用于從生物樣品中采集和分離核酸的組合物和方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及用于采集、儲(chǔ)存、運(yùn)輸、分離和檢測(cè)獲自樣品的大分子例如核酸序列的工具、組合物和方法。所述組合物為用于殺死或滅活病原體、滅活酶和從用于進(jìn)一步加工和/或分析而制備的樣品釋放核酸的一步配方。特別地，本發(fā)明提供幫助核酸、基因和基因組濃縮、提取、分離和分析的單一的一步樣品采集和運(yùn)輸配方。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于從生物樣品中采集和分離核酸的組合物和方法
[0001]對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的引用
本申請(qǐng)要求于2012年3月28日提交的標(biāo)題為“用于從生物樣品中采集和分離大分子的組合物和方法”的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/616，676的優(yōu)先權(quán)，該申請(qǐng)整體通過(guò)引用特別地予以結(jié)合。
發(fā)明領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及用于采集、運(yùn)輸和儲(chǔ)存包含核酸群的生物樣品的工具、組合物和方法，特別地涉及包含幫助樣品中大分子例如核酸和蛋白質(zhì)分離和濃縮的組分例如聚合物纖維或小珠的工具、方法和組合物。
[0003]發(fā)明背景
無(wú)論在遠(yuǎn)距離場(chǎng)所、醫(yī)生辦公室或?qū)嶒?yàn)室中取樣，維持生物樣品中核酸(特別是獲自人類(lèi)患者的診斷樣品中包含的那些)的完整性的能力常常決定核酸是否能被成功分析。通常，生物樣品中的核酸在環(huán)境溫度時(shí)將迅速降解和/或變性。盡管經(jīng)過(guò)一段時(shí)間仍產(chǎn)生一些程度的降解，但樣品常常儲(chǔ)存在凍結(jié)溫度以下以保存其穩(wěn)定性和序列保真度用于后來(lái)的鑒定。當(dāng)樣品在遠(yuǎn)距離場(chǎng)所，或與醫(yī)生辦公室或?qū)嶒?yàn)室環(huán)境有顯著距離，特別是冰箱/冰庫(kù)條件可能受限或不能獲得的地方采集時(shí)，這一問(wèn)題被放大。當(dāng)用于下游分析的所需核酸包含核糖核酸(RNA)(特別易于被內(nèi)源或外源核酸酶活性降解)時(shí)，與生物樣品采集和處理相關(guān)的問(wèn)題進(jìn)一步加深。
[0004]存在可市售獲得樣品運(yùn)輸系統(tǒng)，但需要冷凍和/或?qū)ｉT(mén)的用于將生物樣品從采集點(diǎn)運(yùn)輸?shù)椒治鳇c(diǎn)的運(yùn)輸介質(zhì)。該介質(zhì)對(duì)樣品可儲(chǔ)存的時(shí)間強(qiáng)加不可能的限制，或需要在使某些采集不可行的低溫下的連續(xù)樣品維持。并且，關(guān)于在儲(chǔ)存和運(yùn)輸所采集樣品中所使用的試劑的處理和/或儲(chǔ)存，常常存在額外的顧慮。例如，試劑本身經(jīng)常需要低溫或其它特別護(hù)理以維持穩(wěn)定性。由于這些穩(wěn)定性問(wèn)題，例如，將試劑運(yùn)輸至一個(gè)場(chǎng)所、使用前在該場(chǎng)所儲(chǔ)存以及將生物樣品和試劑運(yùn)回檢驗(yàn)地點(diǎn)成為主要的關(guān)注問(wèn)題。
[0005]當(dāng)用生物樣品工作時(shí)，另一個(gè)顧慮為向個(gè)人和環(huán)境釋放傳染因子以及還污染生物樣品自身的風(fēng)險(xiǎn)。參與采集、轉(zhuǎn)移和檢驗(yàn)過(guò)程的個(gè)人(包括無(wú)辜旁觀者)具有暴露在高危險(xiǎn)接觸傳染物中的危險(xiǎn)。因此，所需的安全措施通常增加了將此種樣品從一個(gè)位置移動(dòng)至另一個(gè)位置所需的費(fèi)用和精力。
