(gè)對(duì)應(yīng)密碼子，這使得不同的核苷酸序列可以編碼出相同的氨基酸序列，而編碼同一氨基酸的不同的密碼子在不同的生物和不同基因中的使用頻率有著顯著的差異，這與在細(xì)胞中相應(yīng)的tRNA的濃度是呈正相關(guān)的。使用頻率極低的就是該物種或基因的稀有密碼子，稀有密碼子的使用已經(jīng)被證實(shí)為阻礙基因表達(dá)的一個(gè)重要因素，因此去除稀有密碼子能夠顯著提高一個(gè)基因的翻譯速度。每個(gè)物種都有對(duì)應(yīng)的偏嗜密碼子，因此為了提高外源基因在一個(gè)物種體內(nèi)的翻譯和表達(dá)水平，常常對(duì)外源基因密碼子進(jìn)行改造，使之符合該物種的密碼子偏嗜分布。Jiang(Jiang,Yongping,et al."Enhanced protective efficacy of H5subtype avian influenza DNA vaccine with codon optimized HA gene in a pCAGGS plasmid vector."Antiviral research 75.3(2007):234-241.)等人對(duì)H5的HA密碼子優(yōu)化(optiHA)插入到真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS上免疫SPF雞，優(yōu)化后的optiHA能夠顯著提高H5亞型禽流感DNA疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性抗體免疫反應(yīng)水平，增強(qiáng)免疫保護(hù)效果。

此外，多家跨國公司已經(jīng)研制出以HVT為載體的商品化疫苗。其中，法國梅里亞公司的HVT用來表達(dá)傳染性法氏囊病(IBD)的VP2基因，即可用來預(yù)IBD，又能預(yù)防馬立克氏病(MD)，目前已經(jīng)在70多個(gè)國家銷售使用。詩華公司的HVT系列產(chǎn)品中，ND表達(dá)新城疫病毒(NDV)的F基因，用于預(yù)防ND和MD；AI表達(dá)clade2.2(A/swan/Hungary/4999/2006)H5N1的HA蛋白，用于預(yù)防不同亞型的H5高致病性禽流感和MD，保護(hù)率在80％-100％。目前已經(jīng)在埃及，蒙古，越南等多個(gè)國家的家禽養(yǎng)殖業(yè)中投入使用，發(fā)揮了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于構(gòu)建表達(dá)H7N9亞型禽流感血凝素蛋白的重組HVT病毒，為研制H7N9亞型禽流感的疫苗提供基礎(chǔ)。

本發(fā)明表達(dá)H7N9亞型AIV血凝素蛋白的重組火雞皰疹病毒株rHOH，是火雞皰疹病毒血清3型FC126株重組毒株，其保藏號(hào)CGMCC NO.12985。

所述的重組火雞皰疹病毒株rHOH，它的gB啟動(dòng)子來源于火雞皰疹病毒載體FC126自身；表達(dá)的外源抗原(血凝素蛋白)基因經(jīng)Gallus Gallus的密碼子偏嗜性優(yōu)化，核苷酸的序列發(fā)生改變，但不改任何變氨基酸序列。

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供高效表達(dá)H7N9亞型禽流感病毒HA的HVT重組病毒的構(gòu)建方法，該方法包括以下步驟：

(1)先獲得密碼子優(yōu)化過的OHA和HVT的gB(HgB)啟動(dòng)子，在帶有同源臂的pCMGFP上EcoRV、NheI與Kpn2I酶切位點(diǎn)(核苷酸位置140408-140651之間)依次進(jìn)行連接替換HgB啟動(dòng)子和表達(dá)外源的OHA基因；連接完后的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到Takala的JM109感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)37度培養(yǎng)過夜，挑斑提質(zhì)粒雙酶切和測(cè)序鑒定，陽性的質(zhì)粒命名為pHOH；所述OHA序列如SEQ ID NO:1，HgB啟動(dòng)子序列如SEQ ID NO:2；

(2)將中間轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pHOH與表達(dá)GFP熒光蛋白的重組火雞皰疹病毒(rHVT-GFP)的DNA進(jìn)行磷酸鈣共轉(zhuǎn)染，篩選出不帶熒光的病毒蝕斑后，并經(jīng)過間接免疫熒光(IFA)和測(cè)序鑒定，該不帶熒光的蝕斑即為帶有H7N9的HA的重組火雞皰疹病毒rHOH。

