用于鑒定小麥面粉色澤相關(guān)基因的多重pcr體系的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于鑒定或輔助鑒定面粉色澤相關(guān)基因的PCR體系及其應用。本發(fā)明所提供的PCR體系中的引物對組為引物對組A和引物對組B這兩個個引物對組中，包括引物對A在內(nèi)的至少一個引物對組；所述引物對組A由引物對1（序列1和序列2）和引物對2（序列3和序列4）組成；所述引物對組B由引物對3（序列5和序列6）、引物對4（序列7和序列8）和引物對5（序列9和序列10）組成。本發(fā)明所提供的引物對組各引物間不存在抑制和錯配，實現(xiàn)了相同溫度一次PCR完成一組基因的鑒別，且結(jié)果可靠、特異性強，耗時短。本發(fā)明提供一種更全面的快速評價小麥色澤品質(zhì)的方法，并為小麥色澤品質(zhì)育種提供參考。
【專利說明】用于鑒定小麥面粉色澤相關(guān)基因的多重PCR體系
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及一種用于鑒定或輔助鑒定面粉色澤相關(guān)基因的PCR體系及其應用，特別涉及一種用于鑒定或輔助鑒定待測新疆冬小麥的面粉色澤相關(guān)基因如TaZds-Dl和Ppo-Al的多重PCR引物對組、試劑盒及其應用。
【背景技術(shù)】[0002]小麥面制食品作為我國人民最重要的主食之一，為我國以面食為主地區(qū)的人民提供50-80%以上的能量來源。隨著社會生活水平不斷提高，人們對小麥面制品品質(zhì)的要求越來越高，品質(zhì)育種也越來越受到重視。中國作為小麥最大的生產(chǎn)國和消費國，每年僅用來生產(chǎn)面條的小麥量約占小麥總消費量的40%。而面條、饅頭、餃子等我國傳統(tǒng)的蒸煮類面制食品，色澤越白越受到我國消費者青睞。因此，在我國傳統(tǒng)面制品的感官評價體系中，面制品的色澤占很大的比例，越白評分越高。然而，目前我國主栽小麥品種的面粉平均白度較低(74.8)，不能滿足市場和消費者對面粉白度(80.0以上)的要求。在2005年前，大多數(shù)面粉廠為滿足消費者對面粉白度的要求，向面粉中添加過氧化苯甲酰(ΒΡ0)。但BPO會破壞營養(yǎng)物質(zhì)且對人類健康構(gòu)成威脅，在國家最新修訂的小麥粉標準中，已明確規(guī)定禁止使用ΒΡ0。因此制訂育種目標，選育出自然白的小麥具有重要意義。同時，亮黃色的面粉也有一定的消費量，如黃堿面條、烏冬面、意大利面等也很受歡迎。因此，根據(jù)不同的加工目的，分別需要選育適合加工高白度或亮黃色面粉的小麥新品種。[0003]除了環(huán)境、增白劑、加工方式和栽培措施等外，小麥面粉及面制品顏色的形成主要受色素類物質(zhì)和氧化還原酶類等遺傳物質(zhì)的影響。色素類物質(zhì)主要包括黃色素(Yellowpigment, YP)和棕色素(Brown pigment),黃色素主要由類胡蘿卜素(Carotenoid)和類黃酮(Flavonoid)組成,面粉中的氧化酶類主要包括多酹氧化酶(Polyphenol oxidase, PPOXj^肪氧化酶(Lipoxygenase, L0X)和過氧化物酶(Peroxidase, POD)。YP含量、LOX及PPO活性對面粉及面制品的色澤有重要影響。YP含量與面團黃度的相關(guān)系數(shù)高達0.8-0.9 ；L0X可催化多不飽和脂肪酸加氧形成過氧化物，反應所釋放的氧自由基進一步氧化色素分子，使面粉變白；ΡΡ0在氧分子的參與下可催化單酚類物質(zhì)最終變?yōu)檠鹾硝?，生成褐色物質(zhì)，決定面粉及面制品加工和貯存過程中色澤褐變的50-70%。當需要自然白小麥時，應選擇含低YP含量基因型、高LOX活性基因型及低PPO活性基因型的小麥品種(系)。[0004]多重PCR是一種高效、低成本的檢測方法，已成為研究的熱點。雖然已經(jīng)報道了數(shù)套與小麥面粉色澤基因相關(guān)的多重PCR體系，但僅涉及到PPO活性基因的Ppo-Al和Ppo-Dl位點，或PSY活性基因的Psy-Al位點，還未見到檢測PSY活性基因的Psy-Bl位點、ZDS活性基因的TaZds-Al和TaZds-Dl位點，以及LOX活性基因TaLox-Bl位點的多重PCR體系的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定面粉色澤相關(guān)基因的PCR體系及其應用，特別涉及一種用于鑒定或輔助鑒定待測新疆冬小麥的面粉色澤相關(guān)基因如TaZds-Dl和Ppo-Al的多重PCR引物對組、試劑盒及其應用。
