用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的lamp引物及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的LAMP引物及應(yīng)用。本發(fā)明所提供的引物為引物組，由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成；或由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4組成；所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。本發(fā)明利用以上引物，通過在反應(yīng)液加入SYBR?Green?I熒光染料，建立了IHNV?RT-LAMP可視化檢測方法，且該方法靈敏度高、特異性好、成本低、不依賴任何專門的儀器設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測，這對鮭鱒魚魚苗的引種、無特定病原體種魚的培育，以及鮭鱒魚無公害健康養(yǎng)殖均有重要意義。
【專利說明】用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的LAMP引物及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的LAMP引物及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]傳染性造血器官壞死病(infectioushaematopoietic necrosis, IHN)是由傳染性造血器官壞死病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus, IHNV)引起的一種常見的危害鮭鱒魚類的急性病毒性傳染病。自從上世紀(jì)50年代在美國首次暴發(fā)以來，IHNV已經(jīng)擴(kuò)散至歐洲、澳洲、亞洲等十余個國家。IHNV可造成鮭鱒魚魚苗近100%的死亡率，對世界的鮭鱒魚養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，實(shí)用、快速、靈敏、準(zhǔn)確的IHNV檢測技術(shù)的建立在IHN早期診斷、水產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量監(jiān)督、疫情監(jiān)測等方面具有重要的意義。目前，世界動物衛(wèi)生組織推薦的IHN的幾種診斷方法包括細(xì)胞培養(yǎng)分離方法、免疫學(xué)方法(中和試驗(yàn)法、間接熒光抗體法和ELISA法)和分子生物學(xué)方法(PCR法、PCR探針和序列測定法)。PCR方法是目前最常用的快速檢測方法，已經(jīng)有以PCR技術(shù)為依托的商業(yè)化的IHNV檢測試劑盒，這些檢測試劑盒需要專門的儀器或者對PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳與紫外線分析才能確定檢測結(jié)果。
[0003]環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(loopmediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)是2000年Notomi等在PCR基礎(chǔ)上創(chuàng)建的另外一種形式的核酸擴(kuò)增技術(shù)。與PCR技術(shù)相比，兩者最大的差異在于靶基因引物的設(shè)計上。其中，PCR只使用一對與靶基因兩端序列互補(bǔ)的上下游引物，而LAMP 則針對靶基因的6個不同區(qū)域，設(shè)計4種特異引物一內(nèi)側(cè)引物對和外側(cè)引物對，必要時再加上環(huán)形引物對，對靶基因進(jìn)行擴(kuò)增，6個區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，因此其特異性和敏感性均比PCR更高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的一個目的是提供一種用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增引物組。
[0005]本發(fā)明所提供的用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增引物組，具體可為引物組A或引物組B ;所述引物組A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成；所述引物組B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4組成；
[0006]所述引物I (F3)、所述引物2 (B3)、所述引物3 (FIP)、所述引物4 (BIP)、所述引物5 (Loop-F)和所述引物6 (Loop-B)的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。
[0007]所述引物組A中所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩爾比可為1:1:8:8:4:4。所述引物組B中所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩爾比可為1:1:8:8。
[0008]在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述引物I (F3)和所述引物2 (B3)在環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)體系中的終濃度均為0.2 PM;所述引物3 (FIP)和所述引物4 (BIP)在環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)體系中的終濃度均為1·6μΜ;所述引物5 (Loop-F)和所述引物6 (Loop-B)在環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)體系中的終濃度均為O. 8 μ Μ。
