一種快速鑒定uORF對翻譯水平影響的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開了一種快速鑒定uORF對翻譯水平影響的方法。該方法包括下列步驟：對目的基因的uORF片斷進行擴增，得未突變的uORF片斷；以未突變的uORF片段為模板，對目的基因的uORF片斷進行定點突變并擴增，得突變的uORF片斷；分別將未突變的uORF片斷和突變的uORF片斷構(gòu)建重組質(zhì)粒；將上述重組質(zhì)粒采用基因槍方法分別導(dǎo)入植物組織細(xì)胞；培養(yǎng)植物組織細(xì)胞，用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測，比較突變型與未突變型的相對熒光素酶活性，鑒定uORF對目的基因翻譯水平的影響。該方法能夠快速鑒定uORF對翻譯水平影響。
【專利說明】一種快速鑒定uORF對翻譯水平影響的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種快速鑒定uORF對翻譯水平影響的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]真核生物mRNA 5'轉(zhuǎn)錄起始點和開放性閱讀框(open reading frame, 0RF)的起始密碼子ATG之間的核苷酸序列被稱作5'非編碼區(qū)。mRNA5'非編碼區(qū)中存在的上游開放性閱讀框(upstream open reading frame, uORF)在基因的翻譯水平上的調(diào)控具有重要作用，一些uORF對下游開放性閱讀框有抑制調(diào)控作用，而有一部分uORF則控制著mRNA的穩(wěn)定性[1]。盡管測序表明，許多真核生物序列中存在uORF對下游開放性閱讀框翻譯的影響研究，但局限于少部分基因。體內(nèi)和離體實驗表明uORF參與細(xì)胞生長調(diào)控，特別是通過細(xì)胞翻譯能力的調(diào)控，一部分uORF能抑制ORF的翻譯，也有一些對ORF影響不大，相反，有一些uORF能促進ORF翻譯。序列中這些uORF對翻譯水平影響的研究，對我們了解翻譯水平的基因表達調(diào)控具有重要意義。
[0003]Imai等發(fā)現(xiàn)[2]擬南芥acl5基因缺失的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出植株矮小的癥狀，而且SAC51基因的uORF若提前終止翻譯，則會引起下游開放性閱讀框的翻譯水平上升。Wiese等[3]研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥AtbZIPll基因存在蔗糖引起的翻譯抑制(SIRT)特性，且它的抑制翻譯調(diào)控 依賴于5'未翻譯區(qū)域。42個氨基酸編碼的一個uORF片段控制了下游主開放性閱讀框的翻譯作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蔗糖濃度的變化以應(yīng)對外界環(huán)境脅迫。
[0004]在瞬時基因表達方法中，基因槍導(dǎo)入法是一種比較快速有效的手段之一。通過基因槍將含有uORF片段的重組質(zhì)粒DNA，打入植物組織細(xì)胞，再測定其相對熒光素酶活性，從而鑒定uORF對其翻譯水平的影響。該方法的應(yīng)用在分子水平鑒定uORF的作用具有重要作用。
[0005]參考文獻:
[0006][I] Tran M.K., Schultz C.J.&Baumann U.(2008) Conserved upstream openreading frames in higher plants.BMC Genomics 9,361.[0007][2] Imai A.，Hanzawa Y.，Komura M.，Yamamoto K.T.，Komeda Y.&TakahashiT.(2006)The dwarf phenotype of the Arabidopsis acl5 mutant is suppressed by amutation in an upstream ORF of a bHLH gene.Development 133,3575 - 3585.[0008][3]Wiese A., Elzinga N., Wobbes B.&Smeekens S.(2004) A conserved upstreamopen reading frame mediates sucrose-1nduced repression of translation.The PlantCell 16， 1717 - 1729.
