一株高產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌及應用該菌株生產(chǎn)紫杉醇的方法
【專利摘要】本發(fā)明從南方紅豆杉的幼莖中分離得到一株可產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌菌株，其分類命名為葡萄座腔菌J11（Botryosphaeria?dothidea?J11），保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏號為CCTCC?NO:M2013591。本發(fā)明還涉及了一種應用所述的保藏菌株生產(chǎn)紫杉醇的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述的保藏菌株以使在所述菌株菌絲內(nèi)產(chǎn)生和聚集紫杉醇，以及從所述細胞內(nèi)中回收并提純紫杉醇。本發(fā)明為利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇提供了新的菌種，通過該菌株發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇的周期短，成本低，其搖瓶發(fā)酵的紫杉醇的產(chǎn)量經(jīng)HPLC分析檢測，達到617.6μg/L，有應用于工業(yè)化生產(chǎn)的潛能。
【專利說明】一株高產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌及應用該菌株生產(chǎn)紫杉醇的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種產(chǎn)紫杉醇的真菌，尤其涉及一種能產(chǎn)紫杉醇的葡萄座腔菌，以及應用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇的方法，屬于生物工程和生物制藥【技術領域】。
【背景技術】
[0002]紫杉醇(Paclitaxel,商品名為Taxol)是全球范圍內(nèi)銷量最大的來源于植物的抗癌藥。紫杉醇為一種結構復雜的二萜類化合物，是紅豆杉屬植物的天然產(chǎn)物。1963年美國科學家Wall和Wani等從太平洋短葉紅豆杉(Taxus brevifolia Nutt.)的樹皮分離得到紫杉醇，1971年Wall和Wani等鑒定出這種天然活性產(chǎn)物的結構。研究已證實紫杉醇通過抑制細胞有絲分裂的紡錘體解聚而抑制腫瘤細胞的增殖。由于紫杉醇抑癌機理明確，且在極低濃度下即可腫瘤細胞的生長和增殖，美國FDA于1992年底批準紫杉醇用于臨床治療對常規(guī)化療無效的卵巢癌和乳腺癌。隨后，紫杉醇又被擴大到治療其它轉移性乳腺癌、晚期卵巢癌和非小細胞肺癌等。
[0003]全球對紫杉醇的需求量非常大，已出現(xiàn)紫杉醇供應危機。紫杉醇的有機合成手性基團較多，合成路線復雜，成本高，產(chǎn)率低，至今無法應用于工業(yè)生產(chǎn)。近年來，國內(nèi)外學者進行了大量紅豆杉愈傷組織培養(yǎng)和細胞懸浮培養(yǎng)研究，培養(yǎng)的紅豆杉細胞系己超過10個，其中大部分己證實能產(chǎn)生紫杉醇，但是離體培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的關鍵問題難以突破，例如，培養(yǎng)物生物量小，紫杉醇產(chǎn)率較低，生產(chǎn)周期長，并且還需要保持細胞生長與生產(chǎn)特性的穩(wěn)定等等。目前，紫杉醇的主要來源為紅豆杉屬植物的樹皮，但是紅豆杉屬植物的樹皮中的紫杉醇含量特別低(0.003%~0.05%)。隨著紫杉醇應用范圍的擴大，所需紅豆杉數(shù)量將十分可觀，這也給紅豆杉資源帶來嚴重威脅，可能造成生態(tài)環(huán)境的嚴重破壞。正因為如此，我國已將紅豆杉列為明令禁止砍伐的國家一級保護植物。雖然各生物技術公司大規(guī)模種植紅豆杉，從全株及枝葉中提取紫杉醇，即使如此仍然不能滿足紫杉醇的供給。