本發(fā)明還公開了所述重組火雞皰疹病毒株rHOH在制備預(yù)防H7N9亞型禽流感病毒的疫苗中的用途。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明供了一種用于預(yù)防H7N9亞型禽流感的候選疫苗毒株，接種孵化后第18日齡的雞胚或1日齡的雛雞，預(yù)防和控制家禽的H7N9疫情，保護(hù)公眾衛(wèi)生和安全。

附圖說明

圖1 HVT的gB(HgB)啟動(dòng)子，M為200bp的Marker，1為742bp的HgB啟動(dòng)子。

圖2中間轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pHOH圖譜。

圖3轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pHOH的雙酶切鑒定，M為1000bp的marker，1和2同為經(jīng)EcoRV和NheI雙酶切。

圖4同源重組示意圖

圖5 rHOH的IFA結(jié)果和陰性對(duì)照，(左邊為陰性對(duì)照，右邊為陽性結(jié)果)。

圖6重組質(zhì)粒pHOH構(gòu)建示意圖。

圖7重組病毒rHOH轉(zhuǎn)染、同源重組以及篩選鑒定示意圖。

本發(fā)明毒株rHOH于2016年9月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)，分類命名為火雞皰疹病毒血清3型FC126株重組毒株；保藏號(hào)CGMCC NO.12985。

具體實(shí)施方式

材料

rHVT-GFP和pCMGFP由由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存，參見專利申請(qǐng)公布號(hào)：CN105002146A。H7N9亞型禽流感JX148株(A/chicken/Zhejiang/JX148/2014)由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存，雞胚效價(jià)為10，血凝抑制反應(yīng)證明JX148的多抗血清與其他亞型的H7N9具有較高的交叉反應(yīng)性。

pCR2.1載體：購自Invitrogen公司；High fidelity DNA polymerase、T4DNA連接酶、Agarose Gel DNA Extraction Kit購自Roche公司；質(zhì)粒抽提試劑盒(QIAprep Spin MiniPrep Kit)為QIAGEN公司產(chǎn)品；其余常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

步驟1.密碼子優(yōu)化與合成

根據(jù)JX148HA的序列(EPI_ISL_235293)，交由南京金斯瑞公司參照雞(Gallus gallus)的密碼子偏嗜(http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝9031)進(jìn)行密碼子優(yōu)化與合成optiHA(OHA：SEQ ID NO:1)，添加酶切位點(diǎn)后克隆到UC57載體上(由金斯瑞公司提供)，命名為UC57-OHA。

步驟2.擴(kuò)增HVT的內(nèi)源性gB啟動(dòng)子

使用DNeasy Blood tissue kit抽提FC126(GenBank:AF291866)的基因組DNA。使用Gene promoter miner(http://gpminer.mbc.nctu.edu.tw/index.php)在線預(yù)測(cè)分析啟動(dòng)子含有TAAT和CAAT等真核生物啟動(dòng)子的順式作用元件。并合成引物，PCR克隆FC126的gB啟動(dòng)子(HgB，SEQ ID NO:2)，并在啟動(dòng)子首位末端均添加EcoRV和NheI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和保護(hù)性堿基。引物序列如下

gB-F:gatatcATTGTTCAATCATGATGTCCA(SEQ ID NO:3)

gB-R:gctagcGAGTTCCACCGACCGTATGA(SEQ ID NO:4)

PCR擴(kuò)增(50μL反應(yīng)體系)：以含有抽提的基因組基因?yàn)槟０?，吸?.5mL PCR反應(yīng)管中，以引物gB-F和gB-R擴(kuò)增gB啟動(dòng)子基因，具體操作方法如下：

10×Reaction Buffer 5μL

gB-F(50pmol/μL) 1μL

gB-R(50pmol/μL) 1μL

dNTPs(10mmol/L) 1μL

Expand High Fidelity Polymerase(3.5U/μL) 1μL

cDNA 4μL

SW 37μL

PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性3min；94℃30s，56℃45s，72℃延伸2min，20個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min，4℃保存。將PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后切割含目的大小片段的凝膠，用Agrose Gel DNA Extraction Kit回收純化后與pCR-2.1T載體相連，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoR I酶切鑒定正確后送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序，將序列測(cè)定正確的陽性質(zhì)粒命名HgB(圖1)。

步驟3.構(gòu)建中間轉(zhuǎn)移質(zhì)粒

將UC57-OHA使用Nhe I和Kpn II雙酶切，電泳后膠回收備用。將pCMGFP使用EcoRv和NheI雙酶切后，電泳膠回收備用。在專利CN105002146A中所構(gòu)建帶有同源臂的中間質(zhì)粒pCMGFP基礎(chǔ)上，將OHA和HgB分別替換到pCMGFP質(zhì)粒上，并將測(cè)序鑒定好的陽性質(zhì)粒重新命名為pHOH(圖2)，并雙酶切鑒定(圖3)。中間質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖如圖6所示。