[0006]用于病原體檢測(cè)的臨床實(shí)驗(yàn)室方法為勞動(dòng)密集型、昂貴的過(guò)程，需要具有特別經(jīng)驗(yàn)的高度知識(shí)淵博和專(zhuān)業(yè)的科學(xué)工作者。大部分臨床診斷實(shí)驗(yàn)室使用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，其通常需要許多天以培養(yǎng)病毒——甚至更長(zhǎng)時(shí)間以培養(yǎng)一些其它靶細(xì)菌。此外，傳統(tǒng)培養(yǎng)需要采集、運(yùn)輸以及實(shí)驗(yàn)室繁殖和處理潛在傳染性生物因子例如Ebola、禽流感、嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(SARS)以及許多其它。
[0007]聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及其后的實(shí)時(shí)PCR的出現(xiàn)徹底改變了分子診斷。相對(duì)于傳統(tǒng)培養(yǎng)和分離方法需要數(shù)天，使用例如定量實(shí)時(shí)PCR (qPCR)或逆轉(zhuǎn)錄酶PCR (RT-PCR)和定量、實(shí)時(shí)、逆轉(zhuǎn)錄酶PCR (qRT-PCR)測(cè)定的基于核酸的檢測(cè)平臺(tái)可在數(shù)小時(shí)內(nèi)交付結(jié)果，使分子檢測(cè)方法成為現(xiàn)代診斷實(shí)驗(yàn)室分析的支柱。檢測(cè)化學(xué)的新近改良，例如，新型和改良的報(bào)告/猝滅熒光劑、小溝結(jié)合劑(MGB) (TaqMan MGB?, Applied B1systems;對(duì)于一般性參考,還參見(jiàn)例如,Baraldi等為吵7.Chem., 75 (2-3): 187-194，2003)和穩(wěn)定的擴(kuò)增試劑為更靈敏和高特異性核酸檢測(cè)測(cè)定鋪好了道路，并且已經(jīng)證明比過(guò)時(shí)的基于細(xì)胞培養(yǎng)的方法更及時(shí)、強(qiáng)健和經(jīng)濟(jì)。其它核酸檢測(cè)策略例如轉(zhuǎn)錄-介導(dǎo)的擴(kuò)增、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)和所謂的“芯片上的實(shí)驗(yàn)室”的多路測(cè)定的進(jìn)展也促進(jìn)了臨床實(shí)驗(yàn)室中從培養(yǎng)瓶到微陣列的轉(zhuǎn)換。
[0008]幾家商業(yè)公司(例如，Qiagen[Valencia, CA, USA]、Roche Applied Science[Indianapolis, IN, USA]、Gen-Probe [San Diego, CA, USA]和 b1Merieux [Durham,NC, USA])已經(jīng)開(kāi)發(fā)了使從樣品分離到分子分析的核酸提取過(guò)程自動(dòng)化的儀器。例如，Tigris DTS? (Gen-Probe, San Diego, CA, USA)使整個(gè)檢測(cè)過(guò)程自動(dòng)化，并且在2004年底獲得美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)用于使用Gen-Probe的APTIMA C0MB0-2?擴(kuò)增核酸檢驗(yàn)(NAT)測(cè)定同時(shí)檢測(cè)沙眼衣原體{Chlamydia trachomatis)和淋球菌{Neisseriagonorrhoeae)。