[0004]1993年美國學者Stierle和Strobel從短葉紅豆杉的韌皮部分離到一株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌一安德魯紫杉菌(Taxomyces andreanae)。因此,通過大規(guī)模培養(yǎng)產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌，為工業(yè)化生產(chǎn)紫杉醇開辟了一條新的途徑。除安德魯紫杉菌外，擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis sp.)中產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌種類較多。最初，篩選出的小孢擬盤多毛孢(Pestalotiopsis microspora)的紫杉醇含量僅為幾十ng/L,通過大量篩選,在擬盤多毛孢屬中篩選的內(nèi)生真菌的紫杉醇含量達到120~140 μ g/L，篩選出的異色擬盤多毛孢(P.versicolor)的紫杉醇含量達到478 μ g/L。此外,在鐮刀菌屬(Fusarium)、肉座菌屬(Hypocrea sp.)、根霉屬(Rhizopus sp.)、綠僵菌屬(Metarhizium sp.)等屬中也相繼發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌，且其紫杉醇的含量逐漸提高。
[0005]但目前仍然不能通過產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌進行紫杉醇的工業(yè)化生產(chǎn)，以滿足全球對紫杉醇的需求。主要原因在于:1)產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的紫杉醇產(chǎn)量低；2)目前發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的種類仍然偏少。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對現(xiàn)有技術中存在的仍需從紅豆杉中篩選種屬分布范圍更廣，紫杉醇產(chǎn)量更高的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的問題，本發(fā)明對紅豆杉進行了大量的篩選和研究工作，以獲得新的高產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌。
[0007]因此，本發(fā)明的一個目的在于提供一株產(chǎn)紫杉醇高產(chǎn)內(nèi)生真菌菌株以及利用該菌株生產(chǎn)紫杉醇的方法，為工業(yè)化大規(guī)模發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇提供新途徑。
[0008]本發(fā)明提供的紫杉醇產(chǎn)生菌菌株Jll已于2013年11月22日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for Type Culture Collection, CCTCC),該菌種保藏號為CCTCC N0:M2013591,分類命名為葡萄座腔菌 Jll (Botryosphaeria dothidea J11)。
[0009]本發(fā)明還包括所公開的葡萄座腔菌菌株的突變體，這些突變體本質上具有相同的或改進的產(chǎn)紫杉醇性能。突變體的制造程序為微生物領域公知技術。例如，廣泛應用紫外線和亞硝基胍達到突變目的。[0010]本發(fā)明進一步涉及所列舉的微生物的變體。這些變體可以通過,例如多核普酸序列，與來自所列舉的分離的微生物的序列有高度同源性來識別，除此之外，這些變體與分離的微生物一樣具有期望的產(chǎn)紫杉醇的生物活性。
[0011]在【具體實施方式】中，本發(fā)明還包括了所公開的產(chǎn)紫杉醇活性的保藏菌株的變體，其中所述的變體的多核苷酸序列至少95%，96%，97%，98%或至少99%或100%與SEQ ID NO:1或 SEQ ID NO:2 —致。
[0012]在【具體實施方式】中，本發(fā)明還包括了所公開的產(chǎn)紫杉醇活性的保藏菌株的變體，其中所述的變體的多核苷酸序列至少95%，96%，97%，98%或至少99%或100%與SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中的均一致。
[0013]在本發(fā)明中，“95%相似性”是指堿基中可以存在最多5%的單一堿基取代，"96%相似性”是指堿基中可以存在最多4%的單一堿基取代，依次類推，“99%相似性”是指堿基中可以存在最多1%的單一堿基取代。
[0014]在【具體實施方式】中，本發(fā)明所述保藏菌株搖瓶發(fā)酵紫杉醇的產(chǎn)量經(jīng)HPLC分析檢測，達到 617.6 μ g/L。
