含水溶性有機(jī)溶劑的脫蠟緩沖液及其使用方法
【專(zhuān)利摘要】含水溶性有機(jī)溶劑的脫蠟緩沖液、其使用方法以及包含脫蠟緩沖液的試劑盒。所述脫蠟緩沖液含有沸點(diǎn)至少為80℃的水溶性有機(jī)溶劑。本文所述脫蠟緩沖液可用于在水性緩沖溶液中以及升高的溫度下快速并有效地去除裝載在玻片上的組織切片上的包埋石蠟，同時(shí)無(wú)須擔(dān)心玻片上的石蠟再沉積。此外，本文所述脫蠟緩沖液可用于在單個(gè)步驟中進(jìn)行脫蠟和HIER，從而大幅減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間并降低樣品損失或損壞的風(fēng)險(xiǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】含水溶性有機(jī)溶劑的脫蠟緩沖液及其使用方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年1月23日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?3/356,491的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi) 容通過(guò)引用全文納入本文。
[0003] 背景
[0004] 作為一種組織學(xué)研究中制備組織樣品所用的包埋介質(zhì)，石蠟已經(jīng)被使用了很長(zhǎng)時(shí) 間。在一些情況下，塑料樹(shù)脂也被用作包埋介質(zhì)。這類(lèi)包埋過(guò)程通常包括以下步驟：樣品 固定（如福爾馬林固定）、脫水、清洗、石蠟浸潤(rùn)或浸漬、封閉或包埋在一塊石蠟中，將石蠟 塊和樣品切成薄片，將切片裝載在玻片上、去除石蠟和用于該目的（即脫蠟或脫石蠟）的溶 齊IJ、以及在鏡檢前對(duì)切片進(jìn)行染色。包埋介質(zhì)的主要目的是使樣品在天然狀態(tài)下被切片和 裝載。石蠟包埋的優(yōu)勢(shì)在于可在染色前將蠟溶解使之與樣品分離，從而使染色時(shí)切片為裸 露組織的形式并且避免了與難以去除的基于樹(shù)脂的包埋材料的存在相關(guān)的額外困難。
[0005] 最近對(duì)于石蠟包埋組合物的改進(jìn)拓寬了其實(shí)用性，同時(shí)保留了其與下游樣品制備 和分析的相容性。因此，對(duì)固定后石蠟包埋材料切片的脫蠟仍是一種廣泛使用的方法，尤其 是在免疫診斷目的的醫(yī)院組織病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室中。
[0006] -種通常使用的脫蠟方法涉及在有機(jī)溶劑中溶解包埋的石蠟。例如，目前通常在 實(shí)驗(yàn)方案中使用二甲苯（一種可燃、有揮發(fā)性和毒性的有機(jī)溶劑）以溶解石蠟，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品 切片的脫蠟。通常，將裝載在顯微鏡玻片上的樣品浸入二甲苯浴中直至石蠟溶解。