【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于為鑒定植物基因中uORF片段對翻譯水平的影響問題，提供一種快速鑒定uORF對翻譯水平影響的方法。[0010]本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0011]一種快速鑒定UORF對翻譯水平影響的方法，該方法包括下列步驟:
[0012]a.對目的基因的uORF片斷進行擴增，得未突變的uORF片斷；
[0013]b.以未突變的uORF片段為模板，對目的基因的uORF片斷進行定點突變并擴增，得突變的uORF片斷；
[0014]c.分別將未突變的uORF片斷和突變的uORF片斷構(gòu)建重組質(zhì)粒；
[0015]d.將上述重組質(zhì)粒采用基因槍方法分別導(dǎo)入植物組織細(xì)胞；
[0016]e.培養(yǎng)植物組織細(xì)胞(經(jīng)過22°C溫室培養(yǎng)24小時后)，用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測，比較突變型與未突變型的相對熒光素酶活性，鑒定uORF對目的基因翻譯水平的影響，即uORF對下游開放性閱讀框影響。
[0017]所述的方法，其中目的基因為AtHsfBl、tbz 17或AtPA03，對應(yīng)的uORF片段的序列分別為 SEQ ID No:1, SEQ ID No:2, SEQ ID No:3。
[0018]所述的方法，其中步驟b中定點突變是將Met的密碼子ATG突變?yōu)長eu密碼子TTG，或者將ATG突變?yōu)镃TG或GTG。原理就是不讓啟動子ATG啟動。
[0019]所述的方法，其中步驟a中對目的基因的uORF片斷進行擴增的方法為:
[0020]以植物幼嫩葉片為材料，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)目的基因的uORF片段堿基序列，設(shè)計上游引物與下游引物，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進行PCR反應(yīng)，擴增未突變uORF片段。片段可連接到pMD 18-T Simple載體，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，進行序列測定。
[0021]所述的方法，其中步驟b中對目的基因的uORF片斷進行人工定點突變并擴增的方法為:
[0022]根據(jù)定點突變的uORF片段的堿基序列，設(shè)計上游引物，下游引物同未突變uORF片斷的下游引物，以未突變的uORF片段為模板，用高保真酶進行PCR反應(yīng)，擴增突變的uORF片段。片段可連接到PMD 18-T Simple載體，轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，進行序列測定。
[0023]所述的方法，其中步驟c中構(gòu)建重組質(zhì)粒采用的表達載體為pGL3_Basic?？煞謩e用KpnI和SmaI雙酶切的未突變和突變片段與KpnI和SmaI雙酶切的表達載體pGL3-Basic連接，轉(zhuǎn)化，提取陽性質(zhì)粒，測序驗證。
[0024]所述的方法，其中步驟d中將重組質(zhì)粒采用基因槍方法導(dǎo)入植物組織細(xì)胞的方法為:通過基因槍roS-1000/He (Bio-Rad)的動力系統(tǒng)，將吸附重組質(zhì)粒的直徑為0.8-1.0 μ M優(yōu)選為1.0 μ M的金粉粒子，打入植物組織細(xì)胞。
[0025]所述的方法，其中步驟e中比較突變型與未突變型的相對熒光素酶活性，二者差異在兩倍以上，則說明uORF對目的基因翻譯水平的影響，反之，則沒有影響。突變型高于未突變型兩倍以上說明uORF起抑制作用，突變型低于未突變型兩倍以上說明uORF起增強作用。
[0026]本發(fā)明的有益效果:
[0027]本發(fā)明提供的方法得到突變的uORF片段，采用基因槍技術(shù)導(dǎo)入植物細(xì)胞，測定其相對熒光素酶活性，從而鑒定uORF對翻譯水平的影響。通過利用本方法可快速鑒定基因中5'未翻譯區(qū)域?qū)ο掠蔚姆g過程所起的作用，為研究5'未翻譯區(qū)域的片段在蛋白質(zhì)翻譯過程的作用機理提供基礎(chǔ)。所有的uORF都可以用這種方法來鑒定其對翻譯水平的影響，如果這個uORF具有保守性，那么它的影響作用將比較明顯；反之，如果這個uORF不具有保守性，那么突變或者不突變，它的活性基本不變，也就是說，uORF沒有影響作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為未突變的uORF片段瓊脂糖凝膠電泳分析。
[0029]圖中 M:DNA Marker ；1.AtHsfBl 的 uORF ；2.tbzl7 的 uORF ；3.AtPA03 的 uORF。
