豬帶絳蟲tso45w-4b-tsol18融合基因重組雙歧桿菌疫苗制備及鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬帶絳蟲TSO45W-4B-TSOL18融合基因重組雙歧桿菌疫苗制備及鑒定方法，通過全基因合成帶有接頭的豬帶絳蟲TSO45W-4B-TSOL18融合基因，將其定向克隆到大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭表達載體pGEX-1λT中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18，電穿孔轉(zhuǎn)化長雙歧桿菌(B.longum)，構(gòu)建豬帶絳蟲重組Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗，為豬囊尾蚴病的防治提供一種有價值的新型疫苗。
【專利說明】豬帶絳蟲TS045W-4B-TS0L18融合基因重組雙歧桿菌疫苗制備及鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及豬帶絳蟲TS045W-4B-TS0L18融合基因重組雙歧桿菌疫苗制備及鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豬囊尾蝴病(Cysticercosiscellulosae)又稱囊蟲病(Cysticercosis),是由豬帶絳蟲solium)的中絳期幼蟲寄生在人體皮下、肌肉、腦、眼等臟器引起的一種嚴重危害人類健康的人畜共患寄生蟲病，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題，我國也是豬囊尾蝴病高發(fā)國家之一，以東北、華北、西北、西南地區(qū)發(fā)病率較高,全國約有200萬~300萬囊蟲病患者，感染率為0.14%~3.20%。藥物及手術(shù)治療都有其局限性，研制疫苗防治該病已成為當前研究熱點。
[0003]TS045W-4B和TS0L18基因是豬帶絳蟲六鉤蝴階段兩個重要的免疫原基因，被認為是最具前景的疫苗候選基因。由于宿主MHC分子的多樣性和豬帶絳蟲抗原成分的復雜性，宿主將針對抗原的多個表位產(chǎn)生免疫反應(yīng)，使得單一抗原成分誘導宿主產(chǎn)生的保護性免疫應(yīng)答效果往往較低，因此，多種抗原的融合，綜合各種抗原分子的協(xié)同作用，可能有助于克服單一抗原成分作為候選疫苗的不足，基于這樣的思路本研究致力于豬帶絳蟲中免疫及保護效果肯定的兩種抗原TS045W-4B、TS0L18編碼基因的融合疫苗研制。
[0004]雙歧桿菌iBifidobac teria，Bb)是人和哺乳動物腸道內(nèi)重要的益生菌，具有抗菌、抑瘤、免疫調(diào)節(jié)和營養(yǎng) 等多種生理作用。近年來，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，以Bb為載體傳遞系統(tǒng)，已在細菌、病毒、腫瘤等領(lǐng)域構(gòu)建了一系列重組雙歧桿菌。而在寄生蟲領(lǐng)域方面，尚未見豬帶絳蟲重組Bb的報道，因此，本研究擬通過全基因合成帶有接頭的豬帶絳蟲TS045W-4B-TS0L18融合基因，將其定向克隆到大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭表達載體pGEX-Ι λ T中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-TS045W-4B-TS0L18，電穿孔轉(zhuǎn)化長雙歧桿菌(B.1ongum)，構(gòu)建豬帶絳蟲重組Bb (pGEX-TS045ff-4B-TS0L18)疫苗，為豬囊尾蝴病的防治提供一種有價值的新型疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是:通過全基因合成帶有接頭的豬帶絳蟲TS045W-4B-TS0L18融合基因，將其定向克隆到大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭表達載體pGEX-Ι λ T中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-TS045W-4B-TS0L18，電穿孔轉(zhuǎn)化長雙歧桿菌{B.1ongum)，構(gòu)建豬帶絳蟲重組Bb (pGEX-TS045ff-4B-TS0L18)疫苗，為豬囊尾蝴病的防治提供一種有價值的新型疫苗。