[0006]本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定待測小麥拉面品質(zhì)性狀相關(guān)基因的多重PCR引物對組為如下al)或a2)的引物對組:
[0007]a I)由引物對組A和引物對組B組成的引物對組；
[0008]a2)引物對組A;
[0009]所述面粉色澤相關(guān)基因為TaZds-Dl基因、Ρρο-Al基因、Psy-Al基因、TaLox-ΒΙ基因和Ppo-Dl基因。
[0010]所述引物對組A由特異于所述TaZds-Dl基因的一個引物對，和特異于所述Ppo-Al基因的一個引物對組成；具體的，所述特異于所述TaZds-Dl基因的一個引物對為序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對I ;所述特異于所述Ppo-Al基因的一個引物對為序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對2 ；
[0011]所述引物對組B由特異于所述Psy-Al基因的一個引物對、特異于所述TaLox-Bl基因的一個引物對，和特異于所述Ppo-Dl基因的一個引物對組成；具體的，所述特異于所述Psy-Al基因的一個引物對為序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對3 ;所述特異于所述TaLox-Bl基因的一個引物對為序列表中序列7和序列8所不的兩條單鏈DNA組成的引物對4 ;所述特異于所述Ppo-Dl基因的一個引物對為序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的引物對5。
[0012]其中，序列I由21個核苷酸組成；序列2由23個核苷酸組成；序列3由21個核苷酸組成；序列4由20個核苷酸組成；序列5由20個核苷酸組成；序列6由22個核苷酸組成；序列7由23個核苷酸組成；序列8由16個核苷酸組成；序列9由18個核苷酸組成?’序列10由20個核苷酸組成。
[0013]本發(fā)明中，所述TaZds-Dl基因涉及兩個等位基因，分別是TaZds-Dla和TaZds-Dlb ;所述Ppo-Al基因涉及兩個等位基因，分別是Ppo-Ala和Ppo-Alb ;所述Psy-Al基因涉及三個等位基因，分別是Psy-Ala、Psy-Alb和Psy-Alc ;所述TaLox-Bl基因涉及兩個等位基因，分別是TaLox-Bla和TaLox-Blb Jy^iPp0-Dl基因涉及兩個等位基因，分別是Ppo-Dla 和 Ρρο-Dlb。
[0014]所述引物對組A中每個引物對的兩條引物在PCR反應體系中等量使用，且所述引物對I和所述引物對2在PCR反應體系中的摩爾比為12:6。所述引物對組B中每個引物對的兩條引物在PCR反應體系中等量使用，且所述引物對3、所述引物對4和所述引物對5在PCR反應體系中的摩爾比為5:10:10。
[0015]具體的，所述引物對組A中，所述引物對I中的序列I和序列2所示的兩條DNA單鏈在所述PCR反應體系中的終濃度均為0.6 μ M ;所述引物對2中的序列3和序列4所不的兩條DNA單鏈在所述PCR反應體系中的終濃度均為0.3 μ Μ。所述引物對組B中，所述引物對3中的序列5和序列6所示的兩條DNA單鏈在所述PCR反應體系中的終濃度均為0.25 μ M ;所述引物對4中的序列7和序列8所示的兩條DNA單鏈在所述PCR反應體系中的終濃度均為0.5 μ M ;所述引物對5中的序列9和序列10所示的兩條DNA單鏈在所述PCR反應體系中的終濃度均為0.5μΜ。
[0016]含有所述引物對組的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護范圍。[0017]所述引物對組的制備方法也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0018]所述引物對組的制備方法，具體可包括將所述引物對組中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。
