一種水稻基腐病菌抗生素zeamine高產(chǎn)培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用水稻基腐病原Dickeyazeae產(chǎn)生廣譜抗生素zeamine的高產(chǎn)培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。所述1L培養(yǎng)基含有1～30g碳源、0.5～5g氮源、0.05～5g無機(jī)鹽類和0.1～5g氨基酸。所述碳源為葡萄糖、蔗糖、甘露醇、甘油或果糖中的一種或幾種；氮源為硫酸銨、硝酸鈉、硝酸銨或氯化銨中的一種或幾種；無機(jī)鹽類為硫酸亞鐵、氯化鈣、氯化錳、硫酸鎂或氯化鉀中的一種或幾種；氨基酸為天冬氨酸、天冬酰胺或脯氨酸中的一種或幾種。采用本發(fā)明培養(yǎng)基得到的抗生素產(chǎn)量比使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基得到的抗生素產(chǎn)量多20～30倍，而且，本發(fā)明培養(yǎng)基成分簡單，配制簡便，成本低，易于抗生素的純化、分離，培養(yǎng)方法操作簡單，培養(yǎng)條件容易控制，有利于抗生素的大量制備。
【專利說明】一種水稻基腐病菌抗生素zeamine高產(chǎn)培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物高【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是涉及一種細(xì)菌培養(yǎng)用培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法，具體涉及一種水稻基腐病菌抗生素zeamine高產(chǎn)培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻基腐病菌iDickeya.Zeae)菌體單生，短桿狀，兩端鈍圓，大小為0.7μ mX 1.4~1.75 μ m，周生多根鞭毛。革蘭氏染色反應(yīng)呈陰性，不形成芽胞和莢膜。在牛肉浸膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈假根狀或變形蟲狀，邊緣不整齊，表面稍凸，不透明，色暗淡，菌苔直線形，邊緣鋸齒狀，凸起，初為乳白色，后逐漸變成淡土黃色，表面稍皺縮，無光澤(劉瓊光等，1997)。在金氏培養(yǎng)基上無熒光反應(yīng)，厭氣生長，致病類型為軟腐，能使馬鈴薯片腐爛，散發(fā)出難聞的惡臭味(洪劍鳴等，1983)。近期研究結(jié)果表明由水稻基腐病菌產(chǎn)生一種新型的抗生素zeamine,從化學(xué)結(jié)構(gòu)來看，zeamine屬為多胺類聚酮化合物,是一類全新的抗生素，zeamine對多種革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌包括多種植物病原細(xì)菌和動物病原細(xì)菌都有高強(qiáng)度的抑制作用(Wu等，2010)。因此Zeamine是一種非常有潛力、有價值的新型抗生素藥物，值得深入的研究與開發(fā)。眾所周知，當(dāng)今抗生素的抗藥性問題是新的醫(yī)學(xué)問題，抗生素的代替品亟待開發(fā)，Zeamine作為抗生素的代替品有巨大的開發(fā)潛力，需要加大開發(fā)的力度與速度。但現(xiàn)階段面臨一個基礎(chǔ)而又非常重要的問題就是現(xiàn)有的培養(yǎng)基下Zeamine的培養(yǎng)產(chǎn)量都比較低，提取的難度大，不利于進(jìn)一步的研究和商業(yè)開發(fā)。
[0003]在本申請之前，本領(lǐng)域技術(shù)人員用于水稻基腐病菌培養(yǎng)與zeamine抗生素的產(chǎn)生的常規(guī)培養(yǎng)基是LB培養(yǎng)基、YEB培養(yǎng)和MM培養(yǎng)基。所述LB培養(yǎng)基配方為IOg胰蛋白胨、5g酵母浸出液粉、IOg氯化鈉，所述LB培養(yǎng)營養(yǎng)豐富，一般用于菌種的快速繁殖，但其成分復(fù)雜，難于分離抗生素，一般不用LB培養(yǎng)基作為產(chǎn)抗生素培養(yǎng)基。所述YEB培養(yǎng)基配方為IOg胰蛋白胨、5g酵母浸出粉、5g蔗糖，5g NaCl，0.2g硫酸鎂，pH 7.0。所述麗培養(yǎng)基的配方為10.5g磷酸氫二鉀、4.5g磷酸二氫鉀、2g硫酸銨、2g甘露醇、2g甘油、0.2g硫酸鎂，5mg硫酸亞鐵、IOmg氯化H2mg氯化猛，`pH7.0,所述麗培養(yǎng)基由于其成分清晰、簡單,本發(fā)明的發(fā)明人在早期研究中，將其作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為溫度控制在28~30°C，三角瓶200mL，轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)36小時，發(fā)酵液進(jìn)行抗生素提取。