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種豬帶絳蟲TS045W-4B-TS0L18融合基因重組雙歧桿菌疫苗制備及鑒定方法，包括以下步驟:(1)TS045W-4B-TS0L18融合基因合成和引物設(shè)計:根據(jù)豬帶絳蟲TS045W-4B和TS0L18基因序列，將TS045W-4B和TS0L18基因片段用甘氨酸接頭(Gly4Ser) 3 linker連接,通過全基因合成的方法,設(shè)計全長拼接引物,在引物的兩端分別加入BamH I和EcoR I酶切位點和保護性堿基，合成長度為789bp的TS045W-4B-TS0L18
融合基因；
(2)重組質(zhì)粒pGEX-TS045W-4B-TS0L18的構(gòu)建及鑒定:合成基因的PCR產(chǎn)物與克隆載體PMD18-T在T4DNA連接酶作用下，連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli ToplO感受態(tài)細胞，冰浴，水浴，冰浴冷卻后加入LB培養(yǎng)液，振搖，離心，棄上清，剩余200 μ I混勻涂于含Amp的LB瓊脂平板上，倒置培養(yǎng)12~16h ;挑取單菌落至含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，振搖培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進行PCR鑒定；然后將重組質(zhì)粒pMD18-T-TS045W-4B-TS0L18與表達載體pGEX_l λ T分別用BamH I和EcoR I雙酶切，膠回收相應(yīng)片段后用T4DNA連接酶16°C連接，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5a感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，抽提質(zhì)粒，進行酶切和測序鑒定；
(3)豬帶絳蟲重組Bb(pGEX-TS045W-4B-TS0L18)疫苗的構(gòu)建及鑒定
①B.1ongum感受態(tài)細菌的制備:將B.1ongum凍干粉用無菌水充分溶解后,涂布于MRS瓊脂平板上，厭氧培養(yǎng)24~72h，使其充分活化；挑取活化的單菌落，接種于MRS液體培養(yǎng)中厭氧培養(yǎng)；然后按1:25比例接種于含蔗糖的MRS培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)24~72h ;冰浴，離心，棄上清，沉淀用預冷的蔗糖清洗，再用蔗糖緩沖液重懸；此細菌可立即用于電轉(zhuǎn)化，或者加入預冷的甘油，_80°C凍存?zhèn)溆茫?br> ②重組質(zhì)粒PGEX-TS045W-4B-TS0L18電轉(zhuǎn)化B.1ongum感受態(tài)細菌:取備用的重組質(zhì)粒PGEX-TS045W-4B-TS0L18與B.1ongum感受態(tài)細菌混勻，冰浴10~15min后轉(zhuǎn)移至電擊杯中，電擊完畢后立即將混合液轉(zhuǎn)入到MRS液體培養(yǎng)基的EP管中，厭氧培養(yǎng)；將菌液涂布于含氨芐青霉素的MRS瓊脂平板上,厭氧培養(yǎng)24~72h ；
③豬帶絳蟲重組Bb(pGEX-TS045W-4B-TS0L18)疫苗的鑒定:挑取上述平板中單個菌落至含氨芐青霉素的MRS培養(yǎng)基·的EP管中，厭氧培養(yǎng)24~72h ;將菌液離心，棄上清，沉淀中加入蔗糖溶液重溶菌體沉淀，溫浴，期間振蕩使其充分反應(yīng)；抽提質(zhì)粒，進行酶切、PCR和測序鑒定。
[0007]步驟②中所述的電擊參數(shù)設(shè)置為:電壓1.25KV、場強12.5 KV/cm、電容25 μ F、電阻200 Ω、轉(zhuǎn)化時間5ms ο