[0007] 另一種常用于脫蠟的方法涉及在含水性緩沖溶液的熱浴中熔解并去除包埋的石 蠟。使用熱緩沖溶液的額外優(yōu)勢(shì)在于其可通過(guò)一種被稱(chēng)作熱誘導(dǎo)表位修復(fù)（"HIER")的過(guò) 程進(jìn)行抗原修復(fù)。HIER是一種常在免疫組化（"IHC")或原位雜交（"ISH")前使用的預(yù)處理 過(guò)程，用于通過(guò)對(duì)裝載在玻片上的樣品材料中所含靶蛋白的分子構(gòu)象進(jìn)行熱誘導(dǎo)修飾以改 善染色。通常該修飾過(guò)程是必需的，因?yàn)殡m然醛基固定劑（如福爾馬林）能夠很好地保存 細(xì)胞形態(tài)，但它們也會(huì)引起蛋白交聯(lián)，導(dǎo)致一些蛋白表位無(wú)法結(jié)合互補(bǔ)的抗體。HIER通常與 酶消化聯(lián)用，作為改善IHC/ISH染色反應(yīng)中多種抗原反應(yīng)性的方法。
[0008] 現(xiàn)有的被設(shè)計(jì)用來(lái)在IHC/ISH前同時(shí)對(duì)玻片脫蠟并進(jìn)行HIER的緩沖液配方利用 了低濃度的表面活性劑和其他乳化劑以破碎石蠟。HIER步驟中玻片被置于高溫（如70至 l〇〇°C)下，使石蠟熔化且表面活性劑溫和地將石蠟運(yùn)送至緩沖液表面。然而，已知的緩沖 液配方和方法的性能有限，有時(shí)會(huì)造成石蠟拖尾、玻片重新涂覆和不一致的染色結(jié)果。
[0009] 相應(yīng)地，需要能夠在免疫組化或其他診斷分析前有效地去除樣品中的石蠟或改良 的石蠟基包埋材料的脫蠟組合物和方法，同時(shí)最小化對(duì)使用者的危險(xiǎn)，與自動(dòng)系統(tǒng)相容且 保持與下游分析的相容性。需要不存在毒性或致癌性或毒性或致癌性有限、不產(chǎn)生或產(chǎn)生 最少量的氣味、能夠降低有毒溶劑的使用量，使有毒廢物最少和/或能夠降低腐蝕性和可 燃性的脫蠟組合物和方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明公開(kāi)了含水溶性有機(jī)溶劑的脫蠟緩沖液及其使用方法以及包含脫蠟緩沖 液的試劑盒。本文所述脫蠟緩沖液可用于在高溫下的水性緩沖溶液中快速并有效地去除裝 載在玻片上的組織切片中的包埋的石蠟，同時(shí)無(wú)需擔(dān)心玻片上石蠟的再沉積。此外，本文所 述脫蠟緩沖液可在單個(gè)步驟用于脫蠟和HIER，能夠大幅減少實(shí)驗(yàn)方案的時(shí)間并降低樣品損 失或破壞的風(fēng)險(xiǎn)。
[0011] 在一個(gè)實(shí)施方式中，一種脫蠟緩沖液包括緩沖劑、沸點(diǎn)高于80°C且在水中的溶解 度至少為20體積百分比（〃V〇l%〃）的有機(jī)溶劑和水。所述脫蠟緩沖液的工作溶液可包括 大于95vol%的水。在一個(gè)實(shí)施方式中，可使用濃縮脫蠟緩沖劑，通過(guò)用水稀釋濃縮液以制 備脫蠟緩沖液工作溶液。
[0012] 在一個(gè)方面，所述脫蠟緩沖液能夠在高溫下在水性溶液中溶解熔解后的包埋石蠟 且熔解后的石蠟在冷卻后不會(huì)發(fā)生再固化。同樣，所述脫蠟緩沖液能夠降低石蠟的熔點(diǎn)，這 可以大幅減少實(shí)驗(yàn)方案的時(shí)間。人們認(rèn)為該活性是由于水溶性有機(jī)溶劑的作用。也就是 說(shuō)，由于溶劑化學(xué)性質(zhì)的雙重性，人們認(rèn)為該溶劑能夠在水性溶液中破壞氫鍵，并在水中溶 解有機(jī)分子（如石蠟）。
[0013] 通過(guò)以下描述和所附權(quán)利要求書(shū)或者通過(guò)學(xué)習(xí)下文中所述的本發(fā)明的實(shí)踐，可以 更充分地理解本發(fā)明的這些和其他目的及特征。
[0014] 發(fā)明詳述
[0015] I?引言