[0009]鑒于現(xiàn)代檢測(cè)和測(cè)定系統(tǒng)中對(duì)高質(zhì)量核酸樣品的需求，本領(lǐng)域中需要無(wú)需冷凍或冰凍或特殊處理而維持多種生物樣品和樣本中所包含核酸的完整性和質(zhì)量的安全和溫和的采集、儲(chǔ)存和運(yùn)輸系統(tǒng)。而且，當(dāng)樣品為有害或致病生物時(shí)，這一需要尤為突出。此外，目前存在對(duì)更便宜和更便利的采集/運(yùn)輸/儲(chǔ)存介質(zhì)的需求:其(i)使工作者和其它對(duì)病原體暴露的風(fēng)險(xiǎn)降到最低；(ii)提供濃縮；(iii)幫助生物樣品在環(huán)境溫度下更長(zhǎng)時(shí)間地便利運(yùn)輸；和(iv)使得樣品可按照需要適當(dāng)?shù)胤治龆喾N大分子，包括核酸、基因和基因組。
[0010]發(fā)明簡(jiǎn)述
本發(fā)明包括新型和有用的工具、組合物以及制造和使用它們的方法，其有利地改良傳統(tǒng)樣品采集，使得所采集的樣品中的大分子得以保存用于分析和鑒定。
[0011]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種組合物，優(yōu)選含水的，其包含:一種或多種離液齊U、一種或多種洗滌劑、一種或多種還原劑、一種或多種螯合劑、一種或多種緩沖劑和一種或多種核酸捕獲基質(zhì)(NACM)材料，一起以當(dāng)與疑似包含細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸酶和核酸序列的樣品接觸時(shí)足以裂解膜、變性蛋白質(zhì)、滅活核酸酶、殺死細(xì)胞例如病原體和/或任何其它活物質(zhì)的量存在。優(yōu)選組合物至少不大量降解樣品的核酸序列，使得核酸序列保持可檢測(cè)和/或可鑒定。當(dāng)樣品與組合物接觸時(shí)，可檢測(cè)的核酸序列包括，例如，病原體衍生的序列、癌癥標(biāo)志物序列、特定基因和基因組。優(yōu)選一種或多種離液劑以約0.5 M-約0.6 M的量存在；一種或多種洗滌劑以約0.1%-約1% (wt./vol.)的量存在；一種或多種還原劑以約
0.05 M-約0.3 M的量存在；一種或多種螯合劑以約0.01 mM_約I mM的量存在；一種或多種緩沖劑以約0.0001%-約0.3% (wt./vol.)或約I mM-約I M的量存在；以及一種或多種NACM以每100 PL約I ng_10 Pg的量存在。還優(yōu)選，一種或多種離液劑包括硫氰酸胍、異氰酸胍、鹽酸胍或其任何組合，一種或多種還原劑包括2-巰基乙醇、三(2-羧乙基)膦、二硫蘇糖醇、二甲基亞砜、三(2-羧乙基)膦或其任何組合，一種或多種洗滌劑包括十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鋰、?；敲撗跄懰徕c、?；悄懰徕c、甘膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、膽酸鈉、烷基苯磺酸鈉、斧月桂酰肌氨酸或其任何組合，一種或多種螯合劑包括乙二醇四乙酸、羥乙基乙二胺三乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、A斧雙(羧甲基)甘氨酸、乙二胺四乙酸、無(wú)水檸檬酸、檸檬酸鈉、檸檬酸鈣、檸檬酸銨、檸檬酸氫銨、檸檬酸、檸檬酸二銨、檸檬酸鐵銨、檸檬酸鋰或其任何組合；或13) —種或多種表面活性劑包括有機(jī)硅聚合物、聚山梨醇酯或其任何組合，一種或多種緩沖劑包括三(羥甲基)氨基甲烷、檸檬酸鹽、2_(斧嗎啉代)乙磺酸、％斧雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸、1，3-雙(三(羥甲基)甲基氨基)丙烷、4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸、3-(斧嗎啉代)丙磺酸、碳酸氫鹽、磷酸鹽或其任何組合，和一種或多種親和基質(zhì)介質(zhì)包括瓷、陶瓷、塑料或玻璃珠。