一種細(xì)胞內(nèi)表達(dá)花生過敏原的重組乳酸乳球菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明闡述了細(xì)胞內(nèi)表達(dá)花生過敏原Arah2的重組乳酸乳球菌菌株的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。本發(fā)明對花生過敏原Arah2的天然基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化得到優(yōu)化基因nArah2，構(gòu)建了針對nArah2的胞內(nèi)表達(dá)方式的重組載體和乳酸乳球菌工程菌。本發(fā)明涉及的重組菌株作為口服疫苗免疫小鼠，可有效調(diào)節(jié)小鼠過敏性的免疫反應(yīng)；因此本發(fā)明可被開發(fā)為粘膜疫苗用于花生過敏的預(yù)防和治療。
【專利說明】一種細(xì)胞內(nèi)表達(dá)花生過敏原的重組乳酸乳球菌及其應(yīng)用
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞內(nèi)表達(dá)花生過敏原Arah2的重組乳酸乳球菌菌株，其構(gòu)建方法及應(yīng)用，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【【背景技術(shù)】】
[0002]花生過敏是最嚴(yán)重而且常見的食物過敏反應(yīng)之一，具有發(fā)病快、致死率高及終生性等特點。近些年來，花生過敏的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)有逐年上升的趨勢。在美國，有1.1%的人口對花生過敏，其發(fā)病率在1997年至2002年間增長了近一倍。誘導(dǎo)特異性口服耐受，即在一段時間內(nèi)通過給予患者逐漸增加劑量的過敏原以誘導(dǎo)患者對此種食物抗原產(chǎn)生免疫耐受的治療方法，是目前比較有效的花生過敏治療方法。
[0003]高純度過敏原的獲取是進(jìn)行免疫耐受性誘導(dǎo)的前提和基礎(chǔ)。花生過敏原共有11種，其中Arah2是一種分子量為17_19KDa的糖蛋白，可被超過90%的患者血清中IgE特異性識別，是目前研究最廣泛也是最重要的花生過敏原之一。近些年來，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使利用生物合成方法獲取高純度的過敏原成為可能。目前已有國內(nèi)外研究者利用不同表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)花生過敏原，如陶愛林等(2012)在專利《一種重組花生過敏原與突變體及其制備方法和應(yīng)用》中介紹了利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備一種重組花生過敏原與突變體的方法；Katrin Lehmann等已成功利用大腸桿菌重組表達(dá)具有良好免疫原性的Arah2蛋白(KatrinLehmann,et al.High-yield expression in Escherichia coli,purification, andcharacterization of properly folded major peanut allergen Arah2.ProteinExpression and Purification, 2003, 31:250 - 259)。但大腸桿菌可產(chǎn)生結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多的內(nèi)毒素，且表達(dá)產(chǎn)物的后續(xù)純化成本高昂，限制了大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)的臨床應(yīng)用。
[0004]乳酸乳球菌長期以來被廣泛應(yīng)用于酸奶、奶酪、泡菜等傳統(tǒng)食品的生產(chǎn)中，是公認(rèn)安全的微生物。利用乳酸乳球菌表達(dá)外源蛋白可無需純化連同菌體一起服用，同時利用乳酸乳球菌作為表達(dá)載體的黏膜疫苗可有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)和免疫耐受。因此，我們利用乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)作為粘膜疫苗呈遞載體,將花生過敏原Arah2在L.1actis細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，所構(gòu)建的重組乳酸乳球菌菌株在醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域具有重大意義。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種細(xì)胞內(nèi)表達(dá)花生過敏原蛋白nArah2的重組乳酸乳球菌菌株及其構(gòu)建方法，該菌株是用含有經(jīng)過密碼子優(yōu)化的編碼花生過敏原蛋白nArah2的編碼基因的重組質(zhì)粒pNZl轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌所獲得的，其中所使用的乳酸乳球菌可以是L.lactis NZ9000。轉(zhuǎn)化后篩選所獲得的菌株為L.lactis NZNH，該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，其保藏編號為CGMCC:8216。本發(fā)明還涉及所述重組乳酸乳球菌菌株的構(gòu)建方法，所述方法包括如下步驟:
[0006]a)對花生過敏原Arah2的天然基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化以得到優(yōu)化基因nArah2 ；b)利用優(yōu)化基因nArah2進(jìn)一步構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒；c)利用重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌并篩選鑒定獲取重組乳酸乳球菌菌株，其中所構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒是胞內(nèi)表達(dá)載體質(zhì)粒PNZ1，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒PNZl時包括以質(zhì)粒pUC57-nArah2為模板，利用引物PralF5’ -CATGCCATGGGTCAACAATGGGAATTACAAG-3’ 和PralR:5’-CGGGGTACCTTAATAACGATCACGACCAC-3’ 對nArah2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，步驟c)中的轉(zhuǎn)化方法是電轉(zhuǎn)化。
[0007]本發(fā)明還涉及包含所述的重組乳酸乳球菌菌株的疫苗，所述疫苗可以是口服制劑，例如膠囊劑、錠劑、粉劑或顆粒劑等。
[0008]本發(fā)明還涉及所述的重組質(zhì)?；蛑亟M乳酸乳球菌菌株在制備可用于治療花生過敏的乳酸乳球菌疫苗中的用途。
[0009]本發(fā)明中重組花生過敏原蛋白nArah2成功地在L.lactis NZ9000細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，且動物實驗結(jié)果表明，胞內(nèi)表達(dá)方式的重組疫苗可以調(diào)節(jié)過敏性的系統(tǒng)免疫反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)Th2型免疫應(yīng)答向Thl型免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)變。
[0010]因此，優(yōu)化的花生過敏原nArah2基因可以重組質(zhì)粒DNA疫苗的形式用于花生過敏的預(yù)防及治療；重組乳酸乳球菌菌株可以膠囊、錠劑、粉包、顆粒狀包裝的形式，作為一種新型的口服疫苗應(yīng)用于花生過敏的臨床預(yù)防及免疫治療。
[0011]本發(fā)明涉及的重組乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZNH,于2013年9月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC N0.8216。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0012]圖1乳酸乳球菌重組質(zhì)粒PNZl的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0013]圖2:重組菌株L.lactis NZNH中蛋白表達(dá)情況的Western blot檢測圖:泳道I為純化的nArah2蛋白作為陽性對照，泳道2、3分別為菌株L.lactis NZ48的培養(yǎng)物上清和細(xì)胞沉淀組分，泳道4、5分別為菌株L.lactis NZNH的培養(yǎng)物上清和細(xì)胞沉淀組分；
[0014]圖3:動物實驗免疫程序圖；
[0015]圖4:激發(fā)后血清中特異性抗體水平:A-C分別為特異性的IgE、IgG2a、IgGl水平；如圖所示:與Sham組和Vector組相比,口服L.lactis NZNH可降低血清中特異性IgE和IgGl水平，增加特異性IgG2a水平；
[0016]圖5:激發(fā)后血清中mMCP-1水平:*表示實驗組與Sham組之間差異性顯著，P〈0.05。如圖所示，與Sham組相比，CYT組小鼠血清中mMCP-1水平顯著降低；這說明口服L.lactis NZNH可顯著抑制肥大細(xì)胞脫粒。
【【具體實施方式】】
[0017]以下通過實施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下例實施例中未注明具體條件的實驗方法，基本上都按照常見的分子克隆手冊進(jìn)行實驗操作，各種試劑如無特殊說明，其濃度均為質(zhì)量百分比濃度。
[0018]實施例1 Arah2基因序列的密碼子優(yōu)化
[0019]首先利用信號肽預(yù) 測軟件SignalP 4.1 Server對Arah2的氨基酸序列(genbank:AAN77576.1)的信號肽序列進(jìn)行了預(yù)測，在與上述氨基酸序列相對應(yīng)的基因序列(genbank:AY158467.1)中去除預(yù)測得到的信號肽序列，得到待優(yōu)化的原始核苷酸序列。
[0020]根據(jù)乳酸乳球菌偏愛密碼子表對原始核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的基因命名為nArah2,由生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行全基因合成，并亞克隆至載體pUC57上，得到PUC57-nArah2 (由上海生工合成，其中pUC57為商業(yè)化質(zhì)粒)。
[0021]優(yōu)化前天然基因序列(genbank:AY158467.1),如 SEQ ID N0.1。
[0022]優(yōu)化后基因序列(nArah2)，SEQID N0.2。
[0023]優(yōu)化前氛基酸序列(genbank:AAN77576.1), SEQ ID N0.3?