[0019]所述試劑盒的制備方法也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0020]所述試劑盒的制備方法，具體可包括如下步驟:將所述引物對組中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝后,與下述物質(zhì)中的至少一種包裝在同一試劑盒內(nèi):PCR反應緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP。
[0021]下述al)或a2)的方法也屬于本發(fā)明的保護范圍:
[0022]al)鑒定或輔助鑒定待測小麥含有TaZds-Dla和TaZds-Dlb這兩種基因中哪一種，含有Ppo-Ala和Ppo-Alb這兩種基因中哪一種，含有Psy-Ala或Psy-Alc基因還是含有Psy-Alb基因，含有TaLox-Bla和TaLox-Blb這兩種基因中哪一種，以及含有Ppo-Dla和Ppo-Dlb這兩種基因中哪一種；[0023]a2)鑒定或輔助鑒定待測小麥含有TaZds-Dla和TaZds-Dlb這兩種基因中哪一種，以及含有Ppo-Ala和Ppo-Alb這兩種基因中哪一種；
[0024]所述al)的方法包括下述(I)和(2)的步驟:
[0025]所述(I)為如下bl)和b2):
[0026]bl)以待測小麥的基因組DNA為模板，用所述引物對組中所述引物對組A進行PCR反應，所述PCR反應的退火溫度為62°C ；
[0027]在本發(fā)明中，所述PCR反應的程序具體為:95°C預變性5min ;95°C變性30s，62°C退火30s，72°C延伸70s，擴增反應進行34個循環(huán)；72°C延伸5min ;4°C，保溫結(jié)束。
[0028]b2)以待測小麥的基因組DNA為模板，用所述引物對組中所述引物對組B進行PCR反應，所述PCR反應的退火溫度為64°C ；
[0029]在本發(fā)明中，所述PCR反應的程序具體為:95°C預變性5min ;94°C變性lmin，64°C退火lmin，72°C延伸90s，擴增反應進行36個循環(huán)；72°C延伸8min ;4°C，保溫結(jié)束。
[0030](2)檢測步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測小麥含有TaZds-Dla和TaZds-Dlb這兩種基因中哪一種，含有Ρρο-Ala和Ppo-Alb這兩種基因中哪一種，含有Psy-Ala或Psy-Alc基因還是含有Psy-Alb基因，含有TaLox-Bla和TaLox-Blb這兩種基因中哪一種，以及含有Ppo-Dla和Ppo-Dlb這兩種基因中哪一種:
[0031]以所述引物對組A的進行PCR反應的產(chǎn)物中，若不含有大小為981bp的DNA片段，則所述待測小麥含有TaZds-Dla基因或候選含有TaZds-Dla基因；若含有大小為981bp的DNA片段，則所述待測小麥含有TaZds-Dlb基因或候選含有TaZds-Dlb基因；若含有大小為685bp的DNA片段，則所述待測小麥含有Ppo-Ala基因或候選含有Pp0-Ala基因；若含有大小為876bp的DNA片段，則所述待測小麥含有Ppo-Alb基因或候選含有Pp0-Alb基因；
[0032]以所述引物對組B的進行PCR反應的產(chǎn)物中，若含有大小為194bp的DNA片段，則所述待測小麥含有Psy-Ala或Psy-Alc基因或候選含有Psy-Ala或Psy-Alc基因(Psy-Alc基因極少)；若含有大小為231bp的DNA片段，則所述待測小麥含有Psy-Alb基因或候選含有Psy-Alb基因；若不含有大小為791bp的DNA片段，則所述待測小麥含有TaLox-Bla基因或候選含有TaLox-Bla基因；若含有大小為791bp的DNA片段，則所述待測小麥含有TaLox-Blb基因或候選含有TaLox-Blb基因；若含有大小為571bp的DNA片段，則所述待測小麥含有Ppo-Dla基因或候選含有Ppo-Dla基因；若不含有大小為571bp的DNA片段，則所述待測小麥含有Ppo-Dlb基因或候選含有Ppo-Dlb基因。