本發(fā)明組合物可進(jìn)一步包含一種或多種短鏈烷醇，其優(yōu)選為乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇或其任何組合，以約1-約25% (vol./vol.)的量存在。優(yōu)選所述組合物緩沖至PH約6.4-6.8，并且具有該pH值的1.0以?xún)?nèi)的pKa值。優(yōu)選該組合物進(jìn)一步包含消泡劑(包括有機(jī)娃聚合物或聚山梨醇酯)以及包含裸露RNA、DNA或其組合，作為內(nèi)在陽(yáng)性和/或陰性對(duì)照。還優(yōu)選，一種或多種親和色譜基質(zhì)介質(zhì)為小珠并且優(yōu)選地為磁珠。優(yōu)選小珠例如用有機(jī)硅包覆，并具有核酸親和性。
[0012]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及包含約4 M硫氰酸胍；約30 mM檸檬酸鈉；約0.25%(wt./vol.)十二燒基硫酸鈉和約0.25% (wt./vol.)斧月桂酰肌氨酸鈉鹽;約0.I M 2-巰基乙醇；約0.1%有機(jī)硅聚合物(wt./vol.)的消泡劑；和NACM材料例如優(yōu)選二氧化硅-包覆的瓷、陶瓷、塑料或玻璃珠的組合物。
[0013]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及用于從疑似包含病原體的樣品獲取核酸群的方法，包括在一步中使樣品與一定量的本發(fā)明組合物在有效從樣品中檢出對(duì)可鑒定基因、基因組、其它期需序列病原體具有特異性的期需核酸群的條件下接觸。優(yōu)選地，樣品包含一種或多種當(dāng)與組合物接觸時(shí)物理裂解的病毒、細(xì)菌、真菌、動(dòng)物或植物細(xì)胞。還優(yōu)選，當(dāng)包含樣品的組合物在約15°C -約40°C的溫度下儲(chǔ)存約7-約14天時(shí)，至少基本上維持樣品中核酸群的完整性。優(yōu)選，從采集時(shí)間到分析其中的核酸群的時(shí)間，包含樣品的組合物基本上在環(huán)境溫度下儲(chǔ)存。
[0014]本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案涉及樣品采集系統(tǒng)，其包括:a)采集裝置；或b)采集容器；和c) 一定量的權(quán)利要求1的組合物，當(dāng)樣品在約15°C -約40°C的溫度下儲(chǔ)存至少7天時(shí)，其有效維持從樣品釋放的核酸群的完整性。
[0015]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及檢測(cè)來(lái)自疑似包含病原體、基因或基因組特有的可鑒定大分子的細(xì)胞樣品的核酸群的方法，包括在一步中使樣品與有效殺死或滅活樣品中病原體和/或任何其它活物質(zhì)并且物理裂解細(xì)胞樣品以從細(xì)胞樣品釋放核酸而不水解、酶降解或修飾釋放的RNA/DNA的量的權(quán)利要求1的含水組合物接觸，以便檢測(cè)病原體。優(yōu)選地，病原體包括病毒、真菌或細(xì)菌病原體。
[0016]本發(fā)明的其它實(shí)施方案和優(yōu)點(diǎn)在隨后的詳述中部分地闡明，并且部分地可從該詳述中顯而易見(jiàn)，或可從本發(fā)明的實(shí)踐中獲悉。
[0017]發(fā)明詳述
由于篩查大型人群的疾病和病癥的能力日益增加，對(duì)延長(zhǎng)的穩(wěn)定、采集、運(yùn)輸、保存和分離組合物的需求很大。樣本或樣品常常位于遠(yuǎn)離檢驗(yàn)設(shè)備的地理區(qū)域。遠(yuǎn)距離位置，也稱(chēng)為現(xiàn)場(chǎng)，包括通常不進(jìn)行診斷檢驗(yàn)的各種環(huán)境。這些場(chǎng)所包括醫(yī)生辦公室、分流中心、機(jī)場(chǎng)、過(guò)境處、暴發(fā)區(qū)域和各種戶(hù)外位置。
