采用反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測蕪菁花葉病毒的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及采用反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測蕪菁花葉病毒的方法，其中該方法包括蕪菁花葉病毒總RNA提取，RT-LAMP反應(yīng)和實(shí)時(shí)濁度檢測以及電泳檢測，確定樣品是否帶有TuMV病毒。本發(fā)明根據(jù)蕪菁花葉病毒的基因保守區(qū)設(shè)計(jì)了RT-LAMP引物，采用一步法反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)建立了一種快速、靈敏、高度特異的檢測蕪菁花葉病毒的方法。為蕪菁花葉病毒的快速檢測提供了新的手段。
【專利說明】采用反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測蕪菁花葉病毒的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物病毒學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種采用反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測蕪菁花葉病毒的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蕪菁花葉病毒是馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)的成員之一，其寄主范圍很廣，可侵染43科156屬的300多種植物，包括油菜、白菜、甘藍(lán)、花椰菜等重要蔬菜，平均每年可造成蔬菜減產(chǎn)5-10%。該病害危害嚴(yán)重及防治困難，一直是蔬菜生產(chǎn)上的一個(gè)重要問題。要防治病毒病首先要對癥下藥。關(guān)于該病毒的檢測方法，目前普遍采用的檢測方法主要有指示植物法、電鏡技術(shù)、血清學(xué)技術(shù)和分子生物學(xué)檢測等。但上述方法均存在不同的缺點(diǎn)，例如，所需試驗(yàn)周期較長、操作繁瑣、靈敏度不高、特異性不強(qiáng)、準(zhǔn)確性較低、易受檢測材料限制等。
[0003]環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(Loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)技術(shù)是由T.Notomi發(fā)明的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)依賴四條特異引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶,在等溫條件下快速、高效、高特異、高靈敏地?cái)U(kuò)增祀序列(Notomietal,2000)。迄今已建立了針對多種病原性細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲等的LAMP檢測方法，在耐藥性基因檢測、家畜早期胚胎性別判定等方面也有相關(guān)報(bào)道。該方法應(yīng)用范圍廣泛，適于基層實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行快速檢測。本發(fā)明根據(jù)蕪菁花葉病毒基因保守區(qū)設(shè)計(jì)了 LAMP引物，采用一步法反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)建立了一種快速、靈敏、高度特異的檢測蕪菁花葉病毒的方法。為蕪菁花葉病毒的快速檢測提供了新的手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了一種采用反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測蕪菁花葉病毒的方法，其中該方法包括蕪菁花葉病毒總RNA提取，RT-LAMP反應(yīng)和實(shí)時(shí)濁度檢測以及電泳檢測，確定樣品是否帶毒，所述RT-LAMP反應(yīng)采用的引物組如下:
[0005]引物組，用于TuMV病毒的RT-LAMP反應(yīng):
[0006]外引物(F3和 B3):
[0007]SEQ ID N0.1:5’ -CGGAACCTCCCCGAACAT-3’:
[0008]SEQ ID N0.2:5’ -ATCGAGCTAAGCTCATGTCG-3’:
[0009]內(nèi)引物(FIP和 BIP):
[0010]SEQ ID N0.3:5’ -GTTTGGCGTGGTCAATGAGCGAAACGGAATGTGGGTGATGA-3’:
[0011]SEQ ID N0.4:5’ -GGCCCATTTCAGTGACGTAGCTCTGAAGACCATATCGTGGCA-3’:
[0012]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的采用反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測蕪菁花葉病毒的方法，其包括如下步驟:
[0013]I)病毒總RNA的提取:
[0014]提取待測樣品的總RNA ；
[0015]2) RT-LAMP 反應(yīng):[0016]使用外引物(F3和B3)和內(nèi)引物(FIP和BIP)對病毒總RNA進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0017]3)濁度檢測:
[0018]對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行濁度觀察，確定樣品是否感染所述病毒；
[0019]4)電泳檢測:
[0020]對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，獲得病毒基因擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，確定樣品是否感染TuMV病毒。
[0021]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測蕪菁花葉病毒的方法，其包括如下步驟:
[0022]I)病毒總RNA的提取:
[0023]提取待測樣品的總RNA;
[0024]2) RT-LAMP 反應(yīng):
[0025]使用外引物(F3和B3)和內(nèi)引物(FIP和BIP)對病毒總RNA進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0026]3)濁度觀察:
[0027]對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行濁度觀察，確定樣品是否感染所述病毒；
·[0028]4)電泳檢測:
[0029]對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，獲得病毒基因擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，確定樣品是否感染TuMV病毒。
[0030]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，在本發(fā)明上述的方法中，RT-LAMP反應(yīng)中使用的引物濃度比例為:外引物(F3和B3):內(nèi)引物(FIP和BIP) =0.2-0.4:1.2-1.6 ;優(yōu)選地，外引物(F3和 B3):內(nèi)引物(FIP 和 BIP) = I:4o
[0031]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，在本發(fā)明上述的方法中，RT-LAMP反應(yīng)中的反應(yīng)溫度優(yōu)選為50-62°C ;使用的反應(yīng)溫度更優(yōu)選為62°C。