[0033]所述a2)的方法包括下述(3)和(4)的步驟:
[0034](3)以待測小麥的基因組DNA為模板，用所述引物對組中所述引物對組A進行PCR反應，所述PCR反應的退火溫度為62°C ；
[0035]在本發(fā)明中，所述PCR反應的程序具體為:95°C預變性5min ;95°C變性30s，62°C退火30s，72°C延伸70s，擴增反應進行34個循環(huán)；72°C延伸5min ;4°C，保溫結(jié)束。
[0036](4)檢測步驟(3)得到的PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測小麥含有TaZds-Dla和TaZds-Dlb這兩種基因中哪一種，以及含有Ppo-Ala和Ppo-Alb這兩種基因中哪一種: [0037]以所述引物對組A的進行PCR反應的產(chǎn)物中，若不含有大小為981bp的DNA片段，則所述待測小麥含有TaZds-Dla基因或候選含有TaZds-Dla基因；若含有大小為981bp的DNA片段，則所述待測小麥含有TaZds-Dlb基因或候選含有TaZds-Dlb基因；若含有大小為685bp的DNA片段，則所述待測小麥含有Ppo-Ala基因或候選含有Pp0-Ala基因；若含有大小為876bp的DNA片段，則所述待測小麥含有Ppo-Alb基因或候選含有Ppo-Alb基因。
[0038]在上述方法中，所述大小為981bp的DNA片段的核苷酸序列具體如序列表中序列
11所示；所述大小為685bp的DNA片段的核苷酸序列具體如序列表中序列12所示；所述大小為876bp的DNA片段的核苷酸序列具體如序列表中序列13所示；所述大小為194bp的DNA片段的核苷酸序列具體如序列表中序列14所示；所述大小為231bp的DNA片段的核苷酸序列具體如序列表中序列15所示；所述大小為791bp的DNA片段的核苷酸序列具體如序列表中序列16所示；所述大小為571bp的DNA片段的核苷酸序列具體如序列表中序列17所示。
[0039]在本發(fā)明的一個實施例中，用所述引物對組中的所述引物對組A進行PCR反應的反應體系中，作為模板的所述待測小麥的基因組DNA的量為100-200ng，dNTPs的終濃度為200 μ M0 PCR反應程序具體為:95°C預變性5min ;95°C變性30s，62 °C退火30s，72。。延伸70s，擴增反應進行34個循環(huán)；72°C延伸5min ;4°C，保溫結(jié)束。
[0040]在本發(fā)明的一個實施例中，用所述引物對組中的所述引物對組B進行PCR反應的反應體系中，作為模板的所述待測小麥的基因組DNA的量為100-200ng，dNTPs的終濃度為225 μ M，DNA聚合酶的量為1.5U。PCR反應程序具體為:95°C預變性5min ;94°C變性lmin，64°C退火lmin，72°C延伸90s，擴增反應進行36個循環(huán)；72°C延伸8min ;4°C，保溫結(jié)束。
[0041]本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育面粉白度提高的小麥品種的方法。
[0042]本發(fā)明所提供的培育面粉白度提高的小麥品種的方法，包括采用如下a) -e)中至少一種的小麥作為親本進行育種的步驟:
[0043]a)含有或候選含有TaZds-Dlb基因；
[0044]b)含有或候選含有Ppo-Alb基因；
[0045]c)含有或候選含有Psy-Alb基因；
[0046]d)含有或候選含有TaLox-Bla基因；
[0047]e)含有或候選含有Ppo-Dla基因。
[0048]從眾多小麥品種中選擇滿足a) -e)中至少一項的小麥的方法，即為上述“鑒定或輔助鑒定待測小麥含有TaZds-Dla和TaZds-Dlb這兩種基因中哪一種，含有Ppo-Ala和Ppo-Alb這兩種基因中哪一種，含有Psy-Ala或Psy-Alc基因還是含有Psy-Alb基因，含有TaLox-Bla和TaLox-Blb這兩種基因中哪一種，以及含有Ρρο-Dla和Ρρο-Dlb這兩種基因中哪一種”的方法。所選擇的小麥滿足上述a) -e)五項中的項數(shù)越多，表示所選擇的小麥越適合作為培育面粉白度提高的小麥品種時采用的親本，并且在同等條件下，對于b)和e)優(yōu)先選擇含有或候選含有Ppo-Alb基因的小麥品種作為親本。