[0015]本發(fā)明進一步包括組合物以及組合物在產(chǎn)紫杉醇中的應用，所述的組合物包含產(chǎn)紫杉醇有效量的所公開的保藏葡萄座腔菌菌株。
[0016]另一方面，本發(fā)明還提供了一種所公開的葡萄座腔菌Jll菌株生產(chǎn)紫杉醇的方法，所述方法包括:在培養(yǎng)基中培養(yǎng)葡萄座腔菌Jll菌株以使在所述菌株細胞內(nèi)和所述培養(yǎng)基中產(chǎn)生和聚集紫杉醇，以及從所述細胞內(nèi)和培養(yǎng)基中回收并提純紫杉醇。
[0017]本發(fā)明提供的葡萄座腔菌菌株Jll與已知的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)共生真菌相比，發(fā)酵周期短，產(chǎn)量高。已知的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)共生真菌發(fā)酵周期長，一般是2~3周，紫杉醇產(chǎn)量低，發(fā)酵工藝難于掌握。這就意味著，用本發(fā)明的菌株有可能實現(xiàn)紫杉醇的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。
[0018]與其它紫杉醇生產(chǎn)方法相比，例如從紅豆杉樹木原料中直接提取的方法，化學法全合成或植物細胞懸浮培養(yǎng)技術生產(chǎn)紫杉醇的方法，本發(fā)明提供的微生物可以通過發(fā)酵培養(yǎng)直接生產(chǎn)紫杉醇，其生產(chǎn)成本低，不會對生態(tài)資源造成破壞，發(fā)酵工藝易于掌握，后續(xù)的分離純化步驟簡單，產(chǎn)率高，因此在這幾點上都有鮮明的可比性?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0019]圖1左:為本發(fā)明Jll菌株在PDA固體培養(yǎng)基上生長2天的菌落特征；圖1右:為本發(fā)明Jll菌株在PDA固體培養(yǎng)基上生長2周的菌落特征。
[0020]圖2為本發(fā)明Jll菌株的ITS序列擴增電泳圖譜，M表示標準DNA分子量的電泳圖譜。1，2，3，4，5表示5個PCR擴增反應所擴增的5個ITS序列。
[0021]圖3為本發(fā)明Jll菌株的LSU序列擴增電泳圖譜，M表示標準DNA分子量的電泳圖譜。1，2，3，4，5表示5個PCR擴增反應所擴增的5個LSU序列。
[0022]圖4為利用超高分辨質譜儀maXis impact對紫杉醇標樣進行的超高分辨質譜分析。圖上:超高分辨質譜儀對紫杉醇標樣的高分辨質譜圖，圖下:質譜數(shù)據(jù)庫中紫杉醇標樣的標準質譜。
[0023]圖 5為利用超高分辨質譜儀maXis impact對本發(fā)明菌株的提取物進行的超高分辨質譜分析。圖上:超高分辨質譜儀對本發(fā)明Jll菌株的發(fā)酵提取物的高分辨質譜圖，圖下:質譜數(shù)據(jù)庫中紫杉醇標樣的標準質譜。
[0024]圖6為紫杉醇標準樣品的高效液相色譜分析所獲得的回歸曲線和回歸方程。
[0025]圖7為紫杉醇標準樣品的高效液相色譜圖。
[0026]圖8為Jll菌株紫杉醇粗提物的高效液相色譜圖。
【具體實施方式】
[0027]下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件中所述條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0028]實施例1:產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的分離
[0029]本實施方式產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌Jll菌株從南方紅豆杉(Taxus chinensis var.mairei)莖中分離得到。本實施方式產(chǎn)紫杉醇的Jll菌株按以下步驟分離獲得:I)將南方紅豆杉莖先用無菌水沖洗(去掉樹皮表面的塵土等雜質)，再用75%的乙醇浸泡3~lOmin，然后用無菌水沖洗(沖洗去乙醇)，再用無菌剪刀剪成面積為0.5cmX0.5cm的小塊；2)將南方紅豆杉莖小塊分別栽種于PDA培養(yǎng)基平板(每個平板4~5塊樣品),放于25~28°C培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)至小塊周圍明顯長出菌落；3)挑取長勢較好的菌落接種于PDA固體培養(yǎng)基，在28 °C恒溫條件下培養(yǎng)，純化，保存。