[0030]圖2為突變后的uORF片段瓊脂糖凝膠電泳分析。
[0031]圖中 M:DNA Marker ；1.AtHsfBl 的 uORF ；2.tbzl7 的 uORF ；3.AtPA03 的 uORF。突變后的uORF片段與未突變的uORF片段長度一致。
[0032]圖3植物表達載體pGL3_Bas i c圖譜。
【具體實施方式】
[0033]下面通過具體的實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步的說明。
[0034]實施例1:擬南芥熱休克轉(zhuǎn)錄因子基因AtHsfBl的uORF對其翻譯的影響作用鑒定。
[0035]擬南芥熱休克轉(zhuǎn)錄因子基因AtHsfBl的uORF片段，該片段的序列為SEQ ID N0.1。
[0036]1、對AtHsfBl的uORF片段進行人工突變的快速PCR定點突變方法，步驟如下:
[0037]1)擬南芥熱休克轉(zhuǎn)錄因子基因AtHsfBl的uORF片段的克隆
[0038]以提取的擬南芥幼嫩葉片為材料，取500mg嫩葉，按照Trizol RNA提取試劑盒(Takara)說明書方法提取葉片總RNA,按照PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)取
0.5 μ gRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RNase消化cDNA產(chǎn)物，參照AtHsfBl的uORF片段堿基序列(SEQ ID No: 1)，用Primer 5軟件設(shè)計引物擴增uORF片段(未突變)。
[0039]上游引物AtHsfBl-F:5' -CTTGGTACCATGGAAGAAACCAAACGA-3' (SEQ ID No:4)
[0040]下游引物AtHsfBl-R:5' -CTTCCCGGGGCAACTAAAAAGCAAGAG-3' (SEQ ID No:5)
[0041]以幼嫩葉片的cDNA為模板，進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
[0042]50μ l 反應(yīng)體系:10XPCR Buffer 5.0 μ 1，HsfBl 的上下游引物(SEQ ID No:4和 SEQ ID No:5)各 1.0 μ l (10 μ Μ)，dNTP mix 2.5 μ L(2.5mM)，cDNA 模板 1.0 μ 1，ddH2039.3 μ 1，Taq DNA Polymerase 0.2 μ l ;PCR 程序:95°C預(yù)變性 4min，95°C解鏈 30sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec,反應(yīng)35個循環(huán)，72°C延伸7min ;片段連接到pMD 18-T Simple載體，轉(zhuǎn)化DH 5α感受態(tài)細(xì)胞，進行序列測定，測序結(jié)果準(zhǔn)確無誤。
[0043]2)擬南芥熱休克轉(zhuǎn)錄因子AtHsfBl的uORF片段的定點突變
[0044]根據(jù)uORF片段的堿基序列和定點突變要求(ATG突變?yōu)門TG)，Primer 5軟件設(shè)計上游引物擴增突變的uORF片段(下游引物同上)。
[0045]上游引物AtHsfBl-Ft:5' -CTTGGTACCTTGGAAGAAACCAAACGA-3' (SEQ ID No:6)
[0046]以未突變的uORF片段為模板，用EX Taq高保真酶(TaKaRa公司，中國大連)進行PCR反應(yīng)。
[0047]50 μl 反應(yīng)體系:10XPCR Buffer 5.0 μ 1，AtHsfBl 的上下游引物(SEQ ID No:6和 SEQ ID No:5)各 1.0μ 1(10μΜ)，dNTP mix 2.5 μl (2.5mM)，未突變的 uORF 片段模板
1.0 μ LddH2O 39.3 μl, Taq DNA Polymerase 0.2 μ l ;PCR 程序:95°C預(yù)變性 4min，后 95°C解鏈30sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，反應(yīng)35個循環(huán)，72°C延伸7min ;片段連接到pMD 18-T Simple載體(TaKaRa公司，下同)，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，進行序列測定，測序結(jié)