[0049]在本發(fā)明中，所述待測小麥具體為如下小麥品種(系)中的至少一種:寧冬6號、周麥16、周麥17、西農(nóng)979、西農(nóng)88、陜354、小偃54、徐州25、西農(nóng)6028、西農(nóng)8727和西峰27。
[0050]本發(fā)明所提供的引物對組A或引物對組B的各引物對之間不存在相互抑制作用和錯配，檢測品種(系)的結(jié)果可靠、重復性好，成本低。本發(fā)明所提供的引物對組A或引物對組B均選用同樣的退火溫度，實現(xiàn)了相同溫度一次PCR完成一組基因的鑒別，且特異性強，檢測過程耗時短。本發(fā)明提供一種更全面的快速評價小麥色澤品質(zhì)的方法，并為小麥色澤品質(zhì)育種提供參考?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0051]圖1為實施例1中11份小麥品種(系)面粉色澤相關(guān)基因TaZds-Dl和Pp0-Al的PCR擴增結(jié)果。其中，Al和A2 (兩次重復)為TaZds-Dl基因的基因型單一 PCR檢測結(jié)果；BI和B2 (兩次重復)為Ppo-Al基因的基因型單一 PCR檢測結(jié)果；C為多重PCR擴增結(jié)果。其中，M:標準分子量DL2000 ；1:寧冬6號；2:周麥16 ；3:周麥17 ；4:西農(nóng)979 ；5:西農(nóng)88 ；6:陜 354 ；7:小偃 54 ；8:徐州 25 ；9:西農(nóng) 6028 ；10:西農(nóng) 8727 ；11:西峰 27。
[0052]圖2為實施例2中11份小麥品種(系)面粉色澤相關(guān)基因Psy-Al、TaLox-Bl和Ppo-Dl的PCR擴增結(jié)果。其中，Al和A2 (兩次重復)為Psy-Al基因的基因型單一 PCR檢測結(jié)果；B1和B2 (兩次重復)為Ppo-Dl基因的基因型單一 PCR檢測結(jié)果；C1和C2 (兩次重復)為TaLox-B I基因的基因型單一 PCR檢測結(jié)果；D為多重PCR擴增結(jié)果。其中，M:標準分子量DL2000 ；1:寧冬6號；2:周麥16 ；3:周麥17 ；4:西農(nóng)979 ；5:西農(nóng)88 ；6:陜354 ；7:小偃54 ；8:徐州25 ；9:西農(nóng)6028 ；10:西農(nóng)8727 ；11:西峰27。
[0053]圖3為對比例I中7份已知基因型小麥品種(系)面粉色澤相關(guān)基因TaZds-Dl和Ppo-Al的多重PCR擴增結(jié)果。其中，1、3:寧冬6號；2:西農(nóng)979 ；4:西農(nóng)88 ；5:周麥16 ；6:周麥 17 ；7:陜 354 ;8、9:徐州 25。
[0054]圖4為對比例3中5份已知基因型小麥品種(系)面粉色澤相關(guān)基因Ppo-Al、TaLox-Bl和Ppo-Dl的多重PCR擴增結(jié)果。其中，1:寧冬6號；2:陜354 ；3:西峰27 ；4:西農(nóng) 6028 ；5:西農(nóng) 979。
【具體實施方式】
[0055]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0056]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0057]實施例1、小麥面粉色澤相關(guān)基因TaZds-Dl和Ppo-Al的多重PCR檢測
[0058]本實施例的多重PCR引物對組由特異于TaZds-Dl基因的一個引物對，和特異于Pp0-Al基因的一個引物對組成；其中，所述特異于TaZds-Dl基因的一個引物對為序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對I ;所述特異于Ppo-Al基因的一個引物對為序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對2。