[0009]所述引物組中，引物I (F3)和引物2 (Β3)組成外側(cè)引物對；引物3 (FIP)和引物4 (BIP)組成內(nèi)側(cè)引物對；引物5 (Loop-F)和引物6 (Loop-B)組成環(huán)形引物對。序列I由20個核苷酸組成，序列2由20個核苷酸組成，序列3由45個核苷酸組成，序列4由46個核苷酸組成，序列5由18個核苷酸組成，序列6由20個核苷酸組成。
[0010]本發(fā)明的又一個目的是提供一種用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增試劑。
[0011]本發(fā)明所提供的用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增試劑，具體可包括反轉(zhuǎn)錄酶、鏈置換型DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和所述引物組。
[0012]當(dāng)所述引物組為所述引物組A時，所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg2+、所述反轉(zhuǎn)錄酶和所述鏈置換型DNA聚合酶在所述擴(kuò)增試劑中的配比可為 5pmol ：5pmol ：40pmol ：40pmol ：20pmol ：20pmol ：25mmol ：5nmol ： IOU ：8U0
[0013]當(dāng)所述引物組為所述引物組B時，所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物
4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述反轉(zhuǎn)錄酶和所述鏈置換型DNA聚合酶在所述擴(kuò)增試劑中的配比可為 5pmol ：5pmol ：40pmol ：40pmol ：25mmol ：5nmoI ： IOU :8U。
[0014]在本發(fā)明中，所 述反轉(zhuǎn)錄酶具體可為AMV反轉(zhuǎn)錄酶；所述鏈置換型DNA聚合酶具體可為Bst2. ODNA聚合酶(如NEB公司產(chǎn)品目錄號為M0537S的產(chǎn)品）或Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段。
[0015]在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述試劑具體由所述AMV反轉(zhuǎn)錄酶、所述Bst2. ODNA聚合酶、所述dNTPs、10X等溫擴(kuò)增緩沖液和所述引物組組成；其中，所述IOX等溫擴(kuò)增緩沖液的ρΗ8· 8，溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下：Tris-HC120mM、KC150mM、（NH4)2SO4IOmM、MgS042mM、Tween-20 體積分?jǐn)?shù) O. 1%。
[0016]所述AMV反轉(zhuǎn)錄酶為Promega公司產(chǎn)品；所述Bst2. ODNA聚合酶為New EnglandBiolabs公司產(chǎn)品。
[0017]在實(shí)際使用過程中，上述試劑的各組分在(逆轉(zhuǎn)錄）環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)體系中的終濃度為：所述引物I和所述引物2各0.2 μ mol/L;所述引物3和所述引物4各1.6 μ mol/L ;所述引物5和所述引物6各O. 8ymol/L ;所述dNTPslmmol/μ L ;所述AMV反轉(zhuǎn)錄酶O. 4U/μ L ;所述Bst2. ODNA聚合酶O. 32U/ μ L ;所述IOX等溫擴(kuò)增緩沖液體積分?jǐn)?shù)10%。
[0018]本發(fā)明的還一個目的是提供一種用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增試劑盒。
[0019]本發(fā)明所提供的用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增試劑盒，含有所述擴(kuò)增試劑和熒光顯色劑。
[0020]所述熒光顯色劑為熒光染料SYBR Green I (如Invitrogen公司產(chǎn)品）。
[0021]如下a)或b)的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0022]a)所述引物組在制備所述試劑盒中的應(yīng)用；
[0023]b)所述引物組，或所述試劑，或所述試劑盒在制備檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有傳染性造血器官壞死病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用。[0024]應(yīng)用所述引物組，或所述試劑，或所述試劑盒檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有傳染性造血器官壞死病毒的方法，包括如下步驟:用所述引物組，或所述試劑，或所述試劑盒在63-65°C (如63°C或65°C )條件下對所述待測樣品進(jìn)行時長60min的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)，之后在80°C放置2min終止反應(yīng)，按照如下方法確定所述待測樣品中是否含有傳染性造血器官壞死病毒:向反應(yīng)體系中加入SYBR Green I型核酸染料，如果反應(yīng)液變成熒光綠色，說明待測樣品中含有傳染性造血器官壞死病毒，若反應(yīng)體系呈現(xiàn)紅棕色，則說明待測樣品中沒有傳染性造血器官壞死病毒，該方法實(shí)現(xiàn)了檢測結(jié)果的可視化。當(dāng)然也可將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測待測樣品中是否含有傳染性造血器官壞死病毒，電泳檢測若出現(xiàn)階梯狀DNA條帶，則說明待測樣品中含有傳染性造血器官壞死病毒，若未出現(xiàn)階梯狀DNA條帶，則說明待測樣品中沒有傳染性造血器官壞死病毒。
