一種將microRNA轉(zhuǎn)染到血小板中的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種將microRNA轉(zhuǎn)染到血小板中的方法，包括如下步驟：a）將待轉(zhuǎn)染microRNA與脂質(zhì)體制混勻，得混合溶液；b）在溫度為22℃，振蕩頻率為60Hz的條件下，將步驟a的混合溶液與血小板共培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為12～36h，離心，收集血小板，即可。本發(fā)明方法可以有效地將microRNA轉(zhuǎn)染至血小板中，克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。
【專利說(shuō)明】—種將microRNA轉(zhuǎn)染到血小板中的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種將microRNA轉(zhuǎn)染到血小板中的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]血小板是體內(nèi)血栓形成的關(guān)鍵成分之一，在心血管疾病(增殖、血栓形成和血栓栓塞)、炎癥和部分腫瘤等多種病理生理進(jìn)程中扮演重要角色。microRNAOiiiRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度為20-24個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們?cè)趧?dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。
[0003]研究表明，血小板內(nèi)包含大量miRNAs，部分與體內(nèi)纖溶、凝血過(guò)程相關(guān)的血小板miRNAs可能是體內(nèi)血栓形成潛在的分子標(biāo)志物。
[0004]然而，由于血小板內(nèi)部缺乏細(xì)胞核和基因組DNA，使得血小板內(nèi)直接轉(zhuǎn)染miRNA技術(shù)異常困難，使得血小板miRNA標(biāo)志物的研究一直停滯不前，急需尋找一種能夠?qū)iRNA直接導(dǎo)入血小板中的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種將HiiCT0RNA轉(zhuǎn)染到血小板中的方法。
[0006]本發(fā)明將microRNA轉(zhuǎn)染到血小板中的方法，包括如下步驟:`[0007]a)將待轉(zhuǎn)染microRNA與脂質(zhì)體制混勻，得混合溶液；
[0008]b)在溫度為22°C，振蕩頻率為60Hz的條件下，將步驟a的混合溶液與血小板共培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為12~36h,離心,收集血小板,即可。
[0009]microRNA (miRNA)是一類長(zhǎng)度約為20-24個(gè)核苷酸的小RNA。
[0010]步驟a)中，所述脂質(zhì)體為陽(yáng)離子脂質(zhì)體。優(yōu)選地，所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體是siPORTTMNeoFXTM 或 Lipofectamine2000。
[0011]步驟a)所述混合溶液中，microRNA的濃度為0.7~0.8mol/L，脂質(zhì)體的濃度為5~7%(v/v)。優(yōu)選地，所述microRNA的濃度為0.74mol/L，脂質(zhì)體的濃度為5.9%(v/v)0
[0012]步驟a)中，混勻的方法如下:將脂質(zhì)體和待轉(zhuǎn)染HiiCT0RNA混合，在溫度為15~250C，震蕩頻率為50~70Hz的條件下，放置10~30min，即得混合溶液。優(yōu)選地，所述溫度為22°C，震蕩頻率為60Hz，放置時(shí)間為20min。
[0013]步驟b)中，所述培養(yǎng)時(shí)間為24h。
[0014]本發(fā)明還提供了前述任意一項(xiàng)所述方法制備的血小板。
[0015]發(fā)明人在前期試驗(yàn)中，采用常規(guī)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)染miRNA至血小板中，SP將miRNA與脂質(zhì)體混合，形成混合物，再在37°C與血小板共培養(yǎng)，然而，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該種方法難以有效地將microRNA轉(zhuǎn)入血小板中。
[0016]發(fā)明人也是偶然發(fā)現(xiàn)，在溫度為22°C，振蕩頻率為60Hz條件下，將microRNA與脂質(zhì)體混合物，與血小板共培養(yǎng)，可以將microRNA轉(zhuǎn)入血小板中。
[0017]另外，發(fā)明人通過(guò)篩選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，只有在溫度為22°C，振蕩頻率為60Hz條件下才能有效轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)溫度和震蕩頻率有微小變動(dòng)，則難以達(dá)到目的。
[0018]本發(fā)明方法可以將microRNA導(dǎo)入血小板中，使得血小板miRNA的功能鑒定成為可能，同時(shí)為篩選血小板的miRNA治療藥物提供了體外篩選體系，臨床應(yīng)用前景良好。