[0016] 本發(fā)明公開(kāi)了含水溶性有機(jī)溶劑的脫蠟緩沖液及其使用方法以及包含脫蠟緩沖 液的試劑盒。本文所述脫蠟緩沖液可用于在高溫下的水性緩沖溶液中快速并有效地去除裝 載在玻片上的組織切片中的包埋石蠟。本文所述脫蠟緩沖液能夠溶解熔解后的包埋石蠟， 這意味著可從脫蠟緩沖液中移出玻片同時(shí)無(wú)需擔(dān)心玻片上石蠟的再沉積。本文所述脫蠟緩 沖液能夠降低石蠟的熔點(diǎn)，這可以大幅減少實(shí)驗(yàn)方案的時(shí)間。同樣，因?yàn)槭窃谒匀芤褐袑?duì) 裝載在玻片上的組織樣品進(jìn)行脫蠟，所以脫蠟前無(wú)需對(duì)組織樣品進(jìn)行脫水。這也可大幅減 少玻片處理的時(shí)間。此外，本文所述脫蠟緩沖液可在單個(gè)步驟用于進(jìn)行脫蠟和HIER，能夠大 量減少實(shí)驗(yàn)方案的時(shí)間并降低樣品損失的風(fēng)險(xiǎn)。
[0017] II?脫蠟緩沖液
[0018] 在一個(gè)實(shí)施方式中，描述了一種脫蠟緩沖液。所述脫蠟緩沖液包括緩沖劑、沸點(diǎn)高 于80°C且在水中的溶解度至少為20體積百分比（〃v〇l%〃）的有機(jī)溶劑和水。在一個(gè)實(shí)施 方式中，所述脫蠟緩沖液的pH范圍為約pH 5至約pH 10,或者約pH 6至約pH 9。但通常 可根據(jù)優(yōu)選用于特定組織類(lèi)型或特定脫蠟實(shí)驗(yàn)方案的PH選擇任意的pH。
[0019] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述脫蠟緩沖液能夠在水中溶解有機(jī)分子（如石蠟）。人們 認(rèn)為有機(jī)溶劑的主要作用在于這一特性。然而，如下文所詳細(xì)討論的那樣，在脫蠟期間和脫 蠟后，脫蠟緩沖液的各組分協(xié)同作用以穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而有效且完全地去除裝載在玻片 上的組織樣品中的包埋蠟，避免包埋蠟在玻片上再沉積并在脫蠟期間和脫蠟后穩(wěn)定細(xì)胞結(jié) 構(gòu)。
[0020] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述有機(jī)溶劑的沸點(diǎn)為至少90°C、至少100°C、至少110°C、至 少120°C、至少130°C、至少140°C、至少150°C、至少160°C、至少170°C、至少180°C、至少 190°C或至少200°C。但通常沸點(diǎn)較高的溶劑（如沸點(diǎn)高于IKTC的溶劑）優(yōu)于沸點(diǎn)較低的 溶劑（如沸點(diǎn)低于約75°C的溶劑）。例如，一些HIER實(shí)驗(yàn)方案要求在高溫（如高于80°C) 下將玻片在脫蠟緩沖液中孵育約1-20小時(shí)。在這類(lèi)情況下，沸點(diǎn)較高的溶劑從緩沖液中蒸 發(fā)的可能性較小，如果發(fā)生蒸發(fā)則會(huì)隨著時(shí)間降低緩沖液溶解蠟的能力。同樣，優(yōu)選沸點(diǎn)較 高溶劑的原因在于由于其不易蒸發(fā)的事實(shí)，其產(chǎn)生溶劑氣味的可能性較小。