[0025]所述待測樣品來源于淡水或海洋動物，如魚類，具體如鮭鱒魚。
[0026]在本發(fā)明中，所述傳染性造血器官壞死病毒為感染魚類(如鮭鱒魚)的傳染性造血器官壞死病毒，具體如傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)毒株WRAC (美國典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC* Number:VR-1392 TM)。
[0027]本發(fā)明將逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增技術(shù)(reverse transcription loop-mediatedisothermal amplification, RT-LAMP)引入到傳染性造血器官壞死病毒(infectioushaematopoietic necrosis virus, IHNV)檢測中，建立了簡單、快速、靈敏的IHNV檢測方法。針對IHNV的聚合酶蛋白基因(Polymerase protein, L)的8個區(qū)域設(shè)計6條特異性引物，以IHNV基因組RNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶和Bst DNA聚合酶的作用下進(jìn)行RT-LAMP，反應(yīng)產(chǎn)物添加SYBR Green I熒光染料后，通過肉眼觀察陽性樣本表現(xiàn)為熒光綠色，而陰性樣本表現(xiàn)為紅棕色。該方法實(shí)現(xiàn)了檢測結(jié)果的可視化。特異性分析顯示該方法不與傳染性胰腺壞死病毒(infectious pancreatic necrosis virus, IPNV)及同屬的水生動物病毒性出血敗血癥(viral haemorrhagic septicaemia virus, VHSV)發(fā)生交叉反應(yīng),并且可檢測不低于 IOpfuIHNV的RNA，具有良好的特異性和很高的靈敏性。以上可視化結(jié)果均被2%瓊脂糖凝膠電泳證明。本研究所建立的IHNV RT-LAMP可視化檢測方法靈敏度高、特異性好、成本低、不依賴任何專門的儀器設(shè)備實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測。本發(fā)明對鮭鱒魚魚苗的引種、無特定病原體種魚的培育，以及鮭鱒魚無公害健康養(yǎng)殖均有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為不同稀釋度病毒懸液感染EPC細(xì)胞后在細(xì)胞板上形成的空斑。
[0029]圖2為RT-LAMP檢測方法反應(yīng)溫度優(yōu)化結(jié)果。其中，A為可視化檢測結(jié)果，1:陰性對照；2-4:61°C、63°C、65°C。B 為凝膠檢測結(jié)果，泳 1:陰性對照；2_4:61°C、63°C、65°C ；M:DL2000DNA Marker。
[0030]圖3為RT-LAMP檢測方法特異性檢測結(jié)果。其中，A為可視化檢測結(jié)果，I:IHNV ；2:IPNV ；3:VHSV ；B 為凝膠檢測結(jié)果，I:IHNV ；2:IPNV ；3:VHSV ；M:DL2000DNA Marker。
[0031]圖4為RT-LAMP檢測方法靈敏度檢測結(jié)果。其中，A為可視化檢測結(jié)果，1_7:5、10、25、50、102、103、104pfu IHNV RNA。B 為凝膠檢測結(jié)果，1-7:5、10、25、50、102、103、104pfuIHNV RNA ；M:DL2000DNA Marker。
[0032]圖5為用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增試劑盒的實(shí)際應(yīng)用結(jié)果結(jié)果。其中，A為可視化檢測結(jié)果，1-7 :1-7號樣品；B為凝膠檢測結(jié)果，1-7 :1-7號樣品，M ：DL2000DNA Marker。
【具體實(shí)施方式】
[0033]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0034]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0035]傳染性造血器官壞死病毒（IHNV)毒株WRAC :美國典型培養(yǎng)物保藏中心，ΛI(xiàn) CX'"Number :VR_1392 TM。
[0036]傳染性膜腺壞死病毒（infectiouspancreatic necrosis virus, IPNV):美國典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCCk Number ：VR-890 TM。
[0037]水生動物病毒性出血敗血癥（viralhaemorrhagic septicaemia virus, VHSV)：美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Λ?_α." Number :VR-1387 ΤΜ。
[0038]AMV反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司，其產(chǎn)品目錄號為M5101 ;Bst2. ODNA聚合酶購自NEB公司，其產(chǎn)品目錄號為M0537S ；SYBR Green I和Trizol購自Invitrogen公司；DKZW-D-2電熱恒溫水浴鍋購自北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；凝膠成像系統(tǒng)UniversalHood II 購自 BIO-RAD。