[0019]顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0020]以下通過(guò)實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1血小板中miR-30c含量檢測(cè)結(jié)果圖，其中，NC表示空白組，miRNA-30c表示轉(zhuǎn)染miRNA-30c后血小板的含量，Ant1-miRNA-30c表示轉(zhuǎn)染Ant1-miRNA_30c后血小板的含量。
[0022]圖2血小板內(nèi)PA1-1含量檢測(cè)結(jié)果圖，其中，NC表示空白組，miRNA_30c表示轉(zhuǎn)染miRNA-30c后血小板的含量，Ant1-miRNA_30c表示轉(zhuǎn)染Ant1-miRNA_30c后血小板的含量。
【具體實(shí)施方式】
[0023]實(shí)施例1本發(fā)明在血小板內(nèi)轉(zhuǎn)染microRNA的方法
[0024]取脂質(zhì)體siPORTTMNeoFXTM和待轉(zhuǎn)染microRNA，分別制成溶液，混合，在溫度為15°C，震蕩頻率為50Hz的條件下，放置lOmin，得混合液，混合液中microRNA的濃度為0.7mol/L，脂質(zhì)體的濃度為5% (v/v)；
[0025]在溫度為22°C，振蕩頻率`為60Hz的條件下，將前述混合液與血小板共培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為12h，離心，收集血小板，即可。
[0026]實(shí)施例2本發(fā)明在血小板內(nèi)轉(zhuǎn)染microRNA的方法
[0027]取脂質(zhì)體Lipofectamine2000和待轉(zhuǎn)染microRNA,分別制成溶液，混合,在溫度為25°C，震蕩頻率為70Hz的條件下，放置30min，得混合液，混合液中microRNA的濃度為0.8mol/L，脂質(zhì)體的濃度為7% (v/v)；
[0028]在溫度為22°C，振蕩頻率為60Hz的條件下，將前述混合液與血小板共培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為36h，離心，收集血小板，即可。
[0029]實(shí)施例3本發(fā)明在血小板內(nèi)轉(zhuǎn)染microRNA的方法
[0030]取脂質(zhì)體Lipofectamine2000和待轉(zhuǎn)染microRNA,分別制成溶液，混合,在溫度為22°C，震蕩頻率為60Hz的條件下，放置20min，得混合液，混合液中microRNA的濃度為0.74mol/L，脂質(zhì)體的濃度為5.9% (v/v)；
[0031]在溫度為22°C，振蕩頻率為60Hz的條件下，將前述混合液與血小板共培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為36h，離心，收集血小板，即可。
[0032]以下采用實(shí)驗(yàn)例的方式驗(yàn)證本發(fā)明方法可以將HiiCT0RNA有效轉(zhuǎn)入血小板中:
[0033]實(shí)驗(yàn)例I
[0034]血小板中存在miR-30c，其可以下調(diào)PA1-1 (纖溶酶原激活物抑制物I)的表達(dá)。若在血小板中導(dǎo)入miR-30c，血小板中miR-30c的含量應(yīng)當(dāng)增加，PA1-1表達(dá)應(yīng)當(dāng)下調(diào)；若在血小板中導(dǎo)入ant1-miR-30c (反義miR_30c),血小板中miR_30c的表達(dá)應(yīng)當(dāng)被抑制,PA1-1的表達(dá)應(yīng)當(dāng)上調(diào)。
[0035]因此，如下實(shí)驗(yàn)采用本發(fā)明方法轉(zhuǎn)染miR_30c和antiniR-30c(反義miR_30c)的，通過(guò)檢測(cè)miR-30c的表達(dá)量和PA1-1的表達(dá)量，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染是否成功。
[0036]miR-30c 的序列:uguaaacauccuacacucucagc ；
[0037]ant1-miR-30c 的序列:cugggagaaggcuguuuacucu。
[0038]一、實(shí)驗(yàn)材料:
[0039]健康人外周血加入加入枸櫞酸葡萄糖(85mM檸檬酸三鈉；78mM檸檬酸，IllmM葡萄糖)抗凝;乙二胺四乙酸(EDTA) ；3ml Tyrode’ s 緩沖液(containingl38mM NaCl, 5.5mMdextrose, 12mM NaHCO3, 0.8mMCaCl2, 0.4mM MgCl2, 2.9mM KCl, 0.36mM Na2HP04and20mMHepes, pH7.4) ； I μ M prostaglandin 12 ;高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge5804R),自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)Gel DocXR+ (美國(guó)BIO-RAD公司)，ND-1000微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó) NanoDrop 公司)，超凈工作臺(tái)(SW-CJ),超低溫冰箱(Thermo_80°C ) ,mirVanaTM miRNAIsolation Kit、siP0RTTMNeoFXTM、miR-30c、ant1-miR-30c 及其陰性 Negative Control(美國(guó) Ambion 公司)，DEPC (美國(guó) Invitrogen 公司)，E.coli poly (A) Polymerase、rATP (NEB公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa 公司)，20bp DNA Ladder Marker>2 X Taq PCR Master Mix 等(北京天根生化科技公司)，熒光素酶檢測(cè)試劑盒(Promega)，HEK293細(xì)胞系(ATCC);酶標(biāo)儀(賽默飛世爾(上海)儀器有限公司)、寡核苷酸序列、PCR引物合成和序列測(cè)序(InvitiOgen公司)；lipofectamine2000 (Invitrogen 公司)