[0018]令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，期需的大分子(優(yōu)選核酸)可通過(guò)將生物樣品采集在包含親和色譜基質(zhì)材料的生物樣品采集組合物中從個(gè)體以及小型和大型群體獲得。這些組合物從生物材料提取、保存和維持目的大分子群的高質(zhì)量和高保真度(例如，核苷酸、脫氧核苷酸、序列、基因和基因組的序列保真度)。大分子免受在涉及采集、分離、儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程的多步期間經(jīng)受降解和污染的常規(guī)樣品中常規(guī)性觀察的有害作用?？赏ㄟ^(guò)本發(fā)明組合物和方法檢測(cè)的大分子包括，但不限于蛋白、核酸、DNA、RNA、碳水化合物、脂質(zhì)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和其它大分子，包括免疫球蛋白、抗原和前述任何的組合(例如，混合或共價(jià)偶聯(lián))?？蓹z測(cè)和/或鑒定的核酸序列包括，但不限于基因、基因組、癌癥標(biāo)志物序列、指示致病生物或感染存在的序列、指示生物表型情況的序列、指示譜系的序列、指示可鑒定特征的序列、指示突變的序列、指示從野生型或其它已知序列的變化的序列，或其組合。
[0019]本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案涉及用于采集生物樣品的提取、采集和保存組合物，使得其中包含的活物質(zhì)被組合物自身殺死或否則呈現(xiàn)無(wú)害，以便不造成或最小化暴露風(fēng)險(xiǎn)，而同時(shí)大分子從膜或其它結(jié)構(gòu)釋放(否則需要額外的步驟用于去除和分離)用于分析。所述組合物還破壞或造成足夠無(wú)活性的樣品中可存在的常常降解核酸的酶。該組合物還幫助DNA/RNA從細(xì)胞、細(xì)胞膜、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和/或樣品中存在的其它結(jié)構(gòu)釋放。優(yōu)選地，釋放的核酸與可檢測(cè)的親和基質(zhì)材料(也為組合物的優(yōu)選組分)結(jié)合，以便于容易分離和/或分析核酸。優(yōu)選地，將組合物和樣品保持在單個(gè)反應(yīng)容器中，以使得待檢測(cè)的核酸的完整性至少足夠維持用于后期的診斷分析。因此，在一步中，本發(fā)明組合物同時(shí):滅活或殺死樣品中可存在的病原體；抑制或防止其為后期鑒定的目標(biāo)的樣品核酸的酶降解；幫助靶核酸從樣品中存在的細(xì)胞和細(xì)胞結(jié)構(gòu)釋放；幫助分離所釋放的核酸并維持核酸的完整性用于后期分析。優(yōu)選地，包含樣品的組合物不需冷凍或冰凍，并且更優(yōu)選可在整個(gè)樣品采集過(guò)程中和分析前的所有時(shí)間維持在環(huán)境溫度下。任選，組合物可包含預(yù)測(cè)定的核酸序列，其可用作一種或多種內(nèi)在陽(yáng)性對(duì)照(IPC)或一種或多種內(nèi)在陰性對(duì)照(INC)以監(jiān)測(cè)保真度、準(zhǔn)確度和/或從序列分析獲得定性和/或定量信息。還任選，組合物可包含載體核酸例如DNA或RNA。
[0020]在一步配方，優(yōu)選在單個(gè)反應(yīng)區(qū)或反應(yīng)容器中，實(shí)現(xiàn)所有這些期需功能的能力是一個(gè)特別明顯的超過(guò)目前可得的優(yōu)點(diǎn)。目前，存在的技術(shù)不包括提供滅活包含核酸的生物組分、通過(guò)化學(xué)和/或物理裂解細(xì)胞釋放核酸接著分離或釋放RNA/DNA、維持所放出核酸群的完整性、幫助分離期需的核酸用于后期分析以及IPC和INC以進(jìn)一步定量樣品中的核酸的單步組合物。本發(fā)明同時(shí)穩(wěn)定和保存了用于診斷檢驗(yàn)的樣品核酸的完整性，同時(shí)還提供用于分離、濃縮和監(jiān)測(cè)以及分析樣品內(nèi)靶標(biāo)的便利工具。因此，本發(fā)明組合物對(duì)于臨床、現(xiàn)場(chǎng)和部署使用，或?qū)τ诟呷萘繕悠凡杉吞崛〕绦蚴抢硐氲?。采集在本發(fā)明組合物中的生物樣品為生物學(xué)無(wú)活性的，并因此，可安全運(yùn)送和儲(chǔ)存，通常不冷凍或冰凍。