[0030]上述PDA (potato dextrose agar)培養(yǎng)基按下述配比和條件制備:馬鈴薯180~220g,蔗糖20g，瓊脂20g (固體培養(yǎng)基時使用)，馬鈴薯去皮，切成塊煮沸半小時，然后用紗布過濾，再加蔗糖和瓊脂，溶化后補足水至1L，自然pH值，121°C，滅菌15分鐘后使用。
[0031]本發(fā)明的分離的Jll菌株具有以下菌落特征:在25~28°C溫度下，在PDA平板上生長，2至3天時菌落呈半透明白色菌絲，直徑約5cm ；3天后菌落從接種點開始出現(xiàn)青褐色，并向菌落四周呈放射狀快速生長；一周后，菌落長滿9cm培養(yǎng)皿，且菌絲逐漸轉變?yōu)楹稚?，菌落繼續(xù)生長；兩周后，菌落表面出現(xiàn)向上直立生長的菌絲，呈淺褐色，略帶灰色，此時，菌落顏色進一步加深，從背面觀察，菌落呈黑色，用接種環(huán)刮取菌絲時，發(fā)現(xiàn)有相當一部分菌絲嵌入培養(yǎng)基中生長，難于刮取下來。該菌株生長的最佳溫度為25~28°C，在37°C不能生長。Jll菌株的菌落特征非常符合葡萄座腔菌屬的葡萄座腔菌特征，葡萄座腔菌也叫葡萄潰潰瘍病病菌，廣泛分布于各種林木中，此次在南方紅豆杉中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生葡萄座腔菌還是首次。
[0032]實施例2:微生物菌株Jll的種屬鑒定
[0033]對于產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌菌種的鑒定，由于真菌類微生物的鑒定需要根據(jù)有性孢子作為判斷的主要依據(jù)，在實踐操作中難度大，特別是對于難于產(chǎn)生有性孢子的內(nèi)生真菌，形態(tài)鑒定似乎難以為繼。隨著現(xiàn)代分子生物學及其實驗方法的不斷發(fā)展和完善，國際上也采用DNA條形碼作為鑒定真菌的主要手段和方法。核糖體ITS (internal transcribedspacer)序列以及核糖體LSU (large subunit rRNA gene)序列作為分子標簽(條形碼)是科學家經(jīng)過長期大量的實驗而總結得到的。這兩種分子標簽與其它分子標簽相比，更具可靠性，對于真菌及內(nèi)生真菌的分子鑒定具有普遍意義。因此，本發(fā)明采用核糖體ITS序列和核糖體LSU序列作為鑒定本發(fā)明菌株的主要方法。
[0034](I)以ITS作為分子標簽對Jll菌株的分子分類鑒定
[0035]通過CTAB-SDS法提取產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌Jll菌株的基因組DNA，以其作為模板，通過聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR),以核糖體ITS (ITS5-1TS4),即以ITS-F:5/ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'和 ITS-R:5' -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'作為引物，通過Bio-Rad公司的PTC_200Peltier Thermal Cycler擴增Jll菌株的ITS序列，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，該ITS序列擴增成功，結果如圖1所示。
[0036]該擴增的DNA片段由華大基因有限公司通過雙脫氧鏈終止法測序，經(jīng)DNAStar軟件拼接和校正后，得到一個544bp的ITS片段，該片段的DNA序列為SEQ ID N0:1。
[0037]通過NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫的 BLAST (Basic LocalAlignment Search Tool)工具,將Jll菌株中的544bp ITS序列進行核苷酸Blast比對,發(fā)現(xiàn) Jll 菌株中 544bp 的 ITS 序列與 Botryosphaeria dothidea KER-U-BDQl (GeneBankAccession N0.KF466871.1)菌株，Botryosphaeria dothidea KER-U-BDAPLA (GeneBankAccession N0.KF466486.1)菌株和 Botryosphaeria dothidea HuBlOsl (GeneBankAccession N0.JX275786.1)菌株等在18S核糖體RNA基因部分序列、內(nèi)部轉錄間隔序列1、
