一種重組微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種芽孢桿菌的重組微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶酶基因及其表達(dá)，屬于食品工業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】。將來自芽孢桿菌的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因克隆分離后，構(gòu)建了含有該基因的乳酸乳球菌重組表達(dá)載體spNZ8048-Tgase，并在乳酸乳球菌N9800菌株中獲得了表達(dá)，將該重組乳酸乳球菌命名為L.lactis；表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過分離純化后，得到純度為90%左右的重組谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，活性達(dá)到2.2U/mL，高于原始菌株2倍以上。本發(fā)明利用乳酸乳球菌生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，具有操作簡單，產(chǎn)酶活性較高，生產(chǎn)成本低，安全性好，表達(dá)的酶易于分離純化等優(yōu)點，為谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的生產(chǎn)提供一條切實可行的途徑。
【專利說明】一種重組微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域及蛋白質(zhì)表達(dá)領(lǐng)域，尤其涉及谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原基因在乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)中的可溶性表達(dá)，具體為一種重組芽孢桿菌的微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]畜產(chǎn)品加工業(yè)是聯(lián)結(jié)畜牧生產(chǎn)與人民生活需要的重要產(chǎn)業(yè)。一方面，隨畜牧業(yè)的快速發(fā)展，我國畜產(chǎn)品呈現(xiàn)出供需平衡并有剩余的特點，但畜產(chǎn)品加工率只有5%左右，遠(yuǎn)低于發(fā)達(dá)國家的60%~70%，畜產(chǎn)品加工業(yè)的嚴(yán)重滯后，制約了畜牧業(yè)的快速、高效發(fā)展。另一方面，隨人們經(jīng)濟(jì)收入的增加、生活水平的提高、膳食結(jié)構(gòu)的優(yōu)化及生活節(jié)奏的加快，對工業(yè)化食品特別是肉類、乳類等畜產(chǎn)品加工制品(多樣化、方便化、營養(yǎng)化、安全化、個性化) 的需求量不斷增加。另外，畜產(chǎn)品加工業(yè)作為畜牧業(yè)面向消費市場的后續(xù)加工產(chǎn)業(yè)，為增加產(chǎn)品附加值、農(nóng)民就業(yè)機(jī)會及農(nóng)民收入提供了途徑。因此，大力發(fā)展畜產(chǎn)品加工業(yè)對保障畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展、人們生活質(zhì)量的提高及帶動農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民致富具有重要意義。
[0003]為提高加工畜產(chǎn)品的風(fēng)味、口感、質(zhì)地及營養(yǎng)價值，添加多種食品增味劑是畜產(chǎn)品加工過程中必不可少的環(huán)節(jié)。目前，我國批準(zhǔn)許可使用的食品增味劑主要有L -谷氨酸鈉、 5’ -鳥苷酸二鈉、5’ -肌苷酸二鈉、5’ -呈味核苷酸二鈉、琥珀酸二鈉和L-丙氨酸、甘氨酸以及植物水解蛋白、動物水解蛋白、酵母抽提物等化學(xué)增味劑。這些化學(xué)增味劑雖然能夠有效改善食品風(fēng)味，但其中的不少增味劑是采用化學(xué)方法進(jìn)行生產(chǎn)的，這往往會給產(chǎn)品品質(zhì)帶來一些不好的影響，如利用酸水解法制取水解植物蛋白時，會產(chǎn)生1-氯丙二醇、1，3- 二氯丙醇等致癌物，這嚴(yán)重影響了食品安全和消費者身體健康。隨著生物技術(shù)等相關(guān)學(xué)科的飛速發(fā)展，利用生物技術(shù)如植物組織培養(yǎng)法、微生物發(fā)酵法、酶轉(zhuǎn)化法等方法生產(chǎn)增味劑是獲得天然風(fēng)味物質(zhì)的有效途徑，因而生物技術(shù)在增味劑的生產(chǎn)中將會得到越來越廣泛的應(yīng)用。隨之而來的開發(fā)安全、經(jīng)濟(jì)、高效的增味劑用于動物加工產(chǎn)品的問題是迫切需要解決的。
[0004]谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(transglutaminase簡稱TGase),又稱轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶,能催化?；磻?yīng)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間或蛋白質(zhì)分子與氨基酸分子間發(fā)生共價交 聯(lián)，生成網(wǎng)絡(luò)狀的超大蛋白質(zhì)分子，進(jìn)而發(fā)生凝膠，以此改善食品的品質(zhì)、口味，提高食品的強度和穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)的化學(xué)增味劑相比，新型增味劑谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶具有以下優(yōu)點:(1)提高蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值，生產(chǎn)出滿足人們需求的新型蛋白食品；(2)本身是一種蛋白質(zhì)，可被人體內(nèi)的酶降解和消化，具有安全性和營養(yǎng)性；(3)采用酶法修飾對食品進(jìn)行處理，具有安全、 快速、專一性強、對食品營養(yǎng)無破壞，而且對食品的色、香、味以及口感不產(chǎn)生副作用；(4) 可以廣泛的用于面制品、乳制品、肉制品、水產(chǎn)品等各個領(lǐng)域，可替代有致癌作用的強筋劑溴酸鉀，可部分替代硝酸鹽、亞硝酸鹽等穩(wěn)定劑，延長保質(zhì)期；(5)由食品級微生物產(chǎn)生，可以直接將發(fā)酵液添加到食品中或是提純后添加，應(yīng)用較為方便。
[0005]1989年，Ando和Motoki等人首先報道了微生物發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的研究情況。1993年日本味之素公司和天野公司已成功利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)該酶制劑，投入市場獲得了巨大的經(jīng)濟(jì)效益，2000年日本谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶相關(guān)的食品銷售額達(dá)2000億日元。肉類加工等行業(yè)方面，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶在國外應(yīng)用較多，而國內(nèi)相對應(yīng)用較少，其加工以傳統(tǒng)方式為主，這不但影響產(chǎn)品的美觀，還影響到產(chǎn)品的質(zhì)量。隨著我國經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，人民生活水平的不斷提高，人們對新型食品有更高的要求，而作為安全、健康的新型、高效食品添加劑和酶制劑產(chǎn)品，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶可以在食品加工等多個領(lǐng)域發(fā)揮積極的作用，并產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益。