果準(zhǔn)確無誤。[0048]2、分別構(gòu)建含有未突變uORF片斷及突變uORF片斷的重組質(zhì)粒:用KpnI和SmaI雙酶切分別連接有未突變片斷及突變片斷的pMD 18-T Simple，與KpnI和SmaI雙酶切的表達載體pGL3-Basic (突光素酶報告基因質(zhì)粒,其中包含一個突光素酶報告基因,在前面插入突變或未突變的片段來檢查報告基因表達情況，可以用熒光素酶活性來判斷熒光素酶報告基因表達情況，Promega公司)構(gòu)建重組質(zhì)粒，酶切體系40μ 1:10XH Buffer4.0 μ I, ddH2018 μ 1，pMD 18-T Simple (連接有未突變片斷或突變片斷)15 μ I，KpnI和SmaI各1.5 μ I ;37°C反應(yīng)2h ;產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠回收試劑盒(Axygen)回收質(zhì)粒pGL3-Basic大片段和uORF小片段。用T4連接酶連接兩個回收產(chǎn)物，連接反應(yīng)體系10 μ I =IOXLigaseBuffer 4.0 μ l，pGL3_Basic 大片段 2.5 μ l，uORF 小片段 2.5 μ I，T4DNA連接酶 1.0 μ I ；16°C過夜連接反應(yīng)，取5μ I連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞。37°C過夜培養(yǎng)，挑選單克隆，待菌落PCR驗證后，擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒pGL3-Basic-uORF，進行酶切和測序驗證。植物表達重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
[0049]3、將 2.0 μ g pGL3-Basic-uORF 質(zhì)粒與 25 μ I 金粉(直徑 1.0 μ Μ)溶液，10 μ I亞精胺(0.1Μ)充分混合，將干燥的混合物至于9.0MPa(IlOOpsi)載物膜上，通過基因槍PDS-1000/He (Bio-Rad)的動力系統(tǒng)，打入擬南芥葉片組織細(xì)胞。
[0050]4、植物組織經(jīng)過22°C溫室培養(yǎng)24小時后，收集植物組織并用組織搗碎機在低溫下磨成粉末，用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega公司，中國上海)測定擬南芥熱休克轉(zhuǎn)錄因子的uORF相對熒光素酶活性。檢測方法按試劑盒說明書進行操作，經(jīng)過比較突變型與未突變型的相對熒光素酶活性，結(jié)果顯示突變型的熒光素酶活性(6.74 μ gproteirT1，mirT1)遠高于未突變型的突光素酶活性(1.42 μ g protein—1, mirT1), 二者差異在兩倍以上，說明AtHsfBl的uORF對下游的翻譯過程有著抑制作用。
[0051]實施例2:煙草堿性亮氨酸蛋白基因tbzl7的uORF對其翻譯的影響作用鑒定。
[0052]煙草堿性亮氨酸蛋白基因tbzl7的uORF片段，該片段的序列為SEQ ID N0.2。
[0053]1、對tbzl7的uORF片段進行人工突變的快速PCR定點突變方法，步驟如下:
[0054]I)煙草堿性亮氨酸蛋白基因tbzl7的uORF片段的克隆
[0055]以提取的煙草幼嫩葉片為材料，取500mg嫩葉，按照Trizol RNA提取試劑盒(Takara)說明書方法提取葉片總RNA,按照PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)取
0.5 μ gRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RNase消化cDNA產(chǎn)物，參照tbzl7的uORF片段堿基序列(SEQID No:2)，用Primer 5軟件設(shè)計引物擴增uORF片段(未突變)。
[0056]上游引物tbzl7-F:5' -TCTGGTACCATGACATACGCTATCCAG-3' (SEQ ID No:7)
[0057]下游引物tbzl7-R:5' -CTTCCCGGGTCATGAAATTTCGTAGAA-3' (SEQ ID No:8)
[0058]以幼嫩葉片的cDNA為模板，進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
[0059]50μ I 反應(yīng)體系:10XPCR Buffer 5.0 μ I tbzl7 的上下游引物(SEQ ID No:7和 SEQ ID No:8)各 1.0 μ I (10 μ Μ)，dNTP mix 2.5 μ I (2.5mM)，cDNA 模板 1.0 μ 1，ddH2039.3 μ I, Taq DNA Polymerase 0.2 μ I ;PCR 程序:95°C預(yù)變性 4min，后 95°C解鏈 30sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec,反應(yīng)35個循環(huán)，72°C延伸7min ;片段連接到pMD 18-TSimple載體，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，進行序列測定，測序結(jié)果準(zhǔn)確無誤。[0060]2)煙草堿性亮氨酸蛋白基因tbzl7的uORF片段的定點突變