[0024]優(yōu)化后氨基酸序列，SEQ ID N0.4。
[0025]實施例2重組表達(dá)載體pNZl的構(gòu)建
[0026]以質(zhì)粒pUC57_nArah2 (由上海生工合成)為模板，利用引物PralF 5’-CATGCCATGGGTCAACAATGGGAATTACAAG-3’ 和 PralR:5’-CGGGGTACCTTAATAACGATCACGACCAC-3’ 對nArah2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(總體積為50 y L)為:10XK0D plus buffer:5u L ；dNTP:5u L ；MgS04:2 y L ;DNA 模板:2 y L ;上游引物 / 下游引物(20 y M):各 I y L ;KOD plus:0.5 u L ；ddH20:33.5 u L0 反應(yīng)程序:95 °C 30s(變性)，61°C 30s (退火)，68 °C 50s (延伸)，擴(kuò)增30次循環(huán)。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收純化nArah2基因片段。將回收純化的擴(kuò)增片段和載體pNZ8148 (Mierau and Kleerebezem.1Oyears ofthe nisin-co ntrolled gene expression system(NICE)in Lactococcus lactis.ApplMicrobiol Biotechnol.2005,68(6):705-717)經(jīng)雙酶切后進(jìn)行連接反應(yīng)，得到重組載體pNZ8148-nArah2，命名為pNZl，質(zhì)粒組成參見圖1。
[0027]實施例3重組乳酸乳球菌的制備
[0028]將上述構(gòu)建質(zhì)粒pNZl 電擊轉(zhuǎn)化 L.lactis NZ9000 (Kuipers et al.Quorumsensing-controlled gene expression in lactic acid bacteria.Journal ofBiotechnology.1998，64 (I): 15-21)感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR和雙酶切驗證并送至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測序驗證，將測序正確的轉(zhuǎn)化子命名為L.1actisNZNH，將攜帶空質(zhì)粒菌株 L.lactis NZ9000/pNZ8148 命名為 L.lactis NZ48。
[0029]實施例4 Western blot分析重組蛋白的表達(dá)情況
[0030](I)重組L.lactis NZ9000菌株的誘導(dǎo)表達(dá):
[0031]挑取驗證正確的重組菌株的單菌落接入含10 u g/ml氯霉素(Cm) GMl7培養(yǎng)基(每升GM17培養(yǎng)基配方:大豆蛋白胨5g,細(xì)菌蛋白胨5g,牛肉膏5g,酵母粉2.5g,葡萄糖5g,3 -磷酸甘油二鈉19g，維生素C0.5g，lmol/L MgSO4ImL)中，30°C靜置培養(yǎng)過夜；將過夜培養(yǎng)菌液以2%接種量轉(zhuǎn)接入GM17 (Cm 10 u g/ml)液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)至0D_約為0.6，WAnisin (Sigma，購自上海悠揚生物科技有限公司)作為誘導(dǎo)物，使其終濃度為50ng/ml，30°C繼續(xù)培養(yǎng)6小時。
[0032](2)蛋白樣品制備:
[0033]誘導(dǎo)結(jié)束后將菌液于4°C，5，OOOg離心lOmin，所得菌體沉淀用PBS洗滌兩次后，重懸于PBS中。將菌懸液進(jìn)行超聲破碎，4°C，12，OOOXg離心30min后收集上清，-80°C保存以待檢測；向培養(yǎng)物上清液中加入100% (w/v)三氯乙酸(TCA)至終濃度為16% (w/v)，冰上放置至少30min，4°C，12，OOOXg離心30min，收集沉淀用預(yù)冷的丙酮洗滌兩次，最后將沉淀溶解于50mM NaOH溶液中，_80°C保存以待檢測。[0034](3) Western blot分析重組蛋白表達(dá)情況:
[0035]上述制備的蛋白樣品經(jīng)12%SDS-PAGE凝膠分離后，150mA恒流轉(zhuǎn)膜50min將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore，購自中科瑞泰生物科技有限公司)上；轉(zhuǎn)印膜經(jīng)TBST (每升
10X TBS 緩沖液配方=Tris 2.42g，NaCl 8g，用 HCl 調(diào) PH 至 7.6 ;TBST 緩沖液配方=IOXTBS100ml，蒸餾水900ml, Tween-20 0.1%)洗滌后，用TBST (含5%脫脂奶粉)室溫封閉1.5h ;然后轉(zhuǎn)印膜與一抗(1:750稀釋度)于4°C過夜孵育；用HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(1: 1.2 X IO4稀釋度，購自上海悠揚生物科技有限公司)和轉(zhuǎn)印膜室溫條件下雜交Ih后向轉(zhuǎn)印膜上滴加顯色液(購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)后避光條件下顯色。檢測結(jié)果參見圖2。如圖所示:陰性對照菌株的上清及沉淀部分(泳道2和3)中未檢測出信號，在陽性對照(泳道I)及菌株L.lactis NZNH的沉淀部分(泳道5)均檢測出約19kDa片段(與nArah2蛋白的預(yù)期大小一致)，而在菌株L.lactis NZNH的上清部分(泳道4)無相應(yīng)的信號檢出。
[0036]實施例5動物模型評價疫苗免疫效果