步驟4.重組火雞皰疹病毒的構(gòu)建和純化

(1)rHVT-GFP感染細(xì)胞DNA的制備

原代和次代CEF細(xì)胞按常規(guī)方法制備，在每瓶T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶的次代CEF中接種105空斑形成單位(PFU)的重組rHVT-GFP病毒株、培養(yǎng)3-5天、等80％細(xì)胞產(chǎn)生典型的細(xì)胞病變后收獲細(xì)胞、按照傳統(tǒng)的酚氯仿方法提取HVT基因組。

(2)轉(zhuǎn)移載體pCMHA和rHVT-GFP基因組DNA共轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞

用QIAprep Spin MiniPrep Kit(QIAGEN)抽提轉(zhuǎn)移載體pHOH質(zhì)粒DNA。CEF按常規(guī)方法制備，在開始轉(zhuǎn)染試驗(yàn)1h前制備次代CEF，每個(gè)60mm培養(yǎng)皿鋪3x10⁶細(xì)胞，于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。

在無菌的指形管中依次加入以下試劑：

無菌超純水 194μL

rHVT-GFP DNA 5μg

轉(zhuǎn)移載體pHOH質(zhì)粒 1μg

TE 補(bǔ)足至25μL

同時(shí)需設(shè)不加轉(zhuǎn)移載體pCMGFP質(zhì)粒的HVT對(duì)照組，體系如下：

無菌超純水 194μL

rHVT-GFP DNA 5μg

TE 補(bǔ)足至25μL

混勻上述體系后，從管底緩慢加入31μL 2mol/L CaCl2溶液和250μL 2xHBSP溶液(42mmol/L HEPES、1.4mmol/L Na2HP04、274mmol/L NaCl、5mmol/L KCI、pH7.05的6mmol/L葡萄糖)，用吸管輕輕從管底吹出數(shù)個(gè)氣泡，室溫靜置30min，形成CaP04-DNA混合物。向每個(gè)鋪有次代CEF細(xì)胞的60mm培養(yǎng)皿中加入500μL CaP04-DNA復(fù)合物，輕輕搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄掉培養(yǎng)基，每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入2mL的甘油休克。

2.5ml甘油休克液的體系按如下：

無菌超純水 0.9mL

甘油 0.35mL

2xHBSP 1.25mL

混勻上述體系后作用1min后棄掉休克液，用維持液(V)培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，棄掉洗滌液，加入含4％胎牛血清的生長(zhǎng)液(G)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)5-7d后用倒置熒光顯微鏡觀察。

(3)重組病毒rHOH的篩選和純化

將轉(zhuǎn)染后的CEF用倒置熒光顯微鏡觀察，標(biāo)記出不帶有綠色熒光的病毒空斑。棄掉培養(yǎng)基，用帶有少許胰酶的吸管刮取病毒空斑，轉(zhuǎn)移至10mL生長(zhǎng)液(G)培養(yǎng)基中進(jìn)行稀釋，每一個(gè)病毒空斑接種一塊已鋪次代CEF細(xì)胞的96孔板，每孔接種l00μL稀釋的病毒空斑，置于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。重復(fù)上述步驟，直到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上所有的病毒空斑都不帶有綠色熒光，并且組成每個(gè)病毒空斑的細(xì)胞都不帶有熒光，說明重組病毒純化完全，將該重組病毒命名為rHOH。同源重組的方法示意見圖4。

步驟5.重組火雞皰疹病毒的鑒定

間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)rHOH對(duì)外源抗原的表達(dá)：以rHOH感染次代CEF細(xì)胞，3-5天形成病毒空斑；用冷甲醇固定細(xì)胞30分鐘，PBS洗滌3次；加工作濃度的抗AIV HA多克隆抗體(H7血清)，37℃作用1小時(shí)，PBS洗滌2-3次；加工作濃度的抗雞IgG/lgM熒光單抗，37℃作用1小時(shí)，用PBS洗滌2-3次；置熒光鏡下觀察，結(jié)果表明組成病毒空斑的所有細(xì)胞均帶熒光(圖5)。轉(zhuǎn)染、同源重組以及篩選和鑒定的示意圖如圖7所示。

SEQUENCE LISTING

<110> 揚(yáng)州大學(xué)

<120> 表達(dá)H7N9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的重組火雞皰疹病毒株rHOH及構(gòu)建方法