[0008]本發(fā)明達到的有益效果:通過全基因合成豬帶絳蟲TS045W-4B-TS0L18融合基因，將該融合基因定向克隆到大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭表達載體pGEX-Ι λ T中，構(gòu)建重組質(zhì)粒PGEX-TS045W-4B-TS0L18，電穿孔法將該質(zhì)粒導入Bb，構(gòu)建豬帶絳蟲重組Bb (pGEX-TS045W-4B-TS0L18)疫苗，通過酶切、PCR和測序進行鑒定，證明成功構(gòu)建了豬帶絳蟲重組Bb (pGEX-TS045W-4B-TS0L18)疫苗。本發(fā)明的疫苗是一種新型疫苗，具有許多優(yōu)點:①構(gòu)建的重組Bb疫苗是活疫苗，可在體內(nèi)長期存活并不斷表達外源抗原，單次接種即可持續(xù)誘導對靶抗原的反應(yīng)，產(chǎn)生持久的免疫應(yīng)答；②運用分子生物學手段，通過對靶抗原的剪切或修飾，可使新型疫苗理想化Bb本身具有廣泛的生理活性，因此，在作為疫苗應(yīng)用的同時，Bb能夠發(fā)揮本身具有的益生功能，達到一劑多用的目的；④生產(chǎn)簡單，所表達的保護性抗原不需純化，無需佐劑，可直接用于免疫接種，免去了蛋白質(zhì)后處理的復雜工序，從而大大降低了疫苗的成本，適于大批量生產(chǎn)接種途徑方便，可采用滴鼻、口服等人群易接受的途徑進行免疫；⑥鑒于Bb具有公認的安全性和獨特的可口風味，疫苗可通過添加到酸奶等飲料中的方法進行應(yīng)用，可望成為廣大人群預防、控制豬囊尾蝴病的一種安全可靠的嶄新手段和途徑。因此，選擇人體正常菌群的雙歧桿菌(Bb)為載體，構(gòu)建豬帶絳蟲的重組Bb疫苗，可能是預防和控制豬囊尾蝴病較為安全、有效的一種新型疫苗，將該疫苗用于流行區(qū)人豬囊尾蝴病的防治具有重大的社會效益和經(jīng)濟效益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1為重組質(zhì)粒pGEX-TS045W-4B-TS0L18的雙酶切鑒定，其中1:DNA分子質(zhì)量標準；2:重組質(zhì)粒pGEX-TS045W-4B-TS0L18的雙酶切產(chǎn)物；
圖2為重組質(zhì)粒pGEX-TS045W-4B-TS0L18的測序鑒定；
圖3為B.1ongum中重組質(zhì)粒pGEX-TS045W-4B_TS0L18的雙酶切鑒定，其中M =DNA分子質(zhì)量標準；1:重組質(zhì)粒 PGEX-TS045W-4B-TS0L18 ；2:重組質(zhì)粒 pGEX-TS045W-4B_TS0L18 的雙酶切產(chǎn)物；
圖4為B.1ongum中重組質(zhì)粒pGEX-TS045W-4B_TS0L18的PCR鑒定，其中M:DNA分子質(zhì)量標準；1~7:雙歧桿菌中重組質(zhì)粒pGEX-TS045W-4B-TS0L18的PCR產(chǎn)物；
圖5為B.1ongum中重組質(zhì)粒pGEX-TS045W-4B_TS0L18的測序鑒定。
【具體實施方式】
[0010]本發(fā)明的豬帶 絳蟲TS045W-4B-TS0L18融合基因重組雙歧桿菌疫苗制備及鑒定方法，包括以下步驟:
(DTS045W-4B-TS0L18融合基因合成和引物設(shè)計:根據(jù)豬帶絳蟲TS045W-4B和TS0L18基因序列，將TS045W-4B和TS0L18基因片段用甘氨酸接頭(Gly4Ser)3 linker連接，通過全基因合成的方法，設(shè)計全長拼接引物，在引物的兩端分別加入BamH I和EcoR I酶切位點和保護性堿基，由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成長度為789bp的TS045W-4B-TS0L18融
合基因。
[0011](2)重組質(zhì)粒PGEX-TS045W-4B-TS0L18的構(gòu)建及鑒定:合成基因的PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD18-T在T4DNA連接酶作用下，16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli ToplO感受態(tài)細胞，冰浴30min，42°C水浴90s，冰浴冷卻后加入900 μ ILB培養(yǎng)液，37°C 225rpm振搖45 min,離心,棄上清400 μ I左右,剩余200 μ I混勻涂于含50 μ g/mlAmp的LB瓊脂平板上，37 °C倒置培養(yǎng)12~16h。挑取單菌落至含50 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37 °C 225rpm振搖培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，進行PCR鑒定。然后將重組質(zhì)粒pMD18-T-TS045W-4B-TS0L18與表達載體PGEX-1 λ T分別用BamH I和EcoR I雙酶切，膠回收相應(yīng)片段后用T4DNA連接酶16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化至Ε.coli DH5a感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，抽提質(zhì)粒，進行酶切和測序鑒定。