[0040]二、實(shí)驗(yàn)方法
[0041](一)、血小板準(zhǔn)各:
[0042]采用梯度離心法，取健康志愿者外周血按1:9比例加入枸櫞酸葡萄糖溶液(85mM檸檬酸三鈉；78禮檸檬酸，111禮葡萄糖)后20(^條件下離心lOmin，吸取上清富含血小板血清(PRP)。
[0043]將PRP進(jìn)一步1000g離心IOmin使血小板沉淀后，加入3ml Tyrode’ s緩沖液(138mM NaCl, 5.5mM dextrose, 12mM NaHCO3, 0.8mM CaCl2, 0.4mM MgCl2, 2.9mM KC12，0.36mMNa2HPO4 和 20mM Hepes, pH7.4),再加入 I μ M 前列腺素 12 (prostaglandin 12),重懸于Tyrode’ s緩沖液中清洗3次后沉淀血小板，血小板(2X IO8個(gè)/ml)混懸于培養(yǎng)液DMEM中待用。
[0044](二)、血小板內(nèi)轉(zhuǎn)染
[0045]miR-30c組:采用如下方法轉(zhuǎn)染miR_30c后的血小板；anti_miR-30c組(反義miR-30c):采用如下方法轉(zhuǎn)染ant1-miR-30c后的血小板；以未處理血小板作為空白對(duì)照。
[0046]轉(zhuǎn)染程序如下:
[0047]a)取血小板；
[0048]b)將siP0RTTMNeoFX?轉(zhuǎn)染試劑60 μ I，與690 μ I的DMEM培養(yǎng)基混勻，室溫22 V孵育5min ；
[0049]c) 245 μ I的DMEM培養(yǎng)基中加入15 μ I的50 μ M濃度的miR_30c使終濃度為50nM(或15 μ I的50 μ M濃度的anti_miR-30c，使終濃度50nM)，輕柔混勻后室溫22°C下放置 5min。[0050]d)將上述b和c混合，并22°C輕搖(震蕩頻率為60Hz) 20min后，按每孔500 μ I/加入6孔板待用；
[0051]e)取a步血小板懸液按每孔1500 μ I/孔覆蓋在上述混液上，前后輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板以充分混勻，繼續(xù)室溫22°C振蕩培養(yǎng)，振蕩頻率60Hz ；
[0052]f)轉(zhuǎn)染振蕩培養(yǎng)24h后，離心收集血小板。
[0053](三)、檢測(cè)丨
[0054]利用莖環(huán)real-time RCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后miR_30c表達(dá)變化狀況；突光定量real-timeRCR檢測(cè)靶基因(PA1-1) mRNA表達(dá)變化。
[0055]小分子RNA提取方法:
[0056]首先在轉(zhuǎn)染后收集的血小板中加入2ml Lysis/Binding Buffer,并充分混勻后，加入0.2ml miRNA勻衆(zhòng)添加劑(Homogenate Additive),充分混勻，冰上靜置IOmin ;然后加等體積的酸-苯酹氯仿(Acid-phenol chloroform),在潤(rùn)流振蕩器(Vortex)上振蕩30-60s ;室溫下10，OOOg離心5min，以分離水相和有機(jī)相，此時(shí)移取上層液體到另一離心管，并確定移取的上層液體體積。準(zhǔn)確加入1/3體積的常溫保存的無(wú)水乙醇，并混勻后加入到濾芯(Filter Cartridge)中在10，OOOg條件下離心15s并收集濾液,此步濾芯(FilterCartridge)中可吸附mRNA。然后收集濾液,再準(zhǔn)確加入2/3體積的常溫保存的無(wú)水乙醇，并混勻后加入到濾芯(Filter Cartridge)中在10，OOOg條件下離心15s,棄濾液,此步濾芯(Filter Cartridge)中可吸附< 200nt小分子RNA。分別取吸附mRNA的濾芯(FilterCartridge)和吸附< 200nt小分子RNA的濾芯(Filter Cartridge),加入700 μ I洗漆液(Wash solution)l后在10，OOOg條件下離心5-lOs,并棄濾液；再加入500 μ I洗漆液(Washsolution) 2/3后10，000g5-10s離心并棄濾液后，10, OOOg空轉(zhuǎn)Imin,去處殘留的洗漆液(Wash solution);將濾柱移至另一收集管(Collection Tube)中，加入100 μ 195°C預(yù)熱的洗脫液(Elution Solution)并以10，000g20-30s離心收集濾液，即為血小板mRNA。
[0057]1、血小板中miR_30c含量檢測(cè)
[0058]1. 引物的設(shè)計(jì)與合成:根據(jù)miR-30c的序列信息，設(shè)計(jì)、合成RT引物和PCR擴(kuò)增引物。
[0059]反轉(zhuǎn)錄引物設(shè)計(jì):在固定莖環(huán)結(jié)構(gòu):