[0021] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述脫蠟緩沖液的工作溶液可包括約0. Ivol %、0.2v〇l %、 0? 25vol %、0? 3vol %或 0? 4vol % 的下限量的有機(jī)溶劑，約 5vol %、3vol %、2vol %、Ivol % 或0. 5vol %的上限量的有機(jī)溶劑，或列出的下限量和上限量的任意組合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí) 施方式中，所述緩沖液包括約〇.25vol %的有機(jī)溶劑。所含有機(jī)溶劑量低至0. Ivol %至 0. 25v〇l%的本文所述脫蠟緩沖液能夠溶解裝載在玻片上的組織樣品中的大量包埋蠟。應(yīng) 當(dāng)理解的是，可使用如此少量的有機(jī)溶劑在水性溶液中溶解包埋蠟是出乎意料的。
[0022] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述有機(jī)溶劑可具有約20vol%、25vol%、30vol%、35vol%、 40vol %、45vol % 或 50vol % 的下限范圍水溶性，99vol %、95vol %、90vol %、85vol %、 80vol %、75vol %、70vol %、65vol %、60vol %、55vol %、50vol % 的上限范圍水溶性，或列 出的下限和上限水溶性限值的任意組合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述有機(jī)溶劑與水互溶 (即可以任意比例混合溶劑和水）。
[0023] 在一個(gè)實(shí)施方式中，合適的具有上文所述特性且可包含于脫蠟緩沖液中的有機(jī)溶 劑的示例包括但不限于脂肪族化合物、醇、醛、酮和雜環(huán)有機(jī)化合物的酯類(lèi)衍生物（如氧雜 環(huán)丁烷、呋喃、四氫呋喃、吡喃、四氫吡喃、噻丁環(huán)、噻吩、四氫噻吩、噻喃或四氫噻喃）。例 如，已知的四氫呋喃（也被稱(chēng)作氧戊環(huán)）衍生物包括但不限于甲基四氫呋喃、四氫呋喃醇、 2_(羥基甲基）氧戊環(huán)-3-醇、糖呋喃亞甲基（2_((四氫糠基）氧基）乙醇）、2_(羥基甲 基）氧戊環(huán)_3, 4-二醇、二羥基甲基四氫呋喃、甲基四氫呋喃羧酸鹽等。其他上文所列化合 物的衍生物包括但不限于四氫噻吩基甲醇、四氫吡喃基甲醇、（氧雜環(huán)丁烷氧基）甲醇和呋 喃醇。
[0024] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述有機(jī)溶劑至少是糠醛、糠醇、甲基四氫呋喃、四氫呋喃 醇、二甘醇二甲醚、二甘醇、二甲基甲酰胺、二甲亞砜、二噁烷、二乙醇胺、丙二醇或其衍生物 中的一種。
[0025] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述有機(jī)溶劑是四氫呋喃醇（"THFA")。THFA的沸點(diǎn)約 178°C，這意味著其不易蒸發(fā)，其可與水混容、氣味極少、非反應(yīng)性、毒性低且易于生物降解。 此外，THFA來(lái)源于農(nóng)業(yè)產(chǎn)品（如玉米芯和甘蔗渣）且其不是石油蒸餾的產(chǎn)物。在另一個(gè)優(yōu) 選實(shí)施方式中，所述有機(jī)溶劑是甲基四氫呋喃（"me-THF")。me-THF的許多特性與THFA相 同，除了 me-THF的沸點(diǎn)為約78-80°C。下文的式1和2分別顯示了 THFA和me-THF的結(jié)構(gòu)。
[0026]

【權(quán)利要求】
1. 一種脫蠟緩沖液，所述脫蠟緩沖液包括： 緩沖劑； 沸點(diǎn)高于80°C且在水中的溶解度至少為20體積百分比（"vol% 〃）的有機(jī)溶劑；以及 水。