[0006] 現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，為從微觀分子水平改造基因序列，生產(chǎn)出高效、安全、低成本的天然食品增味劑提供了可能，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建基因工程菌來生產(chǎn)TGase是新的研究領(lǐng)域。目前，編碼TGase的完整基因和TGase蛋白質(zhì)氨基酸順序已經(jīng)被克隆和測序，他們得到的TGase酶活水平很低，遠(yuǎn)不能達(dá)到工業(yè)化的水平；微生物來源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，因其生產(chǎn)不受季節(jié)和原料限制，是谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶家族中最有可能進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用的一種，盡管有多種微生物自然狀態(tài)下能產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，但大多數(shù)的產(chǎn)酶量不高；而通過常規(guī)誘變育種技術(shù)進(jìn)行育種，耗時費力，又很難篩選到產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高產(chǎn)菌株，這就造成了實際生產(chǎn)成本較高，限制了該酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明解決上述問題是運用分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程技術(shù)，將微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因克隆至大腸桿菌，然后通過誘導(dǎo)基因高效率表達(dá)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，從而提高該酶的產(chǎn)量和降低該酶的生產(chǎn)成本。具體的技術(shù)方案如下:
[0008]1.首先提供一種產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶細(xì)菌的分離和谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的克隆的方法:提取芽孢桿菌基因組DNA后，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增出谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶全長基因;
[0009]2.提供一種谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因乳酸乳球菌表達(dá)載體構(gòu)建的方法:主要是利用乳酸乳球菌表達(dá)載體spNZ8048進(jìn)行谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的表達(dá)；
[0010]3.提供重組谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶分離純化的方法，主要是利用乙醇沉淀和陽離子交換柱的方法獲得高純度的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，進(jìn)而進(jìn)行谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在乳酸乳球菌中的表達(dá)。
[0011]上述技術(shù)方案的進(jìn)一步設(shè)置如下:
[0012]所述的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的獲取步驟為:(1)提取芽孢桿菌基因組DNA ;(2)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的PCR擴(kuò)增；(3) PCR產(chǎn)物的回收純化；(4)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的T/A克?。?5)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因雙脫氧終止法雙向測序。
[0013]所述的微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因在乳酸乳球菌中表達(dá)的具體步驟為:(1)構(gòu)建表達(dá)載體；(2)重組谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的分離純化，分離純化方法為:加入終濃度約為IOng/mL的nisin誘導(dǎo)表達(dá)2~3h后，收集發(fā)酵液于4°C冷凍離心，上清液采用乙醇沉淀法進(jìn)行分離純化，得到的沉淀蛋白通過陽離子交換柱，利用buffer A (含O~lmol/L NaCl)進(jìn)行梯度洗脫，再通過測定酶活性確認(rèn)純化結(jié)果。
[0014]本發(fā)明所獲得的重組芽孢桿菌的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶原基因的長度是738bp，用DNAtools5.1分析，該基因編碼為246個氨基酸組成的成熟肽，理論分子量為28.5kDa，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶全長基因序列及編碼氨基酸序列如下:
[0015]
【權(quán)利要求】
1.一種重組微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶原基因，其特征在于，該基因長度是738bp，該基因編碼為246個氨基酸組成的成熟肽，理論分子量為28.5kDa，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶全長基因序列及編碼氨基酸序列如下:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種重組微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的制備方法，其特征是，包括以下步驟:A、產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶細(xì)菌的分離和谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的克?。籅、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因乳酸乳球菌表達(dá)載體構(gòu)建；C、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在乳酸乳球菌中的表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種重組微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的制備方法，其特征在于，所述的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的獲取步驟為:(I)提取芽孢桿菌基因組DNA ; (2)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的PCR擴(kuò)增；(3) PCR產(chǎn)物的回收純化；(4)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的T/A克??；(5)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因雙脫氧終止法雙向測序。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種重組微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的制備方法，其特征在于，所述的微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因在乳酸乳球菌中表達(dá)的具體步驟為:(I)構(gòu)建表達(dá)載體；(2)重組谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的分離純化。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種重組微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的制備方法，其特征在于，所述的重組谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的分離純化方法為:加入終濃度約為10ng/mL的nisin誘導(dǎo)表達(dá)2~3h后，收集發(fā)酵液于4°C冷凍離心，上清液采用乙醇沉淀法進(jìn)行分離純化，得到的沉淀蛋白通過陽離子交換柱，利用buffer A進(jìn)行梯度洗脫，再通過測定酶活性確認(rèn)純化結(jié)果。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種重組微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的制備方法，其特征在于:所述的 buffer A 含 0 ~lmol/L NaCl。`
【文檔編號】C12N15/74GK103555739SQ201310504755
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月23日
【發(fā)明者】胡春霞 申請人:紹興文理學(xué)院元培學(xué)院