[0039]實(shí)施例I、用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增試劑盒的制備及使用方法
[0040]一、用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增引物組的制備
[0041]本實(shí)施例用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增引物組由引物I、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成。這六個引物按照如下方法制備：根據(jù)GenBank收錄的IHNV聚合酶蛋白的多條基因序列，進(jìn)行比對，選取聚合酶基因特異性保守區(qū)段，利用在線軟件 PrimerExplorer V4 (https: //primerexplorer. jp/elamp4. 0.0/)針對 L 基因保守區(qū)設(shè)計3對RT-LAMP引物，序列見表1，引物由哈爾濱博仕生物公司合成。
[0042]表1L基因RT-LAMP弓丨物序列
[0043]
【權(quán)利要求】
1.用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增引物組，為引物組A或引物組B ;所述引物組A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成；所述引物組B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4組成； 所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組，其特征在于:所述引物組A中所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩爾比為1:1:8:8:4:4 ;所述引物組B中所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩爾比為1:1:8:8。
3.用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增試劑，包括反轉(zhuǎn)錄酶、鏈置換型DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和權(quán)利要求1或2所述的引物組。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑，其特征在于:所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg2+、所述反轉(zhuǎn)錄酶和所述鏈置換型DNA聚合酶在所述擴(kuò)增試劑中的配比為 5pmol:5pmol:40pmol:40pmol:20pmol:20pmol:25mmol:5nmol:10U:8U ;或 所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述反轉(zhuǎn)錄酶和所述鏈置換型DNA聚合酶 在所述擴(kuò)增試劑中的配比為5pmol:5pmol:40pmol:40pmol:25mmol:5nmol: IOU:8U。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的試劑，其特征在于:所述反轉(zhuǎn)錄酶為AMV反轉(zhuǎn)錄酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一所述的試劑，其特征在于:所述鏈置換型DNA聚合酶為Bst2.0DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6中任一所述的試劑，其特征在于:所述試劑由所述AMV反轉(zhuǎn)錄酶、所述Bst2.0DNA聚合酶、所述dNTPs、10 X等溫擴(kuò)增緩沖液和權(quán)利要求1或2所述的引物組組成； 所述IOX等溫擴(kuò)增緩沖液的pH8.8，溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下:Tris-HC120mM、KC150mM、(NH4)2S0410Mm、MgS042mM、Tween-20 體積分?jǐn)?shù) 0.1%。
8.用于檢測傳染性造血器官壞死病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增試劑盒，其特征在于:所述試劑盒含有權(quán)利要求3-7中任一所述擴(kuò)增試劑和熒光顯色劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于:所述熒光顯色劑為熒光染料SYBRGreen I。
10.如下a)或b)的應(yīng)用: a)權(quán)利要求1或2所述的引物組在制備權(quán)利要求8或9所述試劑盒中的應(yīng)用； b)權(quán)利要求1或2所述引物組，或權(quán)利要求3-7中任一所述試劑，或權(quán)利要求8或9所述試劑盒在制備檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有傳染性造血器官壞死病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103525951SQ201310506902
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月24日
【發(fā)明者】徐黎明, 盧彤巖, 劉淼 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所