一種用于檢測雞隱性白羽位點(diǎn)基因型的引物、試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測雞隱性白羽位點(diǎn)基因型的引物、試劑盒及檢測方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明針對TYR基因第4內(nèi)含子存在7.7kb插入（ev1）設(shè)計(jì)等位基因c特異性引物P1，針對PMEL17基因第4內(nèi)含子不存在7.7kb插入（ev1）設(shè)計(jì)等位基因C特異性引物P2，引物P3是引物P1和P2共同的下游引物；再以包含TYR基因的待測雞全基因組DNA為模板，把引物P1、P2和P3放在一個(gè)PCR反應(yīng)里，一次PCR反應(yīng)后對PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定雞TYR基因隱性白羽位點(diǎn)的基因型。該方法能大大提高基因型的判定效率和準(zhǔn)確性，且方法簡便，分型時(shí)間短，不需要測序和限制性內(nèi)切酶，不需要特殊的儀器，成本低，易推廣普及。
【專利說明】—種用于檢測雞隱性白羽位點(diǎn)基因型的引物、試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明具體涉及一種用于檢測雞隱性白羽位點(diǎn)基因型的引物，以及包含該引物的試劑盒及檢測方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著生活水平的提高，人們的消費(fèi)觀念從過去的數(shù)量型轉(zhuǎn)變?yōu)橘|(zhì)量型。人們對雞肉肉質(zhì)的要求也越來越高。我國的地方雞具有肉質(zhì)好的特點(diǎn)，但是其生長速度較慢，飼料轉(zhuǎn)化率低。而國外的快大型肉雞雖生長速度快、飼料轉(zhuǎn)化率高，其肉質(zhì)較差。為解決這一問題，將國外快大型肉雞與國內(nèi)地方優(yōu)質(zhì)肉雞進(jìn)行雜交，既能夠改善國外快大型肉雞的肉質(zhì)也能加快地方優(yōu)質(zhì)肉雞的生長速度和生產(chǎn)性能。但是，由于我國人民長期的飲食習(xí)慣的影響，中國消費(fèi)者偏愛黃麻羽、黑羽等有色羽的雞，尤其是南方城市不接受快速生長的白羽雞。為了使雜交后雞的表型符合中國消費(fèi)者的需求，就需要純合的隱性白羽雞，隱性白羽雞生產(chǎn)性能高，且與我國有色羽雜交后能保持有色羽的羽色，對于我國優(yōu)質(zhì)雞的育種上具有重大的意義。
[0003]絡(luò)氨酸酶基因(Tyrosine，TYR)在黑色素合成過程中起到非常重要的作用。有報(bào)道稱:TYR基因第4內(nèi)含子是否存在7.7kb的插入，與隱性白羽相關(guān)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測雞隱性白羽位點(diǎn)基因型的引物。
[0005]同時(shí)，本發(fā)明還提供一種用于檢測雞隱性白羽位點(diǎn)基因型的試劑盒。
[0006]最后，本發(fā)明還提供一種檢測雞隱性白羽位點(diǎn)基因型的方法。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0008]一種用于檢測雞隱性白羽位點(diǎn)基因型的引物，包括引物P1、P2和P3，
[0009]上游引物Pl:5’ -CCCAGTTCCCTTCAATTT-3’(如 SEQ ID N0.1 所示)；
[0010]上游引物P2:5，-TGGCCGACCACTATTCCCTA-3’(如 SEQ ID N0.2 所示)；
[0011]下游引物P3:5，-CTGATGGGCTTGCTTGAGGT-3’(如 SEQ ID N0.3 所示)。
[0012]一種用于檢測雞隱性白羽位點(diǎn)基因型的試劑盒，主要包括引物P1、P2和P3，
[0013]上游引物Pl:5’ -CCCAGTTCCCTTCAATTT-3’ ；
[0014]上游引物P2:5’ -TGGCCGACCACTATTCCCTA-3’ ；
[0015]下游引物P3:5，-CTGATGGGCTTGCTTGAGGT-3，。
[0016]優(yōu)選的，一種用于檢測雞隱性白羽位點(diǎn)基因型的試劑盒，還包括2XTaq PCRMasterMix、滅菌超純水，以及包含 600bp、500bp、400bp、300bp、200bp 和 IOObp 的 DNAMarker0
[0017]所述的2XTaq PCR MasterMix含有Taq DNA聚合酶、dNTPs、氯化鎂和PCR反應(yīng)緩沖液，為市售商品，可購自上海生工、大連寶生物、北京百泰克、北京康為等公司。[0018]一種檢測雞隱性白羽位點(diǎn)基因型的方法，包括以下步驟:
[0019](I)以包含TYR基因的待測雞全基因組DNA為模板，在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，利用引物P1-P3 PCR擴(kuò)增雞TYR基因C等位基因，利用引物P2-P3 PCR擴(kuò)增雞TYR基因c等位基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0020]所述的引物P1、P2和P3分別為:
[0021]上游引物Pl:5’ -CCCAGTTCCCTTCAATTT-3’，
[0022]上游引物P2:5 ’ -TGGCCGACCACTATTCCCTA-3，，
[0023]下游引物P3:5 ’ -CTGATGGGCTTGCTTGAGGT-3 ’ ；
[0024](2)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定雞TYR基因隱性白羽位點(diǎn)的基因型。