[0012]重組質(zhì)粒pGEX-TS045W-4B-TS0L18 的酶切鑒定:
重組質(zhì)粒PGEX-TS045W-4B-TS0L18經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切，用1%瓊脂糖凝膠電泳，得到 4944 bp 的 pGEX-Ι λ T 載體片段和 789bp (351bp+45bp+393bp=789bp)的TS045W-4B-TS0L18融合基因片段，與預期結(jié)果相符(圖1)。
[0013]重組質(zhì)粒pGEX-TS045W-4B-TS0L18 的測序鑒定:
合成的TS045W-4B-TS0L18融合基因，亞克隆到pGEX_l λ T載體的BamH I和EcoR I位點，測序結(jié)果與預期序列100%匹配(圖2)。[0014](3)豬帶絳蟲重組Bb (pGEX-TS045ff-4B-TS0L18)疫苗的構(gòu)建及鑒定
①B.1ongum感受態(tài)細菌的制備:將購買的B.1ongum凍干粉用無菌水充分溶解后,涂布于MRS瓊脂平板上，37°C厭氧培養(yǎng)24~72h，使其充分活化；挑取活化的單菌落，接種于4mlMRS液體培養(yǎng)中，37°C厭氧培養(yǎng)至菌體0D600nm值為0.5左右；按1:25比例接種于含
0.5M蔗糖的 MRS 培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng) 24 ~72h JM#30min，4°C 10000r/min 離心 lmin，棄上清，沉淀用預冷的0.5M蔗糖清洗2次，再用100 μ 10.5Μ蔗糖緩沖液重懸；此細菌可立即用于電轉(zhuǎn)化，或者加入預冷的15%甘油，_80°C凍存?zhèn)溆谩?br> [0015]②重組質(zhì)粒PGEX-TS045W-4B-TS0L18電轉(zhuǎn)化B.1ongum感受態(tài)細菌:取備用的重組質(zhì)粒 pGEX-TS045W-4B-TS0L181 μ g 與 B.1ongum 感受態(tài)細菌 100 μ I 混勻，冰浴 10 ~15min后轉(zhuǎn)移至至Imm的電擊杯中，電擊參數(shù)設(shè)置為:電壓1.25KV、場強12.5 KV/cm、電容25 μ F、電阻200 Ω、轉(zhuǎn)化時間5ms ；電擊完畢后立即將混合液轉(zhuǎn)入到900 μ IMRS液體培養(yǎng)基的EP管中，37°C厭氧培養(yǎng)2h ;將菌液涂布于含100 μ g/ml氨芐青霉素的MRS瓊脂平板上，37°C厭氧培養(yǎng)24~72h。
[0016]③豬帶絳蟲重組Bb (pGEX-TS045W-4B-TS0L18)疫苗的鑒定:挑取上述平板中單個菌落至Iml含100 μ g/ml氨芐青霉素的MRS培養(yǎng)基的EP管中，37°C厭氧培養(yǎng)24~72h ;將菌液4°C 10000r/min離心5min，棄上清，沉淀中加入250 μ I 25%蔗糖溶液重溶菌體沉淀，37°C溫浴30min，期間每隔5min振蕩I次，使其充分反應(yīng)；抽提質(zhì)粒，進行酶切、PCR和測序鑒定。
[0017]B.1ongum 中重組質(zhì)粒 pGEX-TS045W-4B_TS0L18 的酶切鑒定:
從具有氨芐青霉素抗性的B.1ongum中抽提的重組質(zhì)粒pGEX-TS045W-4B_TS0L18，經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切，用1%瓊脂糖凝膠電泳，得到4944 bp的pGEX_l λ T載體片段和789bp(351bp+45bp+393bp=789bp)的 TS045W-4B-TS0L18 融合基因片段，與預期結(jié)果相符(圖 3)。
[0018]B.1ongum 中重組質(zhì)粒 pGEX-TS045W-4B_TS0L18 的 PCR 鑒定:
以從具有氨芐青霉素抗性的B.1ongum中抽提的重組質(zhì)粒pGEX-TS045W-4B_TS0L18為模板進行PCR擴增可得到888bp的基因片段，除去載體序列99bp，TS045W-4B-TS0L18融合基因?qū)嶋H的長度為789bp，與預期結(jié)果相符(圖4)。