[0021]可檢測(cè)的樣品的大分子包括，但不限于核酸例如DNA和RNA或其中任何可鑒定的序列。優(yōu)選所采集的樣品中待檢測(cè)的核酸為來(lái)自保守序列的核酸，其指示感染或疾病，或用于篩查目的。
[0022]本發(fā)明組合物包含:a) —種或多種離液劑(優(yōu)選在組合物中以約0.5 M-約6 M的量存在)；b) —種或多種洗滌劑(優(yōu)選在組合物中以約0.1%-約1%的量存在)；c) 一種或多種螯合劑(優(yōu)選在組合物中以約0.01 mM-約I mM的量存在)；d) —種或多種還原劑(優(yōu)選在組合物中以約0.005 M-約0.3 M的量存在);e) —種或多種消泡劑(優(yōu)選在組合物中以約0.0001%-約0.3%的量存在)；和(f) 一種或多種基質(zhì)材料并優(yōu)選親和色譜基質(zhì)材料，優(yōu)選在組合物中以幫助提取和分離診斷大分子的有效量存在。優(yōu)選的量為每ΙΟΟμΙ約 I ng-10 Pg。
[0023]示例性離液劑包括，優(yōu)選地，硫氰酸胍(GuSCN)、鹽酸胍(GuHCl)、異硫代硫酸胍(guanidine isoth1nate)、硫氰酸鉀(KSCN)、碘化鈉、高氯酸鈉、尿素或其任何組合。對(duì)其它的示例性離液劑和離液鹽的描述可見(jiàn)于1993年8月10日發(fā)行的題為“用于分離核酸的方法”的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，234，809 (通過(guò)對(duì)其明確引用以其整體特別地結(jié)合到本文中)。
[0024]示例性洗滌劑包括，優(yōu)選地，十二烷基硫酸鈉(SDS)、十二烷基硫酸鋰(LDS)、?；敲撗跄懰徕c(NaTDC)、牛磺膽酸鈉(NaTC)、甘膽酸鈉(NaGC)、脫氧膽酸鈉(NaDC)、膽酸鈉、烷基苯磺酸鈉(NaABS)、斧月桂酰肌氨酸(NLS)、羧酸鹽(即，肥皂)、磺酸鹽、硫酸鹽、磷酸酯和多磷酸酯、烷基磷酸酯、單烷基磷酸酯(MAP)以及全氟羧酸鹽、包括美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,691,299 (通過(guò)對(duì)其明確引用以其整體特別地結(jié)合到本文中)中所述那些的陰離子洗滌齊U，或其任何組合。
[0025]示例性還原劑包括，優(yōu)選地，2-巰基乙醇(β -ME)，、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫蘇糖醇(DTT)、甲酰胺、二甲基亞砜(DMSO)或其任何組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，還原劑包括或?yàn)門(mén)CEP。
[0026]示例性螯合劑包括，優(yōu)選地，乙二醇四乙酸(EGTA)、羥乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、N，N-雙(羧甲基)甘氨酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、無(wú)水檸檬酸、檸檬酸鈉、檸檬酸鈣、檸檬酸銨、檸檬酸氫銨、檸檬酸、檸檬酸二銨、檸檬酸鉀、檸檬酸鎂、檸檬酸鐵銨、檸檬酸鋰或其任何組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，螯合劑包括EDTA、檸檬酸鹽或其組合。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，螯合劑包括EDT。