[0060]GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC 序列后面加上候選 miRNAs 最后6個(gè)堿基的互補(bǔ)序列，形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)RT引物。
[0061]PCR引物設(shè)計(jì):miR_30c經(jīng)頸環(huán)RT逆轉(zhuǎn)錄之后，Reverse prime引物為莖環(huán)結(jié)構(gòu)上固定序列，引物序列為:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。Forward primer(GCTGCGCTGTAAACATCCTACACT)為候選miRNAs除去莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄所加堿基的剩余序列，并在5’端增加若干GC堿基以調(diào)適TM值。
[0062]2.miR-30c的莖環(huán)RT逆轉(zhuǎn)錄:利用上述逆轉(zhuǎn)錄引物,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得候選miRNAs特異性Stem-loop-cDNAs模板。
[0063]3.miR-30c的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè):以人U6為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，分別以miR_30c的莖環(huán)RT逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用SYBR green熒光定量方法檢測(cè)miR-30c特異性表達(dá)情況。
[0064]利用BIO-RAD IQ5熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，各樣品均設(shè)置3個(gè)平行反應(yīng)。反應(yīng)體系:樣品 cDNA/U6/miRNA 的標(biāo)準(zhǔn)品 2μ I, SYBR Premix Ex Taq (2Xconc)10 μ I, IOuM的引物各I μ I (Tablel)，補(bǔ)RNase-Free水至20 μ L.反應(yīng)程序:95°C預(yù)變性2min，95°C變性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 30s，循環(huán) 30 次，72°C延伸 3min 后，60°C到 95°C繪制融解曲線，71Cycle (每個(gè)循環(huán)降0.5°C ),2_Δ Δ Ct方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。
[0065]I1、熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)血小板中PA1-1RNA含量
[0066]1、逆轉(zhuǎn)錄
[0067]I)在RNase free的PCR管中配置下列溶液.[0068]
【權(quán)利要求】
1.一種將microRNA轉(zhuǎn)染到血小板中的方法,其特征在于:包括如下步驟: a)將待轉(zhuǎn)染microRNA與脂質(zhì)體制混勻，得混合溶液； b)在溫度為22°C，振蕩頻率為60Hz的條件下，將步驟a的混合溶液與血小板共培養(yǎng)12~36h,離心，收集血小板，即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟a)中，所述脂質(zhì)體為陽(yáng)離子脂質(zhì)體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述陽(yáng)離子脂質(zhì)體是SiPORTTMNeoFXTM或 Lipofectamine2000。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟a)所述混合溶液中，microRNA的濃度為0.7~0.8mol/L，脂質(zhì)體的濃度為5~7% (v/v)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述混合溶液中，microRNA的濃度為0.74mol/L，脂質(zhì)體的濃度為5.9% (v/v)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟a)所述混勻的方法如下:將脂質(zhì)體和待轉(zhuǎn)染microRNA混合，在溫度為15~25°C，震蕩頻率為50~70Hz的條件下，放置10~30min,即得混合溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述溫度為22°C，震蕩頻率為60Hz，放置時(shí)間為20min。`
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟b)中，所述共培養(yǎng)的時(shí)間是24h。
9.權(quán)利要求1~8任意一項(xiàng)所述方法制備的血小板。
【文檔編號(hào)】C12N5/078GK103695471SQ201310731807
【公開(kāi)日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月26日
【發(fā)明者】羅茂, 吳劍波, 李蓉 申請(qǐng)人:瀘州醫(yī)學(xué)院