[0004]要進(jìn)一步研究水稻基腐病菌抗生素zeamine的抑菌機(jī)理、理化功能和今后商品化等，需要大量制備抗生素zeamine，但現(xiàn)有的常規(guī)培養(yǎng)基在配方上存在以下問題:(I)水稻基腐病菌產(chǎn)抗生素基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制繁瑣，微量元素稱量困難、勞動力強(qiáng)，不利于規(guī)?；a(chǎn)。(2)原發(fā)酵培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件下產(chǎn)抗生素效率低、產(chǎn)量少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中水稻基腐病菌培養(yǎng)基zeamine產(chǎn)量低，培養(yǎng)基配制過程繁瑣，不利于抗生素提取的缺陷，提供一種水稻基腐病菌抗生素zeamine的高產(chǎn)培養(yǎng)基。[0006]本發(fā)明的另一個目的是提供一種利用水稻基腐病菌抗生素zeamine高產(chǎn)培養(yǎng)基高產(chǎn)抗生素zeamine的方法。
[0007]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
一種水稻基腐病菌抗生素zeamine高產(chǎn)培養(yǎng)基,所述IL培養(yǎng)基含有如下組分:1~30g碳源、0.5~5 g氮源、0.05~10 g無機(jī)鹽類和0.1~5 g氨基酸；所述碳源為葡萄糖、鹿糖、甘露醇、甘油或果糖中的一種或幾種；所述氮源為硫酸銨、硝酸鈉、硝酸銨或氯化銨中的一種或幾種；所述無機(jī)鹽類為硫酸亞鐵、氯化鈣、氯化錳、硫酸鎂或氯化鉀中的一種或幾種；所述氨基酸為天冬氨酸、天冬酰胺或脯氨酸中的一種或幾種。
[0008]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述IL培養(yǎng)基中還含有0.05~15 g輔助鹽類，所述輔助鹽類為磷酸氫二鉀或磷酸二氫鉀中的一種或兩種。優(yōu)選地，所述輔助鹽類為磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀。
[0009]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述碳源為蔗糖；氮源為硝酸銨；氨基酸為天冬酰胺；無機(jī)鹽類為硫酸鎂和氯化鉀。
[0010]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述IL培養(yǎng)基包括如下組分:0.5~5 g硝酸銨，2~20 g鹿糖,5~IOg磷酸氫二鉀，I~5g磷酸二氫鉀，I~3g氯化鉀,0.05~3g硫酸鎂，
0.5~3 g天冬酰胺。更優(yōu)選地，所述IL培養(yǎng)基包括如下組分:1.4g硝酸銨，12.7g蔗糖，
9.25g磷酸氫二鉀，3.3g磷酸二氫鉀，Ig氯化鉀，Ig硫酸鎂，Ig天冬酰胺。
[0011]本發(fā)明所述 水稻基腐病菌抗生素zeamine高產(chǎn)培養(yǎng)基的配置方法為:按上述培養(yǎng)基配方稱取各組分加水?dāng)嚢杈鶆?，調(diào)節(jié)PH7，將培養(yǎng)基裝入200mL/400mL/1000mL的藍(lán)口瓶中，0.1Mpa滅菌20分鐘ο
[0012]一種利用如上所述培養(yǎng)基高產(chǎn)培養(yǎng)水稻基腐病菌抗生素zeamine的方法，包括如下步驟:將水稻基腐病菌接種在水稻基腐病菌抗生素zeamine高產(chǎn)培養(yǎng)基中，25~31°C，180~220轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)48~72小時，得到水稻基腐病菌產(chǎn)毒發(fā)酵液，產(chǎn)毒發(fā)酵液中含有抗生素zeamine。將水稻基腐病菌接種在水稻基腐病菌抗生素zeamine高產(chǎn)培養(yǎng)基中,其最優(yōu)選的培養(yǎng)條件為25°C，180轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)48~72小時。所述的水稻基腐病菌為水稻基腐病原 Dickeya zeae。
[0013]本發(fā)明的有益效果是:
經(jīng)本發(fā)明所述水稻基腐病菌抗生素zeamine高產(chǎn)培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的抗生素產(chǎn)量比MM培養(yǎng)基提高了 20~30倍，且本發(fā)明所述培養(yǎng)基配制簡單，發(fā)酵條件容易控制，成本低，所述水稻基腐病菌高產(chǎn)抗生素培養(yǎng)基所用的各個成分在市場上可以大量廉價的采購，利于規(guī)模化生產(chǎn)、提取抗生素zeamine。
[0014]說明書附圖
圖1不同溫度對水稻基腐病菌抗生素zeamine產(chǎn)生的影響。
[0015]圖2不同轉(zhuǎn)速對水稻基腐病菌抗生素zeamine產(chǎn)生的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、設(shè)備為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)試劑和設(shè)備。