[0061 ] 根據(jù)uORF片段的堿基序列和定點突變要求(ATG突變?yōu)門TG)，Primer 5軟件設(shè)計
上游引物擴增突變的uORF片段(下游引物同上)。
[0062]上游引物tbzl7-Ft:5' -TCTGGTACCTTGACATACGCTATCCAG-3' (SEQ ID No:9)
[0063]以未突變的uORF片段為模板，用EX Taq高保真酶進行PCR反應(yīng)，
[0064]50μ I 反應(yīng)體系:10XPCR Buffer 5.0 μ 1，tbzl7 的上下游引物(SEQ ID No:9和 SEQ ID No:8)各 1.0μ 1(10μΜ)，dNTP mix 2.5 μ I (2.5mM)，未突變的 uORF 片段模板1.0 μ 1，ddH2039.3 μ 1，Taq DNA Polymerase 0.2 μ I ；PCR 程序:95°C預(yù)變性 4min，后 95°C解鏈30sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，反應(yīng)35個循環(huán)，72°C延伸7min ;片段連接到pMD 18-TSimple載體，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，進行序列測定，測序結(jié)果準(zhǔn)確無誤。 [0065]2、分別構(gòu)建含有未突變uORF片斷及突變uORF片斷的重組質(zhì)粒:用KpnI和SmaI雙酶切分別連接有未突變片斷及突變片斷的pMD 18-T Simple,與KpnI和SmaI雙酶切的表達載體pGL3-Basic構(gòu)建重組質(zhì)粒，酶切體系40μ 1:10XH Buffer 4.0μ I,ddH20 18 μ 1，pMD 18-T Simple (連接有未突變片斷或突變片斷)15 μ 1，KpnI和SmaI各1.5μ I ;37°C反應(yīng)2h ;產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠回收試劑盒(Axygen)回收質(zhì)粒pGL3-Basic大片段和uORF小片段。用T4連接酶連接兩個回收產(chǎn)物，連接反應(yīng)體系10 μ 1:10 X LigaseBuffer4.0 μ I，pGL3_Basic 大片段 2.5 μ I，uORF 小片段 2.5 μ I，T4DNA 連接酶1.0μ I ;16°C過夜連接反應(yīng)，取5μ I連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞。37°C過夜培養(yǎng)，挑選陽性單克隆擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒pGL3-Basic-u0RF，進行酶切和測序驗證。植物表達重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
[0066]3、將 2.0 μ g pGL3-Basic-uORF 質(zhì)粒與 25 μ I 金粉(直徑 1.0 μ Μ)溶液，10 μ I 亞精胺(0.1Μ)充分混合，將干燥的混合物至于9.0MPa(IlOOpsi)膜上，通過基因槍I3DS-1OOO/He (Bio-Rad)的動力系統(tǒng)，打入植物組織細(xì)胞。
[0067]4、植物組織經(jīng)過22°C溫室培養(yǎng)24小時后，收集植物組織并用組織搗碎機在低溫下磨成粉末，用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega)測定其相對熒光素酶活性。檢測方法按試劑盒說明書進行操作，經(jīng)過比較突變型與未突變型的相對熒光素酶活性，結(jié)果顯示突變型的熒光素酶活性(0.98yg protein'mirT1)遠低于未突變型的熒光素酶活性(4.19 μ g protein-1, mirT1), 二者差異在兩倍以上,說明tbzl7的uORF對下游翻譯過程起著增強作用。
[0068]實施例3:擬南芥多胺氧化酶基因AtPA03的uORF對其翻譯的影響作用鑒定。
[0069]擬南芥多胺氧化酶基因AtPA03的uORF片段，該片段的序列為SEQ ID N0.3。
[0070]1、對AtPA03的uORF片段進行人工突變的快速PCR定點突變方法，步驟如下:
[0071]I)擬南芥多胺氧化酶基因AtPA03的uORF片段的克隆