2. 如權(quán)利要求1所述的脫蠟緩沖液，所述脫蠟緩沖液能夠降低包埋石蠟的熔點(diǎn)并能夠 在水性溶液中至少部分溶解包埋石蠟。
3. 如權(quán)利要求1所述的脫蠟緩沖液，所述有機(jī)溶劑的沸點(diǎn)高于100°C。
4. 如權(quán)利要求1所述的脫蠟緩沖液，所述有機(jī)溶劑的沸點(diǎn)高于150°C。
5. 如權(quán)利要求1所述的脫蠟緩沖液，所述有機(jī)溶劑在水中的溶解度為至少0. 3vol %至 lvol %。
6. 如權(quán)利要求1所述的脫蠟緩沖液，所述有機(jī)溶劑與水互溶。
7. 如權(quán)利要求1所述的脫蠟緩沖液，所述有機(jī)溶劑是氧雜環(huán)丁烷、呋喃、四氫呋喃、批 喃、四氫吡喃、噻丁環(huán)、噻吩、四氫噻吩、噻喃或四氫噻喃的脂族、醇、醛、酮、或酯衍生物中的 至少一種。
8. 如權(quán)利要求1所述的脫蠟緩沖液，所述有機(jī)溶劑是糠醛、糠醇、甲基四氫呋喃、四氫 呋喃醇、二甘醇二甲醚、二甘醇、二甲基甲酰胺、二甲亞砜、二噁烷、二乙醇胺、丙二醇或其衍 生物中的至少一種。
9. 如權(quán)利要求1所述的脫錯(cuò)緩沖液，進(jìn)一步包括約0. 5vol%至約2vol%的多官能醇。
10. 如權(quán)利要求9所述的脫蠟緩沖液，所述多官能醇是聚乙二醇（'1^6〃）、聚丙二醇 (〃PPG〃）或糖醇中的至少一種。
11. 如權(quán)利要求9所述的脫蠟緩沖液，所述多官能醇是PEG 200、PEG 300、PEG 400或 PEG 600中的至少一種。
12. 如權(quán)利要求1所述的脫蠟緩沖液，所述脫蠟緩沖液進(jìn)一步包括約0. 2vol %至約 4vol%的表面活性劑。
13. 如權(quán)利要求12所述的脫蠟緩沖液，所述表面活性劑選自陰離子型表面活性劑、陽(yáng) 離子型表面活性劑、兩性離子型表面活性劑、非離子型表面活性劑及其組合。
14. 如權(quán)利要求1所述的脫蠟緩沖液，所述水構(gòu)成所述脫蠟緩沖液的超過(guò)95vol %。
15. -種脫蠟方法，所述方法包括： 提供裝載在玻片上的組織切片，所述組織切片至少部分包埋于包埋石蠟中； 將所述裝載在玻片上的組織切片浸入脫蠟緩沖液中，所述脫蠟緩沖液包括： 緩沖劑； 沸點(diǎn)高于80°C且在水中的溶解度至少為20體積百分比（"vol% 〃）的有機(jī)溶劑； 約0. 5vol%至約2vol%的多官能醇；以及 至少95vol %的水； 將所述裝載在玻片上的組織切片在脫蠟緩沖液中在選定溫度下孵育足夠?qū)λ鲅b載 在玻片上的組織切片進(jìn)行脫蠟的一段時(shí)間，所述脫蠟緩沖液能夠使所述包埋石蠟至少部分 溶解于所述脫蠟緩沖液中； 冷卻所述脫蠟緩沖液；以及 將所述裝載在玻片上的組織切片從所述脫蠟緩沖液中移出。
16. 如權(quán)利要求15所述的方法，所述脫蠟緩沖液能夠?qū)袷灥娜埸c(diǎn)降低至少5°C。
17. 如權(quán)利要求15所述的方法，100ml的所述脫蠟緩沖液能夠溶解至少lg至5g石蠟。
18. 如權(quán)利要求15所述的方法，所述脫蠟緩沖液在約58-62°C或以上溫度下能夠溶解 所述裝載在玻片上的組織切片中基本全部的包埋石蠟。
19. 如權(quán)利要求15所述的方法，所述脫蠟緩沖液能夠在約55°C的溫度下溶解所述裝載 在玻片上的組織切片中約7-12%的包埋石蠟且在低于55°C的溫度下溶解所述裝載在玻片 上的組織切片中約5%的包埋石蠟。