5.8S核糖體RNA基因序列、內(nèi)部轉錄間隔序列2，28S核糖體RNA基因部分序列具有100%的一致性。因此，可以確定Jll菌株為葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)的一個新菌株。
[0038](2)以LSU作為分子標簽對Jll菌株的分子分類鑒定
[0039]同樣，通過CTAB-SDS法提取Jll菌株的基因組DNA，以其作為模板，通過PCR,以核糖體的 LSU (LR0R-LR5)，即 LSU-F:5 ' -ACCCGCTGAACTTAAGC-3 '和 LSU-R:5' -TCCTGAGGGAAACTTCG-3 '作為引物，通過 Bio-Rad 公司的 PTC_200Peltier ThermalCycler擴增Jll菌株的核糖體LSU序列，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，該LSU序列擴增成功，結果如圖2所示。
[0040]該擴增的DNA片段由華大基因有限公司通過雙脫氧鏈終止法測序，經(jīng)DNAStar軟件拼接和校正后，得到一個870bp的LSU片段，該片段的DNA序列為SEQ ID NO: 2。
[0041]同樣地,通過NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫的 BLAST 工具，將Jll菌株中的870bp的LSU序列進行核苷酸Blast比對,發(fā)現(xiàn)Jll菌株與Botryosphaeriadothidea CBS331.33 (GeneBank Accession N0.DQ377849.1), Botryosphaeria dothideaCBS115476(GeneBank Accession N0.NG027577.1 ^PBotryosphaeria dothidea CBS990.70(GeneBank Accession N0.JX275786.1)菌株在28S核糖體大亞基RNA基因部分序列具有100%的一致性。因此，通過LSU序列的比對，進一步證明Jll菌株為葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)的一個新菌株。
[0042]葡萄座腔菌也叫葡萄潰瘍病病菌，其種類繁多，是廣泛分布于林木類中的一種致病真菌，寄主類型多樣，病理特征差異較大。由于在實驗室和自然界難于獲得其有性孢子，且其無性型孢子形態(tài)特征存在極大的分化與不確定性，因此，無性系名稱較多，且無性型與有性型缺乏嚴格的一對一的對應關系，因而葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria Ces&De Not)系統(tǒng)分類一直存在較大的爭議。本發(fā)明是首次在南方紅豆杉中分離得到產(chǎn)紫杉醇的葡萄座腔菌。因此，南方紅豆杉中很可能存在并有待發(fā)現(xiàn)其它產(chǎn)紫杉醇的其葡萄座腔菌菌株，以及與葡萄座腔菌親緣相近的菌株。
[0043]實施例3:鑒定Jll菌種是否產(chǎn)紫杉醇
[0044]薄層層析(thinlayer chromatography, TCL)通過 Rf 值，高效液相色譜(highperformance liquid chromatography, HPCL)通過保留時間(retention time)作為鑒定產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的方法，但由于誤差范圍較大，目前已漸漸被淘汰，僅作為產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌判斷的初步依據(jù)，不能作為最終的鑒定方法。而核磁共振(nuclear magnetic resonancespectroscopy, NMR)方法雖然鑒定結果可靠,可鑒定紫杉醇的化學結果,但涉及到從發(fā)酵液中分離和純化高純度的紫杉醇，如通過制備液相色譜純化高純度的紫杉醇，操作程序復雜，且對實驗條件要求較高。高分辨質譜(high resolution mass spectroscopy)比普通質譜具有更高的靈敏度，不需對樣品中的目標產(chǎn)物分離和純化，即可檢出樣品中的飛克級別含量的化合物。因此，超高分辨質譜在一定程度上可取代核磁共振技術，作為檢出和鑒定復雜樣品中某一未知樣品，如紫杉醇的有效方法。因此，本發(fā)明利用高分辨質譜及其數(shù)據(jù)庫鑒定Jll是否產(chǎn)紫杉醇。該方法大大簡化了操作程序，操作過程簡單，且鑒定結果可靠。