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1683

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaacacac agatcctggt gttcgccctg attgctatca ttcccactaa tgctgacaag 60

atctgcctgg ggcaccacgc agtgagcaac ggcaccaaag tgaataccct gacagagaga 120

ggagtggaag tggtgaacgc aactgagacc gtggaaagga ctaatatccc tcgcatttgc 180

agcaagggga agaaaaccgt ggatctgggc cagtgcggac tgctggggac aatcactggc 240

ccccctcagt gcgaccagtt cctggagttt agcgctgatc tgatcattga gagaagggaa 300

ggatccgacg tgtgctaccc tgggaagttc gtgaacgagg aagcactgcg gcagatcctg 360

agagagagcg gcggaattga taaagaagcc atggggttta cttactccgg catcagaacc 420

aatggagcaa ccagcgcatg caggaggtcc gggagctcct tctacgccga gatgaagtgg 480

ctgctgagca acaccgacaa tgccgctttt ccccagatga ctaagagcta caaaaacacc 540

agaaaatccc ctgccctgat cgtgtggggc attcaccaca gcgtgtccac agctgaacag 600

actaagctgt acggaagcgg gaacaaactg gtgacagtgg gaagctccaa ttaccagcag 660

agcttcgtgc catccccagg agcaaggcca caggtgaacg gactgagcgg ccgcatcgac 720

tttcactggc tgatgctgaa ccctaatgat accgtgacat tcagctttaa tggcgctttc 780

atcgcaccag accgggcttc ctttctgaga ggcaagagca tgggaattca gtccggggtg 840

caggtggacg caaactgcga gggagattgc taccacagcg ggggcacaat catttccaac 900

ctgccattcc agaatatcga tagcagggca gtgggaaagt gcccaagata cgtgaaacag 960

cgctccctgc tgctggctac tggaatgaag aacgtgcctg agatcccaaa aggccgggga 1020

ctgttcggcg ctatcgcagg atttattgag aacgggtggg aaggcctgat tgacggatgg 1080

tacgggttta gacaccagaa tgctcagggg gagggcacag cagccgacta caagagcact 1140

cagtccgcaa tcgatcagat taccggaaag ctgaacaggc tgatcgaaaa aacaaatcag 1200

cagttcgagc tgattgacaa cgaatttaat gaggtggaaa aacagatcgg gaacgtgatt 1260

aattggaccc gcgatagcat cacagaagtg tggtcctaca acgccgagct gctggtggct 1320

atggaaaatc agcacaccat tgacctggcc gatagcgaga tggacaagct gtacgaaaga 1380

gtgaaaaggc agctgcgcga gaacgctgag gaagatggaa ccgggtgctt cgaaatcttt 1440

cacaagtgcg atgacgattg catggcaagc attaggaaca atacatacga tcactccaaa 1500

taccgggagg aagccatgca gaacagaatc cagattgacc ctgtgaagct gagctccggg 1560

tacaaagatg tgatcctgtg gttcagcttt ggcgcatcct gcttcatcct gctggccatt 1620

gtgatgggcc tggtgtttat ttgcgtgaag aacggaaata tgcgctgcac aatctgcatt 1680

taa 1683

<210> 2

<211> 742

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atcgttttgc ccaaccctcg aatacggctt tatatttcag tgtggaaaat gtaggcctcc 60

tgcctcactt gaaggaagaa atggcacgat ttatgttaca gtgcaacaac acatcaagtt 120

ggataataag taaatttagg gggttttacg attttggtgg agtggataat ataaccaccg 180

cacatagaat ggcatggaaa tatatacgag agttgatttt ggcgactgcc ctttttgcat 240

ccgtgttcaa atgtggcgat ttgcaggtgt gtcgtgccga tggcttacag ctaacattgg 300

ggggggagta catttgggag gatggagtat atctgacata cgagaccgat tgtcctctcg 360

tagcacttat cgggtgtagg gcttatctaa cccacaatca atccccgacc gttctcgttg 420

acacggatgt tttttccttg ctttattcta ttttgcagtt tatggctccc gctacggcgg 480

atcagttacg atcggatcgg tttagtaata gccacaccca caattgacct aggtcaatat 540

cgttaggact ttagtatttt gattcatacg gtcggtggaa ctcatgctta tgactcctac 600

aatgaagtac tttaatcggt ctttatttat ttttctcacc ccaatcttat ccatcgcgac 660

ctcagaaatt aaattaccaa atgtgacagc gcgagaaatt gtttcgggca tacagctatc 720

cgaagacgag acgacatttt ac 742

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gatatcattg ttcaatcatg atgtcca 27

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gctagcgagt tccaccgacc gtatga 26