[0059]本實施例的多重PCR引物對組可同時檢測TaZds-Dl和Ppo-Al兩個基因位點的4種基因型 TaZds-Dla、TaZds-Dlb、Ppo-Ala 和 Ppo-Alb。含有 TaZds-Dla 基因的材料，PCR 擴增不出981bp (序列11)的一個條帶；含有TaZds-Dlb基因的材料，PCR擴增出981bp (序列
11)的一個條帶；含有Ppo-Ala基因的材料，PCR擴增出685bp (序列12)的一個條帶；含有Ppo-Alb基因的材料，PCR擴增出876bp (序列13)的一條帶。
[0060]一、小麥基因組的制備
[0061 ] 采用CTAB法對11份小麥品種(系)進行基因組DNA的提取，得到對應于11份小麥品種(系)的基因組DNA，作為拉面色澤相關(guān)基因TaZds-Dl和Pp0-Al多重PCR擴增的模板。其中，11份小麥品種(系)為寧冬6號、周麥16、周麥17、西農(nóng)979、西農(nóng)88、陜354、小偃54、徐州25、西農(nóng)6028、西農(nóng)8727和西峰27。這11個小麥品種(系)的TaZds-Dl和Ppo-Al基因的基因型詳見表3。
[0062]其中，西農(nóng)979、西農(nóng)88、陜354、小偃54、徐州25、西農(nóng)6028和西農(nóng)8727的Ppo-Al基因的基因型參見“葉石.陜西小麥籽粒PPO活性基因和YP含量基因的等位變異檢測和分布分析.西北農(nóng)林科技大學，2010年,碩士論文” 一文。
[0063]同時，本發(fā)明的發(fā)明人對以上11個小麥品種(系)的TaZds-Dl和Ppo-Al基因的基因型均經(jīng)過至少兩次各個位點的單一 PCR鑒定，具體如下:
[0064](I)以上11個小麥品種(系)的TaZds-Dl基因的基因型檢測參見“張彩英.小麥主要產(chǎn)量和品質(zhì)性狀的QTL鑒定及ZDS功能標記的開發(fā).河北農(nóng)業(yè)大學，2010年，博士論文”一文進行。以小麥基因組DNA為模板，采用YP2D-1標記引物(表2中序列I/序列2)進行單一 PCR擴增。結(jié)果顯示:小麥品種(系)周麥16、周麥17、西農(nóng)979、西農(nóng)88、陜354、小偃54、徐州25、西農(nóng)6028和西農(nóng)8727經(jīng)PCR擴增均未得到大小為981bp的目的條帶，表明其TaZds-Dl基因的基因型為TaZds-Dla。小麥品種(系)寧冬6號和西峰27經(jīng)PCR擴增得到大小為981bp的目的條帶，表明其TaZds-Dl基因的基因型為TaZds_Dlb。實驗重復至少兩次,結(jié)果一致。見圖1中Al和A2。
[0065](2)以上11個小麥品種(系)的Ppo-Al基因的基因型檢測參見“葉石.陜西小麥籽粒PPO活性基因和YP含量基因的等位變異檢測和分布分析.西北農(nóng)林科技大學，2010年，碩士論文”一文進行。以小麥基因組DNA為模板，采用PP018標記引物(表2中序列3/序列
4)進行單一 PCR擴增。結(jié)果顯示:小麥品種(系)寧冬6號、周麥16、周麥17、陜354和徐州25經(jīng)PCR擴增得到大小為685bp的目的條帶，表明其Ppo-Al基因的基因型為Pp0-Ala ;小麥品種(系)西農(nóng)979、西農(nóng)88、小偃54、西農(nóng)6028、西農(nóng)8727和西峰27經(jīng)PCR擴增得到大小為876bp的目的條帶,表明其Ppo-Al基因的基因型為Ppo-Alb。實驗重復至少兩次,結(jié)果一致。見圖1中BI和B2。
[0066]表111份小麥品種(系)面粉色澤相關(guān)基因TaZds-Dl和Ppo-Al的基因型
【權(quán)利要求】
1.用于鑒定或輔助鑒定待測小麥面粉色澤相關(guān)基因的多重PCR引物對組，所述面粉色澤相關(guān)基因為TaZds-Dl基因、Ppo-Al基因、Psy-Al基因、TaLox-Bl基因和Ρρο-Dl基因，其特征在于:所述多重PCR引物對組由引物對組A和引物對組B組成；所述引物對組A由特異于所述TaZds-Dl基因的一個引物對，和特異于所述Ppo-Al基因的一個引物對組成；所述引物對組B由特異于所述Psy-Al基因的一個引物對、特異于所述TaLox-Bl基因的一個引物對，和特異于所述Ppo-Dl基因的一個引物對組成； 