[0072]以提取的擬南芥幼嫩葉片為材料，取500mg嫩葉，按照Trizol RNA提取試劑盒(Takara)說明書方法提取葉片總RNA,按照PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)取
0.5ugRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RNase消化cDNA產(chǎn)物，參照AtPA03的uORF片段堿基序列(SEQID No:3)，用Primer 5軟件設(shè)計引物擴增uORF片段(未突變)。
[0073]上游引物AtPA03-F:5' -CGCGGTACCATGAATTTTTTTAGAAAA-3' (SEQ ID No: 10)
[0074]下游引物AtPA03-R:5' -CTTCCCGGGACAATGAACGGAGTAATT-3' (SEQ ID No: 11)[0075]以幼嫩葉片的cDNA為模板，進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
[0076]50 μ I 反應(yīng)體系:10XPCR Buffer 5.0 μ 1，AtPA03 的上下游引物(SEQ ID No: 10和 SEQ ID No: 11)各 1.0 μ I (10 μ Μ)，dNTP mix 2.5 μ I (2.5mM)，cDNA 模板 1.0 μ 1，ddH2039.3 μ I, Taq DNA Polymerase 0.2 μ I ;PCR 程序:95°C預(yù)變性 4min，后 95°C解鏈 30sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，反應(yīng)35個循環(huán)，72°C延伸7min ;片段連接到pMD 18-TSimple載體，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，進行序列測定，測序結(jié)果準(zhǔn)確無誤。
[0077]2)擬南芥多胺氧化酶基因AtPA03的uORF片段的定點突變
[0078]根據(jù)uORF片段的堿基序列和定點突變要求(ATG突變?yōu)門TG)，Primer 5軟件設(shè)計上游引物擴增突變的uORF片段(下游引物同上)。
[0079]上游引物AtPA03-Ft:5' -CGCGGTACCTTGAATTTTTTTAGAAAA-3' (SEQ ID No: 12)
[0080]以未突變的uORF片段為模板，用EX Taq高保真酶進行PCR反應(yīng)。
[0081]50 μ I 反應(yīng)體系:10XPCR Buffer5.0 μ L，AtPA03 的上下游引物(SEQ ID No: 12和 SEQ ID 吣:11)各1.(^1(1(^]?)，(1見13 mix 2.5 μ I (2.5mM)，未突變的 uORF 片段模板1.0 μ LddH2O 39.3 μ L, Taq DNA Polymerase 0.2 μ L ;PCR 程序:95°C預(yù)變性 4min，后 95°C解鏈30sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，反應(yīng)35個循環(huán)，72°C延伸7min ;片段連接到pMD 18-T Simple載體，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，進行序列測定，測序結(jié)果準(zhǔn)確無誤。
[0082]2、分別構(gòu)建含有未突變uORF片斷及突變uORF片斷的重組質(zhì)粒:用KpnI和SmaI雙酶切分別連接有未突變片斷及突變片斷的pMD 18-T Simple，與KpnI和SmaI雙酶切的表達載體 pGL3-Basic 構(gòu)建重組質(zhì)粒，酶切體系 40μ 1:10XH Buffer 4.0μ I, ddH20 18 μ I,pMD 18-T Simple (連接有未突變片斷或突變片斷)15 μ 1，KpnI和SmaI各1.5μ I ;37°C反應(yīng)2h ;產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠回收試劑盒(Axygen)回收質(zhì)粒pGL3_Basic大片段和uORF小片段。用T4連接酶連接兩個回收產(chǎn)物，連接反應(yīng)體系10 μ 1:10XLigaseBuffer4.0μ L, pGL3-Basic 大片段 2.5yL，uORF 小片段 2.5μ 1，T4DNA 連接酶 1.0μ I ;16°C過夜連接反應(yīng)，取5μ I連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞。37°C過夜培養(yǎng)，挑選陽性單克隆擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒pGL3-Basic-u0RF，進行酶切和測序驗證。植物表達重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