[0037]疫苗制備過程如下:重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)步驟如上所述。將誘導(dǎo)結(jié)束后的菌液4°C，5，000g離心lOmin，所得菌體沉淀用無菌PBS洗滌兩次后重懸于PBS中，使其濃度為I X 101(lCFU/ml，所得新鮮菌懸液用于免疫動物。
[0038]動物實驗流程如圖3所示:40只3-5周齡雌性C3H/HeJ小鼠(購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司)適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分成4組(10只/組)，動物實驗分三個階段:
[0039](I)預(yù)防階段 :第-14-0連續(xù)兩周每天灌胃2X IO9CFU新鮮制備的重組菌株；
[0040](2)致敏階段:第0、1、2、7、14、21天灌胃1211^花生蛋白粗提物(0?￡)和101^ CT;
[0041](3)激發(fā)階段:第28天灌胃30mg CPE進(jìn)行激發(fā)。
[0042]設(shè)第I組為天然組(Naive group)，在整個實驗過程中正常喂養(yǎng)。第2組為模型組(Sham group)，在預(yù)防階段灌胃PBS，而在致敏階段進(jìn)行正常的致敏。第3、4組(分別命名為Vector組和CYT組)為實驗組，在預(yù)防階段分別灌胃重組菌株L.lactis NZ48和L.1actisNZNH，在致敏階段均灌胃CPE和CT進(jìn)行致敏。所有組別的小鼠均在第28天灌胃CPE進(jìn)行激發(fā)。
[0043]第35天激發(fā)后30_40min收集小鼠血清樣品，_80°C保存用于后續(xù)檢測血清中過敏原特異性抗體和mMCP-1水平；實驗結(jié)束后處死小鼠并無菌分離小鼠脾臟制備脾細(xì)胞懸液，加入50 u g/mL花生粗提物(CPE)于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)72h，收集上清保存于_80°C用于檢測細(xì)胞因子水平。
[0044]實驗結(jié)果表明:與Sham組和Vector組相比，激發(fā)后CYT組小鼠的血清特異性IgE和IgGl水平有所降低，特異性IgG2a水平升高(參見圖4)，說明胞內(nèi)表達(dá)方式的乳酸乳球菌重組疫苗可以在一定程度上抑制Th2型抗體反應(yīng)，促進(jìn)Thl型抗體反應(yīng)的發(fā)生；同時CYT組小鼠體內(nèi)肥大細(xì)胞脫粒也受到抑制(參見圖5)。灌胃重組菌株Llactis NZNH還可抑制小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th2型細(xì)胞因子IL-4的分泌，促進(jìn)脾細(xì)胞中Thl型細(xì)胞因子IFN-Y、IL-12的產(chǎn)生和提高Thl/Th2細(xì)胞因子比例(參見表1)?；谝陨辖Y(jié)果，本發(fā)明中胞內(nèi)表達(dá)方式疫苗可逆轉(zhuǎn)Th2型免疫應(yīng)答向Thl型免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)變，對花生過敏具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。
[0045]表1:脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子水平
【權(quán)利要求】
1.一種能在細(xì)胞內(nèi)重組表達(dá)花生過敏原nArah2的重組乳酸乳球菌菌株，其特征在于，所述菌株為Lactococcus lactis NZNH,于2013年9月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC N0.8216。
2.包含權(quán)利要求1所述的重組乳酸乳球菌菌株的疫苗，其特征在于，所述疫苗為口服制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的包含重組乳酸乳球菌菌株的疫苗，其特征在于，所述口服制劑為膠囊劑、錠劑、粉劑、錠劑或顆粒劑。
4.權(quán)利要求1所述的重組乳酸乳球菌菌株在制備可用于治療花生過敏的乳酸乳球菌疫苗中的用途。
5.一種制備權(quán)利要求1所述的重組乳酸乳球菌菌株的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟: a)對花生過敏原Arah2的天然基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化以得到優(yōu)化基因nArah2，如SEQ N0.2 所示； b)利用優(yōu)化基因nArah2進(jìn)一步構(gòu)建胞內(nèi)表達(dá)載體質(zhì)粒PNZl； c)利用重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌并篩選鑒定獲取重組乳酸乳球菌菌株。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所 述的制備重組乳酸乳球菌菌株的方法，其特征在于步驟b)中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒PNZl時包括以質(zhì)粒pUC57-nArah2為模板，利用引物PralF5’ -CATGCCATGGGTCAACAATGGGAATTACAAG-3’ 和 PralR:5’-CGGGGTACCTTAATAACGATCACGACCAC-3’ 對 nArah2 基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備重組乳酸乳球菌菌株的方法，其特征在于步驟c)中的轉(zhuǎn)化方法是電轉(zhuǎn)化。
【文檔編號】C12R1/01GK103642746SQ201310648469
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月4日
【發(fā)明者】張秋香, 陳衛(wèi), 任晟誠, 王剛, 田豐偉, 劉小鳴, 趙國忠, 趙建新, 張灝, 郭敏 申請人:江南大學(xué)