所述引物對組A中，所述特異于所述TaZds-Dl基因的一個引物對為序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對I ;所述特異于所述Ppo-Al基因的一個引物對為序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對2 ； 所述引物對組B中，所述特異于所述Psy-Al基因的一個引物對為序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對3 ;所述特異于所述TaLox-Bl基因的一個引物對為序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的引物對4 ;所述特異于所述Ppo-Dl基因的一個引物對為序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的引物對5。
2.用于鑒定或輔助鑒定待測小麥面粉色澤相關(guān)基因的多重PCR引物對組，為權(quán)利要求1中的所述引物對組A。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的引物對組，其特征在于:所述特異引物對組A中每個引物對的兩條引物在PCR反應體系中等量使用，且所述引物對4和所述引物對5在PCR反應體系中的摩爾比為12:6 ;所述引物對組B中每個引物對的兩條引物在PCR反應體系中等量使用，且所述引物對3、所述弓丨物對4和所述引物對5在PCR反應體系中的摩爾比為5:10:10。
4.含有權(quán)利要求1-3中任一所述引物對組的試劑盒。
5.權(quán)利要求1-3中任一所述引物對組的制備方法，其特征在于:所述制備方法包括將權(quán)利要求1-3中任一所述引物對組中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。
6.權(quán)利要求4所述試劑盒的制備方法，包括如下步驟:將權(quán)利要求1-3中任一所述的引物對組中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝后，與下述物質(zhì)中的至少一種包裝在同一試劑盒內(nèi)=PCR反應緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP。
7.下述al)或a2)的方法: al)鑒定或輔助鑒定待測小麥含有TaZds-Dla和TaZds-Dlb這兩種基因中哪一種，含有Ppo-Ala和Ppo-Alb這兩種基因中哪一種，含有Psy-Ala或Psy-Alc基因還是含有Psy-Alb基因，含有TaLox-Bla和TaLox-Blb這兩種基因中哪一種，以及含有Ρρο-Dla和Ρρο-Dlb這兩種基因中哪一種； a2)鑒定或輔助鑒定待測小麥含有TaZds-Dla和TaZds-Dlb這兩種基因中哪一種，以及含有Ppo-Ala和Ppo-Alb這兩種基因中哪一種； 其特征在于:所述al)的方法包括下述(I)和(2)的步驟: 所述(I)為如下bl)和b2): bl)以待測小麥的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求1-3中任一所述的引物對組中所述引物對組A進行PCR反應，所述PCR反應的退火溫度為62°C ； b2)以待測小麥的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求1或3所述的引物對組中所述引物對組B進行PCR反應，所述PCR反應的退火溫度為64°C ； (2)檢測步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測小麥含有TaZds-Dla和TaZds-Dlb這兩種基因中哪一種，含有Ppo-Ala和Ppo-Alb這兩種基因中哪一種，含有Psy-Ala或Psy-Alc基因還是含有Psy-Alb基因，含有TaLox-Bla和TaLox-Blb這兩種基因中哪一種，以及含有Ppo-Dla和Ppo-Dlb這兩種基因中哪一種: 