[0025]所述步驟(1)中PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為:2XTaq PCR MasterMix 6.25 μ L, ddH204.25 μ L, Pl 0.5 μ L, Ρ2 0.5 μ L, Ρ3 0.5 μ L, DNA 模板 0.5 μ L，共 12.5 μ L。
[0026]所述步驟(1)中PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，57°C退火30s，72。。延伸 30s, 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin ;4°C保存。
[0027]所述步驟(2)中瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為1%。
[0028]所述步驟(2)中瓊脂糖凝膠電泳的電壓為120V，電泳時(shí)間為30min。電泳結(jié)束后，用凝膠成像系統(tǒng)對瓊脂糖凝膠照相檢測，判型。
[0029]所述步驟(2)中鑒定雞TYR基因隱性白羽位點(diǎn)基因型的方法為:CC基因型表現(xiàn)為267bp條帶；Cc基因型表現(xiàn)為451bp和267bp條帶；cc基因型表現(xiàn)為451bp。
[0030]本發(fā)明的有益效果:
[0031]本發(fā)明中用于檢測雞隱性白羽位點(diǎn)基因型的引物，是針對TYR基因第4內(nèi)含子存在7.7kb插入(evl)設(shè)計(jì)等位基因c特異性引物Pl ;針對PMEL17基因第4內(nèi)含子不存在
7.7kb插入(evl)設(shè)計(jì)等位基因C特異性引物P2 ;引物P3是引物Pl和P2共同的下游引物。這樣引物P1-P3只能擴(kuò)增c等位基因，擴(kuò)增的片段大小為451bp ;引物P2-P3只能擴(kuò)增C等位基因，擴(kuò)增的片段大小為267bp。PCR擴(kuò)增TYR基因后即可通過電泳檢測分型可以準(zhǔn)確、快速、方便的檢測TYR基因隱性白羽位點(diǎn)基因型:CC基因型表現(xiàn)為267bp條帶；Cc基因型表現(xiàn)為451bp和267bp條帶；cc基因型表現(xiàn)為451bp。
[0032]本發(fā)明以包含TYR基因的待測雞全基因組DNA為模板，把引物P1、P2和P3放在一個(gè)PCR反應(yīng)里，一次PCR反應(yīng)后再對PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定雞TYR基因隱性白羽位點(diǎn)的基因型。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明建立的分子生物學(xué)方法能大大提高基因型的判定效率和準(zhǔn)確性，且方法簡便，分型時(shí)間短，不需要測序和限制性內(nèi)切酶，不需要特殊的儀器，成本低，易推廣普及。
[0033]本發(fā)明通過對其他雞群體進(jìn)行判型驗(yàn)證了其準(zhǔn)確性，結(jié)果表明該方法能有效地診斷隱性白羽位點(diǎn)的TYR基因的基因型，可以用于雞隱性白羽位點(diǎn)的分子標(biāo)記輔助選擇，從而為縮短育種時(shí)間，加快育種進(jìn)程提供有力保證。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的技術(shù)流程示意圖；
[0035]圖2為實(shí)施例1中各樣本TYR基因隱性白羽位點(diǎn)的PCR電泳圖，[0036]注:編號說明如下:1、2、3、6、11、12為CC基因型，7、8、9為cc基因型，4、5、10為Ce
基因型，M為DNA Marker。
【具體實(shí)施方式】
[0037]下述實(shí)施例僅對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。
[0038]實(shí)施例1
[0039]本實(shí)施例的技術(shù)流程示意圖如圖1所示，主要包括以下步驟:
[0040](1)樣品的采集
[0041]采集河南農(nóng)業(yè)大學(xué)種雞場隱性白羽雞品系30只，中國家禽基因庫揚(yáng)州隱性白羽雞30只，盧氏綠殼蛋雞保種廠盧氏綠殼蛋雞30只，翅靜脈采血，加1/3抗凝劑，保存于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0042](2)基因組DNA的提取
[0043]參考文獻(xiàn)Sambrock et al (2002)方法。
[0044](3)擴(kuò)增引物
[0045]根據(jù)NCBI 公布的 TYR 基因序列(GenBank Accession NC_006088.3)設(shè)計(jì)引物 P1、P2和P3，如下所示:
[0046]上游引物P1: 5 ’ -CCCAGTTCCCTTCAATTT-3，，
[0047]上游引物P2:5 ’ -TGGCCGACCACTATTCCCTA-3，，
[0048]下游引物P3:5，-CTGATGGGCTTGCTTGAGGT-3，。
[0049](4) PCR 擴(kuò)增
[0050]PCR反應(yīng)體系采用混合加樣法，即根據(jù)每一個(gè)反應(yīng)體系所需的各種組分的數(shù)量和I次反應(yīng)所需的PCR反應(yīng)的個(gè)數(shù),算出各種反應(yīng)組分的總量,加入到I個(gè)1.5mL離心管中，充分混勻后瞬時(shí)離心，再分裝到每個(gè)0.2mL Eppendorf PCR管中，然后分別加入模板DNA，再瞬時(shí)離心后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0051]PCR反應(yīng)體系為:2XTaq PCR MasterMix (購自北京百泰克公司)6.25 μ L，ddH20
4.25 μ L, Pl 0.5 μ L, Ρ2 0.5 μ L, Ρ3 0.5 μ L, DNA 模板 0.5 μ L，共 12.5 μ L。反應(yīng)程序?yàn)?95°C 預(yù)變性 5min ;95°C變性 30s，57°C退火 30s，72。。延伸 30s，30 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 IOmin ；