[0083]將2.0 μ g pGL3-Basic-uORF 重組質(zhì)粒，25 μ I 直徑 1.0 μ M 的金粉粒子，10 μ I 亞精胺(0.1Μ)充分混合，將干燥的混合物至于9.0MPa(IlOOpsi)膜上，通過基因槍I3DS-1OOO/He (Bio-Rad)的動力系統(tǒng)，打入植物組織細(xì)胞。
[0084]植物組織經(jīng)過22°C溫室培養(yǎng)24小時后，收集植物組織并用組織搗碎機在低溫下磨成粉末，用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega)測定其相對熒光素酶活性。檢測方法按試劑盒說明書進行操作，經(jīng)過比較突變型與未突變型的相對熒光素酶活性，結(jié)果顯示突變型的熒光素酶活性(4.58yg protein^1, min-1)遠高于未突變型的熒光素酶活性(0.89 μ g protein-1, mirT1), 二者差異在兩倍以上,說明AtPA03的uORF對下游的翻譯過程有著抑制作用。
【權(quán)利要求】
1.一種快速鑒定uORF對翻譯水平影響的方法，其特征在于，該方法包括下列步驟: a.對目的基因的uORF片斷進行擴增，得未突變的uORF片斷； b.以未突變的uORF片段為模板，對目的基因的uORF片斷進行定點突變并擴增，得突變的uORF片斷； c.分別將未突變的uORF片斷和突變的uORF片斷構(gòu)建重組質(zhì)粒； d.將上述重組質(zhì)粒采用基因槍方法分別導(dǎo)入植物組織細(xì)胞； e.培養(yǎng)植物組織細(xì)胞，用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測，比較突變型與未突變型的相對熒光素酶活性，鑒定uORF對目的基因翻譯水平的影響，即uORF對下游開放性閱讀框影響。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于目的基因為AtHsfBl、tbzl7或AtPA03，對應(yīng)的 uORF 片段的序列分別為 SEQ ID No:1, SEQ ID No:2, SEQ ID No:3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟b中定點突變是將Met的密碼子ATG突變?yōu)長eu密碼子TTG，或者將ATG突變?yōu)镃TG或GTG。`
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟a中對目的基因的uORF片斷進行擴增的方法為: 以植物幼嫩葉片為材料，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)目的基因的uORF片段堿基序列，設(shè)計上游引物與下游引物，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進行PCR反應(yīng)，擴增未突變uORF片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟b中對目的基因的uORF片斷進行人工定點突變并擴增的方法為: 根據(jù)定點突變的uORF片段的堿基序列，設(shè)計上游引物，下游引物同未突變uORF片斷的下游引物，以未突變的uORF片段為模板，用高保真酶進行PCR反應(yīng)，擴增突變的uORF片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟c中構(gòu)建重組質(zhì)粒采用的表達載體為pGL3_Basic。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟d中將重組質(zhì)粒采用基因槍方法導(dǎo)入植物組織細(xì)胞的方法為:通過基因槍roS-1000/He (Bio-Rad)的動力系統(tǒng)，將吸附重組質(zhì)粒的直徑為0.8-1.0uM優(yōu)選為1.0 ii M的金粉粒子，打入植物組織細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟e中比較突變型與未突變型的相對熒光素酶活性，二者差異在兩倍以上，則說明uORF對目的基因翻譯水平的影響，反之，則沒有影響。
【文檔編號】C12Q1/68GK103642931SQ201310719480
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】朱旭君, 房婉萍, 王玉花, 周琳 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)