[0032]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，在本發(fā)明上述的方法中，RT-LAMP反應(yīng)中的Mg2+濃度優(yōu)選為高于或等于5mM，更優(yōu)選為5mM。
[0033]蕪菁花葉病毒病常與其它病毒復(fù)合侵染，本發(fā)明經(jīng)過優(yōu)化和摸索實(shí)驗(yàn)條件建立了蕪菁花葉病毒的RT-LAMP檢測方法，極大地提高檢測效率，降低檢測成本。本發(fā)明的方法具有快速、靈敏、高度特異性等特點(diǎn)。本發(fā)明的方法已經(jīng)成功地應(yīng)用于室內(nèi)和田間蕪菁花葉病毒病害復(fù)合侵染的同步檢測。本發(fā)明證明了 RT-LAMP是一種檢測植物病毒的有效手段。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1:RT_LAMP實(shí)時(shí)濁度檢測反應(yīng)體系靈敏度；
[0035]圖2:RT-LAMP反應(yīng)結(jié)果濁度觀察圖；
[0036]圖3 =RT-LAMP反應(yīng)結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳圖，Ml:DM2000,1-6:pMD18-T_TuMV質(zhì)粒稀釋 Ing / μ l、100pg / μ l>10pg / μ l>lpg / μ l>100fg / μ l>10fg / μ I 做模板，7:陰性對照；
[0037]圖4 =RT-PCR 結(jié)果電泳圖，Ml:DM2000,1-6:pMD18-T_TuMV 質(zhì)粒稀釋 Ing / μ 1、IOOpg / μ 1、IOpg / μ 1、Ipg / μ 1、IOOfg / μ 1、IOfg / μ I 做模板，7:陰性對照；【具體實(shí)施方式】
[0038]為了理解本發(fā)明，下面以實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但下述實(shí)施例并不限制本發(fā)明。
[0039]材料與試劑
[0040]油菜健康葉片，病株葉片分別采自中國陜西楊凌、安康、漢中等地，采集葉片保存于-80°C冰箱中。
[0041]主要試劑:
[0042]Bst DNApolymerase 購自 NEB 公司；
[0043]Betaine, MgSO4 購自 Sigma 公司；
[0044]RNA提取試劑盒購自TaKaRa公司；
[0045]M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司；
[0046]Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司；
[0047]SYBR Green I 購自 Invitrogen 公司；
[0048]大腸桿菌(Escherichia,coli) JM109, DNA 標(biāo)準(zhǔn) Markerl 購自 Voson 公司；
[0049]膠回收試劑盒購自Bioteke公司。
[0050]實(shí)施例1
[0051]1.引物設(shè)計(jì)
[0052]首先本發(fā)明人從NCBI上下載了蕪菁花葉病毒的全基因組序列，使用Primer4.0 (http: / / primerexplorer.jp / e / v4_manual / index, html)設(shè)計(jì)了多組引物，然后根據(jù)引物所在序列區(qū)域的保守性、引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)、二聚體GC含量以及Tm值等綜合因素選擇了引物。引物組有4條引物，包括2條外引物(F3和B3)和2條內(nèi)引物(FIP和BIP)。所述引物參見SEQ ID N0.1-4。RT-PCR的引物，本發(fā)明使用莊木等的引物，參見SEQ ID N0.5-6。所有引物的信息見表1。
[0053]表1引物序列SEQ ID N0.1-4的信息:
[0054]
【權(quán)利要求】
1.一種采用反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測蕪菁花葉病毒(TuMV)的方法，其中該方法包括蕪菁花葉病毒總RNA提取，RT-LAMP反應(yīng)和實(shí)時(shí)濁度檢測以及電泳檢測，所述RT-LAMP反應(yīng)采用的引物組如下: 引物組，用于TuMV病毒的RT-LAMP反應(yīng): 外引物(F3和B3):
SEQ ID N0.1:5’ -CGGAACCTCCCCGAACAT-3’:
SEQ ID N0.2:5’ -ATCGAGCTAAGCTCATGTCG-3’: 內(nèi)引物(FIP和BIP):
SEQ ID N0.3:5’-GTTTGGCGTGGTCAATGAGCGAAACGGAATGTGGGTGATGA-3’:
SEQ ID N0.4:5’ -GGCCCATTTCAGTGACGTAGCTCTGAAGACCATATCGTGGCA-3’:。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述引物組包含所述全部4組引物SEQ ID N0.1-4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中該方法包括如下步驟: 1)病毒總RNA的提取: 提取待測樣品總RNA` ；
2)RT-LAMP 反應(yīng): 使用外引物(F3和B3)和內(nèi)引物(FIP和BIP)對病毒總RNA進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物； 3)濁度檢測: 對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行濁度觀察，確定樣品是否感染所述病毒； 4)電泳檢測: 對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，獲得病毒基因擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，確定樣品是否感染TuMV病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，其中所述RT-LAMP反應(yīng)中使用的引物濃度比例為:外引物(F3和B3):內(nèi)引物(FIP和BIP) =0.2-0.4:1.2-1.6。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，其中所述RT-LAMP反應(yīng)中的引物濃度為外引物(F3和B3):內(nèi)引物(FIP和BIP) =1:4。
6.權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，其中所述RT-LAMP反應(yīng)中的反應(yīng)溫度為50-62。。。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，其中所述RT-LAMP反應(yīng)中，TuMV引物使用的反應(yīng)溫度為62°C。
8.權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，其中所述RT-LAMP反應(yīng)中的Mg2+濃度為高于或等于5mM。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中RT-LAMP反應(yīng)中的Mg2+濃度為5mM。
【文檔編號】C12Q1/68GK103789449SQ201310659524
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2013年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月3日
【發(fā)明者】趙磊, 郝興安, 吳云鋒 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)