[0045]為證明Jll菌株能夠產(chǎn)生紫杉醇，利用產(chǎn)自于德國的超高分辨質譜儀maXisimpactCBruker Daltonics Inc.),以中國食品藥品檢定研究院純度為99.6%的紫杉醇作為標準對照樣品，對Jll的提取物進行超高分辨質譜分析，結果如圖3所示。結果表明，來源于南方紅豆杉莖部的葡萄座腔菌Jll菌株的提取物和天然紅豆杉植物中分離純化得到的紫杉醇標準品的圖譜完全一致，即二者具有一樣立體化學結構，因此能夠證明菌株Jll具產(chǎn)生紫杉醇的能力，是一株產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌。
[0046]實施例4:微生物Jll生產(chǎn)紫杉醇的方法
[0047] I)發(fā)酵培養(yǎng):從活化的Jll菌株中挑取一環(huán)接種于裝有250ml PDA培養(yǎng)基(培養(yǎng)基的制備按實施例1中所涉及的方法進行配制)的培養(yǎng)瓶中，置于恒溫培養(yǎng)搖床上，在28°C，150rpm/min條件下振蕩培養(yǎng)5~7天,直到菌絲體長滿培養(yǎng)瓶。2)菌絲體收集:收集在250mL PDL培養(yǎng)基上培養(yǎng)的Jll菌株的菌絲體，4500r/mim離心15min，棄上清液，收集菌絲體。將菌絲體冷凍干燥后，置于研缽中液氮研磨30min，使細胞充分破碎。3)紫杉醇提取:將研磨好的菌絲體加蒸餾水至IOOmL,倒入分液漏斗中，再加入等量的乙酸乙酯，震蕩搖勻，靜置3h，待分層明顯且上層萃取液清亮時，把下層的菌液放出，倒出上層萃取液(上層萃取液溶有紫杉醇)，下層菌液繼續(xù)用等體積乙酸乙酯反復萃取二次，合并三次所得的萃取液。4)獲取粗提產(chǎn)物:將所有萃取液轉移至旋轉蒸發(fā)儀中，于80°C濃縮后，加2mL色譜甲醇溶解，即可獲得粗提產(chǎn)物。5)純化:粗提產(chǎn)物用色譜純化的方法純化，得產(chǎn)物紫杉醇。
[0048]實施例5:測定Jll菌株生產(chǎn)紫杉醇的產(chǎn)量
[0049]紫杉醇含量的檢測以紫杉醇標準樣品通過高效液相色譜法(high performanceliquid chromatography, HPLC)進行。在相同的保留時間(retention time)內(nèi)，作一個紫杉醇濃度和峰面積標準曲線，并進行回歸分析，求出回歸方程。然后，根據(jù)內(nèi)生真菌Jll樣品的峰面積計算紫杉醇的含量。
[0050]標準樣品的配制:精確稱取紫杉醇標準品10mg，溶于色譜純的甲醇中，定容到IOmL,配制成 lmg/mL 母液備用，將母液稀釋到 10 μ g/mL、20 μ g/mL、40 μ g/mL、60 μ g/mL、80 μ g/mL和100 μ g/mL的系列標準樣品溶液,用0.22 μ m的微孔濾膜過濾后備用。
[0051 ] 高效液相色譜條件:采用島津液相色譜儀分析，檢測器SPD-20A，恒溫箱CT0-20A，雙元泵LC-20AT，自動進樣器SIL-20A。檢測波長為227nm，色譜柱為ZORBAX Eclipse PlusC18, 4.6 X 250mm，5 μ m，為反相C18柱，流動相速度為L 5mL/min ;流動相為甲醇(色譜純):水(雙蒸水)=65: 35 ;柱溫為45°C，進樣量為20yL。[0052]在相同保留時間下，檢測得到峰面積與濃度的關系，得到回歸曲線與回歸方程，結果如圖4所示。從圖中看出，回歸系數(shù)R為0.999，說明實驗條件理想，擬合程度很高。
[0053]紫杉醇標準樣品的進樣量為20 μ L，樣品濃度為100 μ g/mL時，獲得如圖5所示的高效液相色譜圖。
[0054]將實施例4制備的紫杉醇粗體產(chǎn)物用色譜甲醇稀釋至lmL，進樣量為80 μ L，獲得如圖6所示的高效液相色譜圖。
[0055]通過HPLC的對比分析，Jll菌株與紫杉醇標樣在相同的保留時間內(nèi)均有一紫外吸收峰，根據(jù)標樣的回歸方程計算Jll菌株的峰面積及進樣量，換算得到提取物進樣濃度為7.72 μ g/mL,由于進樣量稀釋了 10倍，因此，Jll菌株2mL提取物中的紫杉醇含量為154.4 μ g，即250mL培養(yǎng)基中紫杉醇的產(chǎn)量為154.4 μ g，那么IL培養(yǎng)物中紫杉醇的濃度為617.6 μ g/L。