4°C保存。
[0052](5) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測及結(jié)果判定
[0053]取8μ L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，1%的瓊脂糖凝膠電泳(電泳電壓:120V ;電泳時(shí)間:30min)點(diǎn)樣，凝膠成像系統(tǒng)檢測，電泳圖譜參見圖2。
[0054]根據(jù)電泳圖譜中出現(xiàn)的條帶的大小判定:若只有267bp的片段，則為隱性白羽純合子；若有267bp和451bp的片段，則為隱性白羽雜合子；若只有451bp的片段，則為野生型純合子，結(jié)果如表1所示。
[0055]表1檢測驗(yàn)證群體檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)表
[0056]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測雞隱性白羽位點(diǎn)基因型的引物，其特征在于:包括引物P1、P2和P3， 上游引物 Pl:5’ -CCCAGTTCCCTTCAATTT-3’ ；
上游引物 P2:5’ -TGGCCGACCACTATTCCCTA-3’ ； 下游引物 P3:5’ -CTGATGGGCTTGCTTGAGGT-3’。
2.一種用于檢測雞隱性白羽位點(diǎn)基因型的試劑盒，其特征在于:主要包括引物P1、P2和P3，
上游引物 P1: 5 ’ -CCCAGTTCCCTTCAATTT-3，；
上游引物 P2:5’ -TGGCCGACCACTATTCCCTA-3’ ；
下游引物 P3:5’ -CTGATGGGCTTGCTTGAGGT-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測 雞隱性白羽位點(diǎn)基因型的試劑盒，其特征在于:還包括 2XTaq PCR MasterMix、滅菌超純水，以及包含 600bp、500bp、400bp、300bp、200bp 和IOObp 的 DNA Marker。
4.一種檢測雞隱性白羽位點(diǎn)基因型的方法，其特征在于:包括以下步驟: Cl)以包含TYR基因的待測雞全基因組DNA為模板，在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，利用引物P1-P3 PCR擴(kuò)增雞TYR基因C等位基因，利用引物P2-P3 PCR擴(kuò)增雞TYR基因c等位基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物； 所述的引物P1、P2和P3分別為:
上游引物 Pl:5’ -CCCAGTTCCCTTCAATTT-3’，
上游引物 P2:5’ -TGGCCGACCACTATTCCCTA-3’，
下游引物 P3:5’ -CTGATGGGCTTGCTTGAGGT-3’ ； (2)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定雞TYR基因隱性白羽位點(diǎn)的基因型。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測雞隱性白羽位點(diǎn)基因型的方法，其特征在于:所述步驟(I)中 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為:2XTaq PCR MasterMix 6.25 μ L, ddH20 4.25 μ L，Pl 0.5 μ L,Ρ2 0.5 μ L, Ρ3 0.5 μ L, DNA 模板 0.5 μ L，共 12.5 μ L。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測雞隱性白羽位點(diǎn)基因型的方法，其特征在于:所述步驟(1)中PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性5min;95°C變性30s，57°C退火30s，72°C延伸30s，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin ;4°C保存。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測雞隱性白羽位點(diǎn)基因型的方法，其特征在于:所述步驟(2)中瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為1%。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測雞隱性白羽位點(diǎn)基因型的方法，其特征在于:所述步驟(2)中瓊脂糖凝膠電泳的電壓為120V，電泳時(shí)間為30min。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測雞隱性白羽位點(diǎn)基因型的方法，其特征在于:所述步驟(2)中鑒定雞TYR基因隱性白羽位點(diǎn)基因型的方法為:CC基因型表現(xiàn)為267bp條帶；Cc基因型表現(xiàn)為451bp和267bp條帶；cc基因型表現(xiàn)為451bp。
【文檔編號】C12N15/11GK103571963SQ201310589394
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月20日
【發(fā)明者】康相濤, 李轉(zhuǎn)見, 田亞東, 韓瑞麗, 楊朋坤, 蔣瑞瑞, 呂世杰, 孫桂榮, 李國喜, 王丹丹, 王彥彬, 劉小軍, 閆峰賓 申請人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)