以所述引物對組A的進行PCR反應的產(chǎn)物中，若不含有大小為981bp的DNA片段，則所述待測小麥含有TaZds-Dla基因或候選含有TaZds-Dla基因；若含有大小為981bp的DNA片段，則所述待測小麥含有TaZds-Dlb基因或候選含有TaZds-Dlb基因；若含有大小為685bp的DNA片段，則所述待測小麥含有Ppo-Ala基因或候選含有Pp0-Ala基因；若含有大小為876bp的DNA片段，則所述待測小麥含有Ppo-Alb基因或候選含有Ppo-Alb基因； 以所述引物對組B的進行PCR反應的產(chǎn)物中，若含有大小為194bp的DNA片段，則所述待測小麥含有Psy-Ala或Psy-Alc基因或候選含有Psy-Ala或Psy-Alc基因；若含有大小為231bp的DNA片段，則所述待測小麥含有Psy-Alb基因或候選含有Psy-Alb基因；若不含有大小為791bp的DNA片段，則所述待測小麥含有TaLox-Bla基因或候選含有TaLox-Bla基因；若含有大小為791bp的DNA片段，則所述待測小麥含有TaLox-Blb基因或候選含有TaLox-Blb基因；若含有大小為571bp的DNA片段，則所述待測小麥含有Pp0-Dla基因或候選含有Ppo-Dla基因；若不含有大小為571bp的DNA片段，則所述待測小麥含有Pp0-Dlb基因或候選含有Ppo-Dlb基因； 所述a2)的方法包括下述(3)和(4)的步驟: (3)以待測小麥的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求1-3中任一所述的引物對組中所述引物對組A進行PCR反應，所述PCR反應的退火溫度為62°C ； (4)檢測步驟(3)得到的P CR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測小麥含有TaZds-Dla和TaZds-Dlb這兩種基因中哪一種，以及含有Ppo-Ala和Ppo-Alb這兩種基因中哪一種: 以所述引物對組A的進行PCR反應的產(chǎn)物中，若不含有大小為981bp的DNA片段，則所述待測小麥含有TaZds-Dla基因或候選含有TaZds-Dla基因；若含有大小為981bp的DNA片段，則所述待測小麥含有TaZds-Dlb基因或候選含有TaZds-Dlb基因；若含有大小為685bp的DNA片段，則所述待測小麥含有Ppo-Ala基因或候選含有Pp0-Ala基因；若含有大小為876bp的DNA片段，則所述待測小麥含有Ppo-Alb基因或候選含有Ppo-Alb基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于:所述大小為981bp的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列11所示；所述大小為685bp的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列12所示；所述大小為876bp的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列13所示；所述大小為194bp的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列14所示；所述大小為231bp的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列15所示；所述大小為791bp的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列16所示；所述大小為571bp的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列17所示。
9.一種培育面粉白度提高的小麥品種的方法，包括采用通過權(quán)利要求7的方法鑒定得到的如下a)_e)中至少一種的小麥作為親本進行育種的步驟: a)含有或候選含有TaZds-Dlb基因； b)含有或候選含有Ppo-Alb基因； c)含有或候選含有Psy-Alb基因； d)含有或候選含有TaLox-Bla基因；e)含有或候選含有Ppo-D`la基因。
【文檔編號】C12N15/11GK103571951SQ201310506926
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月24日
【發(fā)明者】楊松杰, 張曉科, 張鈺玉, 王曉龍 申請人:安康學院