20. 如權(quán)利要求15所述的方法，所述孵育包括： 在約室溫下將所述裝載在玻片上的組織切片浸入所述脫蠟緩沖液中； 在所述脫蠟緩沖液中將所述裝載在玻片上的組織切片預(yù)熱至約85°C ; 將其中浸有所述裝載在玻片上的組織切片的所述脫蠟緩沖液的溫度提高至約97°C ; 使所述裝載在玻片上的組織切片在約97°C下在所述脫蠟緩沖液中孵育10分鐘至24小 時(shí)； 將其中浸有所述裝載在玻片上的組織切片的所述脫蠟緩沖液的溫度冷卻至約85°C。
21. -種試劑盒，所述試劑盒包括： 濃縮脫蠟試劑，包含： 緩沖劑； 沸點(diǎn)高于約80°C且在水中的溶解度至少為2〇V〇1%的有機(jī)溶劑； 約 7. 5vol %至約 30vol % 的 PEG 200 ;以及 至少47vol%水；以及 實(shí)驗(yàn)方案，所述實(shí)驗(yàn)方案包括稀釋所述濃縮脫蠟試劑以制備脫蠟緩沖液的指示和將裝 載在玻片上的組織切片在所述脫蠟緩沖液中進(jìn)行脫蠟的方法的說(shuō)明。
22. 如權(quán)利要求21所述的試劑盒，所述試劑盒還包括第一濃縮脫蠟試劑、第二濃縮脫 蠟試劑和第三濃縮脫蠟試劑，所述第一濃縮脫蠟試劑含有能夠在約pH 6時(shí)提供緩沖的第 一緩沖劑，所述第二濃縮脫蠟試劑含有能夠在約pH 8時(shí)提供緩沖的第二緩沖劑，所述第三 濃縮脫蠟試劑含有能夠在約pH 9時(shí)提供緩沖的第三緩沖劑。
23. 如權(quán)利要求22所述的試劑盒，所述第一、第二和第三濃縮脫蠟試劑各自包括所述 有機(jī)溶劑、PEG 200和水。
24. 如權(quán)利要求22所述的試劑盒，所述第一濃縮脫蠟試劑包括第一著色劑，所述第二 濃縮脫蠟試劑包括第二著色劑且所述第三濃縮脫蠟試劑包括第三著色劑，且所述第一、第 二和第三著色劑的作用是用于通過(guò)視覺(jué)區(qū)分所述第一、第二和第三濃縮脫蠟試劑。
25. 如權(quán)利要求21所述的試劑盒，所述濃縮脫蠟試劑的有機(jī)溶劑的沸點(diǎn)高于約150°C。
26. 如權(quán)利要求21所述的試劑盒，所述濃縮脫蠟試劑的有機(jī)溶劑在水中的溶解度為至 少 4. 5vol % 至 15vol %。
27. 如權(quán)利要求21所述的試劑盒，所述濃縮脫蠟試劑的有機(jī)溶劑與水互溶。
28. 如權(quán)利要求21所述的試劑盒，所述濃縮脫蠟試劑的有機(jī)溶劑是甲基四氫呋喃或四 氫呋喃醇中的至少一種。
29. 如權(quán)利要求21所述的試劑盒，所述濃縮脫錯(cuò)試劑還包括約3vol %至約15vol %的 表面活性劑。
30. 如權(quán)利要求29所述的試劑盒，所述表面活性劑選自陰離子型表面活性劑、陽(yáng)離子 型表面活性劑、兩性離子型表面活性劑、非離子型表面活性劑及其組合。
31. -種脫蠟緩沖液，所述脫蠟緩沖液包括： 選自檸檬酸鹽、EDTA-HEPES和Tris-EDTA的緩沖劑； 含量為0. lvol%至0. 75vol%的四氫呋喃醇； 含量為〇? 5vol%至2vol%的聚乙二醇200 ; 含量為0. lvol %至0. 75vol %的表面活性劑，所述表面活性劑選自辛基酚乙氧基化 物、聚氧乙烯（20)山梨糖醇酐單月桂酸酯及其組合；以及 水。
【文檔編號(hào)】C12N5/00GK104334717SQ201380015622
【公開(kāi)日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2013年1月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月23日
【發(fā)明者】J·H·弗里蘭德, M·A·哈維 申請(qǐng)人:理查艾倫科學(xué)公司