[0017]實(shí)施例1水稻基腐病菌抗生素zeamine高產(chǎn)培養(yǎng)基各成分的探索一、材料和方法
1、菌種:水稻基腐病菌菌種由廣東省微生物信號與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，菌種由LB培養(yǎng)基培養(yǎng)擴(kuò)繁凍存、保藏。
[0018]2、培養(yǎng)方法:搖瓶250mL三角錐形瓶，裝液量IOOmL,接種100 μ L濃度為0D1.0的水稻基腐病菌Dickeya.zeae菌液種子液。置水平恒溫?fù)u床，轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分，溫度28~30 0C，每種試驗(yàn)三個重復(fù)，結(jié)果取其平均值。
[0019]3、抗生素量測定方法:樣品制備發(fā)酵結(jié)束后將培養(yǎng)液取10mL，100°C沸水浴10分鐘，12000轉(zhuǎn)/分，分離沉淀5分鐘，取上清液進(jìn)行生物測定抗生素含量。
[0020]二、培養(yǎng)基成分對液體發(fā)酵抗生素產(chǎn)量的影響。
[0021]1、氮源選擇試驗(yàn):將基礎(chǔ)培養(yǎng)基(上述MM培養(yǎng)基)中的氮源分別換成硝酸銨、硝酸鈉、硫酸銨或氯化銨，配制不同氮源的培養(yǎng)基，發(fā)酵后測定抗生素含量，測定結(jié)果見表1。
[0022]表1不同氮源對水稻基腐病菌抗生素zeamine產(chǎn)生的影響
【權(quán)利要求】
1.一種水稻基腐病菌抗生素zeamine高產(chǎn)培養(yǎng)基,其特征在于,所述IL培養(yǎng)基含有如下組分:1~30 g碳源、0.5~5 g氮源、0.05~15 g無機(jī)鹽類和0.1~5 g氨基酸；所述碳源為葡萄糖、蔗糖、甘露醇、甘油或果糖中的一種或幾種；所述氮源為硫酸銨、硝酸鈉、硝酸銨或氯化銨中的一種或幾種；所述無機(jī)鹽類為硫酸亞鐵、氯化鈣、氯化錳、硫酸鎂或氯化鉀中的一種或幾種；所述氨基酸為天冬氨酸、天冬酰胺或脯氨酸中的一種或幾種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述培養(yǎng)基，其特征在于，所述IL培養(yǎng)基中還含有0.05~15g輔助鹽類，所述輔助鹽類為磷酸氫二鉀或磷酸二氫鉀中的一種或兩種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述培養(yǎng)基，其特征在于，所述輔助鹽類為磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述培養(yǎng)基，其特征在于，所述碳源為蔗糖；氮源為硝酸銨；氨基酸為天冬酰胺；無機(jī)鹽類為硫酸鎂和氯化鉀。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述培養(yǎng)基，其特征在于，所述IL培養(yǎng)基包括如下組分:0.5~5 g硝酸銨，2~20 g鹿糖，2~IOg磷酸氫二鉀,0.5~5g磷酸二氫鉀,0.5~3g氯化鉀，0.05~Ig硫酸鎂，0.5~3 g天冬酰胺。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述培養(yǎng)基，其特征在于，所述IL培養(yǎng)基包括如下組分:1.4g硝酸銨，12.7g蔗糖，9.25g磷酸氫二鉀，3.3g磷酸二氫鉀，Ig氯化鉀，0.25g硫酸鎂，Ig天冬酰胺。
7.—種利用權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述培養(yǎng)基高產(chǎn)培養(yǎng)水稻基腐病菌抗生素zeamine的方法，其特征在于，包括如下步驟:將水稻基腐病菌接種在水稻基腐病菌抗生素zeamine高產(chǎn)培養(yǎng)基中，25~31°C，180~220轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)48~72小時，得到水稻基腐病菌發(fā)酵液，發(fā)酵液中含有抗生素zeamine。`
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，將水稻基腐病菌接種在水稻基腐病菌抗生素zeamine高產(chǎn)培養(yǎng)基中，25°C，180轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)48~72小時。
【文檔編號】C12P13/00GK103757067SQ201310591823
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月22日
【發(fā)明者】張煉輝, 廖立勝, 周佳暖, 陳少華 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué), 新加坡分子與細(xì)胞生物研究院