[0019]B.1ongum 中重組質(zhì)粒 pGEX-TS045W-4B_TS0L18 的測序鑒定:
從具有氨芐青霉素抗性的B.1ongum中抽提的重組質(zhì)粒pGEX-TS045W-4B_TS0L18，其測序結(jié)果與預期序列100%匹配(圖5)。
【權(quán)利要求】
1.一種豬帶絳蟲TS045W-4B-TS0L18融合基因重組雙歧桿菌疫苗制備及鑒定方法，其特征在于:包括以下步驟: (DTS045W-4B-TS0L18融合基因合成和引物設(shè)計:根據(jù)豬帶絳蟲TS045W-4B和TS0L18基因序列，將TS045W-4B和TS0L18基因片段用甘氨酸接頭(Gly4Ser) 3 linker連接，通過全基因合成的方法，設(shè)計全長拼接引物，在引物的兩端分別加入BamH I和EcoR I酶切位點和保護性堿基，合成長度為789bp的TS045W-4B-TS0L18融合基因； (2)重組質(zhì)粒pGEX-TS045W-4B-TS0L18的構(gòu)建及鑒定:合成基因的PCR產(chǎn)物與克隆載體PMD18-T在T4DNA連接酶作用下，連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli ToplO感受態(tài)細胞，冰浴，水浴，冰浴冷卻后加入LB培養(yǎng)液，振搖，離心，棄上清，剩余200 μ I混勻涂于含Amp的LB瓊脂平板上，倒置培養(yǎng)12~16h ;挑取單菌落至含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，振搖培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進行PCR鑒定；然后將重組質(zhì)粒pMD18-T-TS045W-4B-TS0L18與表達載體pGEX_l λ T分別用BamH I和EcoR I雙酶切，膠回收相應(yīng)片段后用T4DNA連接酶16°C連接，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5a感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，抽提質(zhì)粒，進行酶切和測序鑒定； (3)豬帶絳蟲重組Bb(pGEX-TS045W-4B-TS0L18)疫苗的構(gòu)建及鑒定 ①B.1ongum感受態(tài)細菌的制備:將B.1ongum凍干粉用無菌水充分溶解后,涂布于MRS瓊脂平板上，厭氧培養(yǎng)24~72h，使其充分活化；挑取活化的單菌落，接種于MRS液體培養(yǎng)中厭氧培養(yǎng)；然后按1:25比例接種于含蔗糖的MRS培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)24~72h ;冰浴，離心，棄上清，沉淀用預冷的蔗糖清洗，再用蔗糖緩沖液重懸；此細菌可立即用于電轉(zhuǎn)化，或者加入預冷的甘油，_80°C凍存?zhèn)溆茫? ②重組質(zhì)粒PGEX-TS045W-4B-TS0L18電轉(zhuǎn)化B.1ongum感受態(tài)細菌:取備用的重組質(zhì)粒PGEX-TS045W-4B-TS0L18與B.1ongum感受態(tài)細菌混勻，冰浴10~15min后轉(zhuǎn)移至電擊杯中，電擊完畢后立即將混合液轉(zhuǎn)入到MRS液體培養(yǎng)基的EP管中，厭氧培養(yǎng)；將菌液涂布于含氨芐青霉素的MRS瓊脂平板上,厭氧培養(yǎng)24~72h ； ③豬帶絳蟲重組Bb(pGEX-TS045W-4B-TS0L18)疫苗的鑒定:挑取上述平板中單個菌落至含氨芐青霉素的MRS培養(yǎng)基的EP管中，厭氧培養(yǎng)24~72h ;將菌液離心，棄上清，沉淀中加入蔗糖溶液重溶菌體沉淀，溫浴，期間振蕩使其充分反應(yīng)；抽提質(zhì)粒，進行酶切、PCR和測序鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬帶絳蟲TS045W-4B-TS0L18融合基因重組雙歧桿菌疫苗制備及鑒定方法，其特征在于:步驟②中所述的電擊參數(shù)設(shè)置為:電壓1.25KV、場強12.5KV/cm、電容25 μ F、電阻200 Ω、轉(zhuǎn)化時間5ms。
【文檔編號】C12N1/21GK103623398SQ201310617144
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】周必英 申請人:遵義醫(yī)學院