一種石油污染土壤中萘降解基因Nah含量的測定方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種石油污染土壤中萘降解基因Nah含量的測定方法，以石油污染土壤中含有三致毒性芳香烴萘為目標降解組分，采用非培養(yǎng)的分子生物學技術實時熒光定量PCR對萘降解基因Nah進行定量。方法主要包括土壤中DNA的提取，設計特異性擴增萘降解基因的簡并引物，確定PCR條件，制作熒光定量PCR標準曲線，樣品測定。本發(fā)明所述方法是一種能夠檢測芳香烴生物降解活性的新型方法，同時能準確反映微生物的降解代謝途徑和區(qū)域石油污染狀況，在油田污染監(jiān)測和治理方面有重要的應用價值。
【專利說明】—種石油污染土壤中萘降解基因Nah含量的測定方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境石油污染監(jiān)測領域，具體地說是一種石油污染土壤中萘降解基因Nah含量的測定方法。
【背景技術】
[0002]石油是推動社會發(fā)展的重要能源，但是每年全世界約有I X 109t石油及其產(chǎn)品在石油開采、煉制、貯運、使用以及各種泄露事故中進入地下水、地表水和土壤，其中我國占60多萬噸，直接造成我國面積500萬公頃土壤受石油污染，石油組分中的芳香烴組分含有致癌、致畸、致突變毒性，給當?shù)貛碇参餃p產(chǎn)、糧食安全隱患、生態(tài)環(huán)境破壞等一系列嚴重問題。
[0003]綠色經(jīng)濟高效的生物降解石油途徑引起了國內(nèi)許多學者研究和倡導，但是傳統(tǒng)微生物篩選培養(yǎng)的方法只能分離占石油降解菌總數(shù)的1%~10%的微生物種類，根本無法體現(xiàn)微生物的真實降解水平和反映土壤中微生物多樣性及分布。此外，芳香烴降解基因BTEX能編碼代謝芳香烴重要的末端氧化酶已有很多研究和報道，但是他們在引物設計上往往受到降解菌類型的限制，合成的代謝酶不能代表大部分的降解菌所含的基因類型。
[0004]近十年興起的分子生物學技術實時熒光定量PCR技術(RT-qPCR)能避免傳統(tǒng)平板培養(yǎng)方式的弊端，直接對提取土壤微生物總DNA進行分析，通過熒光染料和目標DNA在延伸過程結合所產(chǎn)生的熒光信號的強度，對關鍵的石油烴生物降解基因拷貝數(shù)進行定量測定，在國內(nèi)外微生物種群的多樣性和群落分布監(jiān)測分析上有重要的應用。該技術在石油降解基因特異性擴增所需引物 的合成上，對大部分能降解石油烴的菌株序列進行比對，設計同源性較高的石油烴降解基因擴增引物。此外，實時熒光定量PCR技術不用專門設計檢測探針，具有比其他分析技術如雜交和克隆更加簡便、經(jīng)濟、準確。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目在于提供一種石油污染土壤中萘降解基因Nah含量的測定方法，可以對降解微生物的芳香烴代謝途徑和降解活性進行準確檢測，又能反映土壤石油污染程度。
[0006]本發(fā)明的技術方案:
[0007]—種石油污染土壤中萘降解基因Nah含量的測定方法，主要步驟如下:
[0008]I)采集石油污染O~20cm表層土壤進行_20°C保存，按照ZR Soil Microbe DNAMiniPrep? 土壤DNA提取試劑盒步驟進行DNA提取。
[0009]2)引物設計遵循引物設計原則，從土壤中能降解石油烴的菌株序列中比對設計同源性較高的萘降解基因擴增引物Nahf/Nahr，見下表。
[0010]
【權利要求】
1.一種石油污染土壤中萘降解基因Nah含量的測定方法，其特征在于步驟如下: 1)采集石油污染O~20cm表層土壤進行-20°C保存，按照ZRSoil Microbe DNAMiniPrep? 土壤DNA提取試劑盒步驟進行DNA提取。 2)引物設計遵循引物設計原則，從土壤中能降解石油烴的菌株序列中比對設計同源性較高的萘降解基因擴增引物Nahf/Nahr，見下表。

2.根據(jù)權利要求1所述的石油污染土壤中萘降解基因Nah含量的測定方法，其特征在于:Nah降解基因PCR退火溫度范圍為55~57°C。
3.根據(jù)權利要求1所述的石油污染土壤中萘降解基因Nah含量的測定方法，其特征在于:Nah降解基因PCR的最適變性溫度為94°C。
4.根據(jù)權利要求1所述的石油污染土壤中萘降解基因Nah含量的測定方法，其特征在于:定量PCR溫度設計為:95°C保持5min ;經(jīng)過以下40個周期:Nah降解基因變性溫度為94°C，保持5s，退火溫度為57°C，保持60s，后經(jīng)過72°C的延伸30s。熔解曲線溫度:57°C保持5s，然后升到95°C (增量為 0.5°C )。
【文檔編號】C12Q1/68GK103882104SQ201310552573
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2013年11月7日 優(yōu)先權日:2013年11月7日
【發(fā)明者】劉慶龍, 唐景春, 朱文英, 張海榮, 孫克靜, 劉 英 申請人:南開大學