[0056]與現(xiàn)有產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌相比，葡萄座腔菌菌株Jll是一株紫杉醇高產(chǎn)菌株，可能在大規(guī)模發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇方面具有應用前景。在自然發(fā)酵條件下，JII菌株的紫杉醇產(chǎn)量即可達到617.6 μ g/L，是目前報道的未經(jīng)優(yōu)化發(fā)酵條件下，紫杉醇產(chǎn)量最高的野生株。如果通過優(yōu)化發(fā)酵條件，Jll菌株的紫杉醇產(chǎn)量可能更高。另一方面，如果能夠利用該菌株，通過誘變育種獲得紫杉醇高產(chǎn)菌株，使其產(chǎn)量達lmg/L以上，甚至更高，那么通過大規(guī)模發(fā)酵法培養(yǎng)產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)紫杉醇將會為期不遠。
【權利要求】
1.一株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌菌株,其分類命名為葡萄座腔菌Jll (Botryosphaeriadothidea J11)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏號為CCTCC N0:M2013591，或所述菌株為所述具有產(chǎn)紫杉醇活性的保藏菌株的突變體。
2.如權利要求1所述的產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌菌株，其特征在于:所述菌株為所述具有產(chǎn)紫杉醇活性的保藏菌株的突變體，其中所述的突變體的多核苷酸序列至少99 %與SEQ IDNO:1 或 SEQ ID NO: 2 —致。
3.如權利要求1所述的產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌菌株，其特征在于:所述菌株為所述具有產(chǎn)紫杉醇活性的保藏菌株的突變體，其中所述的突變體的多核苷酸序列至少99 %與SEQ IDNO:1 和 SEQ ID NO: 2 中均一致。
4.如權利要求1所述的產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌菌株，其特征在于:所述菌株搖瓶發(fā)酵紫杉醇的產(chǎn)量經(jīng)HPLC分析檢測，達到617.6 μ g/L。
5.一種利 用如權利要求1所述的產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌菌株生產(chǎn)紫杉醇的方法，其特征在于:在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權利要求1所述產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌菌株以使在所述菌株細胞內(nèi)產(chǎn)生和聚集紫杉醇，以及從所述細胞內(nèi)回收并提純紫杉醇。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基為自然pH的PDA培養(yǎng)基，其組成為g/L:馬鈴薯180~220g，蔗糖20g,固體補加20g瓊脂粉。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)是在需氧條件下進行，溫度為25~28°C，發(fā)酵初始pH值為自然的PDA培養(yǎng)基的pH值。
8.如權利要求5所述的方法，其特征在于所述回收并提純紫杉醇的步驟包括: (1)從發(fā)酵液分離出發(fā)酵菌絲體； (2)將菌體冷凍干燥，液氮研磨，加入蒸餾水，倒入分液漏斗中，再加入等體積的乙酸乙酷； (3)震蕩搖勻，靜置，待分層明顯且上層萃取液清亮時，把下層的液體放出，倒出上層萃取液； (4)下層液體繼續(xù)用等體積乙酸乙酯反復萃取多次，合并所有的萃取液； (5)使用旋轉蒸發(fā)器濃縮所有的萃取液，將濃縮物溶解在適量甲醇中，即獲得粗提產(chǎn)物； (6)將第(5)步所得粗提產(chǎn)物用色譜純化的方法純化，即得產(chǎn)物紫杉醇。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于:第(6)步所述色譜純化方法中，使用一個或一個以上的色譜柱，填料為C18，流動相為甲醇/H20。
【文檔編號】C12N1/14GK103911293SQ201310729052
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2013年12月25日 優(yōu)先權日:2013年12月25日
【發(fā)明者】劉明志, 段中崗, 呂鎮(zhèn)城 申請人:惠州學院