[0027]本發(fā)明組合物可進(jìn)一步包含消泡劑，以防止形成氣泡(通常由配方中存在洗滌劑引起)。消泡劑幫助吸移和處理所公開(kāi)的組合物。示例性的表面活性劑/消泡劑包括，優(yōu)選地，椰油酰胺丙基羥基磺基甜菜堿、烷基氨基丙酸、烷基氨基丙酸、咪唑啉羧酸酯、甜菜堿、磺基甜菜堿(sulfobetaine)、磺基甜菜堿(sultaine)、乙氧基化烷基酚、乙氧基化醇、聚氧乙烯聚氧丙烯乙二醇、聚氧乙烯硫醇、長(zhǎng)鏈羧酸酯、酮醇酰胺(alkonolamide)、叔炔二醇、聚氧乙烯硅氧烷、N-烷基吡咯烷酮、烷基聚糖苷酶、有機(jī)硅聚合物例如Antifoam A?或聚山梨醇酯例如Tween?，或其任何組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，消泡劑包括有機(jī)硅聚合物。
[0028]示例性核酸捕獲基質(zhì)(NACM)材料包括，優(yōu)選地，瓊脂糖、玻璃、纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖(sepharose)、葡聚糖(sephadex)、二氧化娃或其它基質(zhì)介質(zhì)。優(yōu)選地，NACM材料用核酸結(jié)合物質(zhì)(NABS)，例如，核酸(NA)結(jié)合蛋白質(zhì)、抗體和具有NA (包括單鏈核酸序列)親和性的化學(xué)品包覆。NACM包括與特定抗體或抗體片段或幫助提取和/或分離目的診斷分子的其它大分子或配體偶聯(lián)的材料。親和珠優(yōu)選為磁珠例如，可從Dynabeads?, LifeTechnologies、TurboBeads, TurboBeads Inc.或 PureProteome ?和 Millipore 市售獲得的小珠。小珠可包含用于包含或排出分子大小色譜的定義尺寸的孔。NACM材料包括基質(zhì)介質(zhì)例如，與本發(fā)明組合物和方法使用的樹(shù)脂，例如，優(yōu)選氨基酸樹(shù)脂、碳水化合物樹(shù)脂、離子交換樹(shù)脂以及疏水和親水樹(shù)脂。本發(fā)明組合物中基質(zhì)材料的存在用于幫助大分子從樣品的細(xì)胞、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、大分子以及生物和非生物碎片中釋放和后續(xù)捕獲。優(yōu)選地，同樣的這些基質(zhì)材料可然后用于通過(guò)磁引力、分子親和性、離子或非-離子相互作用、密度或比密度、疏水或親水相互作用、形狀、顏色或光發(fā)射或吸收或任何獨(dú)特或可鑒定的區(qū)分化學(xué)或物理性質(zhì)促進(jìn)大分子分離用于后期分析。
[0029]任選地，本發(fā)明的組合物可進(jìn)一步包含一種或多種緩沖劑(每種優(yōu)選以約ImM-約I M的量在最終組合物中存在)。示例性緩沖劑包括，優(yōu)選地，三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、檸檬酸鹽、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、％斧雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、1，3-雙(三(羥甲基)甲基氨基)丙烷(BiS-TriS)、3-(環(huán)己氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-(環(huán)己氨基)-2-羥基-1-丙磺酸(CAPSO)、4-(2_羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-(斧嗎啉代)丙磺酸(MOPS)、3-(斧嗎啉代)-2-羥基丙磺酸(MOPSO)、哌嗪-N，N\’ -雙(2-羥基丙磺酸(POPSO)、斧[三(羥甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸(TAPS)、斧[三(羥甲基)甲基]-3-氨基-2-羥基丙磺酸(TAPSO)、斧[三(羥甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸(TES)、雙(2-羥乙基)甘氨酸(Bicine)、斧[三(羥甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、斧2-乙酰胺基_2_亞氨基二乙酸(ADA)、斧(2-乙酰胺基)_2_氨基乙磺酸(ACES)、哌嗪-1，4-雙(2-乙磺酸)(PIPES)、碳酸氫鹽、磷酸鹽或其任何組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，緩沖劑包括檸檬酸鹽。
[0030]包含一種或多種這樣的任選但優(yōu)選的緩沖劑對(duì)于控制該配方的pH是所需的，這是因?yàn)槿藗儼l(fā)現(xiàn)核酸提取在約5-8的pH范圍內(nèi)最佳。優(yōu)選地，選擇所公開(kāi)組合物中使用的一種或多種緩沖劑以提供PH約5.5-約7.5范圍內(nèi)、更優(yōu)選約6-約7的pH范圍內(nèi)、還更優(yōu)選約6.2-約6.8的pH范圍內(nèi)的顯著緩沖能力。在示例性實(shí)施方案中，PrimeStore?溶液(本文中也稱(chēng)為“PSS”)的pH優(yōu)選約6.9 ± 0.25ο
[0031]本發(fā)明組合物還可進(jìn)一步任選包括一種或多種短鏈(優(yōu)選1-至6-碳[即，C1-C6]醇)烷醇(每種優(yōu)選在組合物中以約1%-約25%的量存在，盡管若需要可使用更高百分比的醇)。示例性短鏈烷醇包括直鏈和支鏈醇，例如，而不限于，甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇或其任何組合。
[0032]本發(fā)明組合物還可進(jìn)一步任選包含一種或多種額外的化合物或試劑，包括，而不限于，陽(yáng)離子官能化兩性離子化合物例如甜菜堿(包括，而不限于，A A斧三甲基甘氨酸、椰油酰胺丙基甜菜堿等)、硬蛋白(包括，而不限于，卵白蛋白和牛、馬或人類(lèi)來(lái)源的血清白蛋白)和滲透物(包括，而不限于，斧氧化三甲胺(TMAO)、二甲基锍基丙酸鹽、肌氨酸以及糖類(lèi)或糖醇(包括，而不限于，海藻糖、麥芽糖、鼠李糖、蔗糖、阿拉伯糖、巖藻糖、甘露醇、山梨醇、核糖醇等)。
[0033]優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物提供足夠的緩沖能力以充分穩(wěn)定從樣品獲得的多核苷酸群，并且最優(yōu)選地將在配制期間被緩沖至PH約6.4-6.9，以及在樣品與本文所述儲(chǔ)存/采集配方接觸時(shí)將所分離的多核苷酸群維持在相似的pH范圍內(nèi)。組合物的緩沖能力優(yōu)選通過(guò)使緩沖劑的PKa值與組合物的pH匹配而最大化。pKa與pH之間的變化優(yōu)選等于或小于±1.0、±0.75、±0.5 或 ±0.25。
[0034]本發(fā)明組合物將通常至少基本上滅活，并且優(yōu)選完全滅活樣品中存在的任何內(nèi)源或外源RNA酶、DNA酶或蛋白酶，以使得在采集、裂解、濃縮、儲(chǔ)存和運(yùn)輸樣品用于后續(xù)體外分析期間樣品的大分子基本上無(wú)任何降解，優(yōu)選不降解或喪失完整性。
[0035]本發(fā)明的儲(chǔ)存/運(yùn)輸/采集組合物的示例性配方在本文實(shí)施例中描述，并且包括，而不限于，包含約4 M離液劑(例如硫氰酸胍、鹽酸胍、異氰酸胍或其任何組合)、約10mM-30 mM螯合劑(例如EGTA、HEDTA、DTPA、NTA、EDTA、無(wú)水檸檬酸、檸檬酸鈉、檸檬酸鈣、檸檬酸銨、朽1檬酸氫銨、朽1檬酸、朽1檬酸二銨、朽1檬酸鐵銨、朽1檬酸鋰或其任何組合)、約0.25%洗滌劑(例如SDS、LDS、NaTDC、NaTC、NaGC、NaDC、膽酸鈉、NaABS、NLS或其任何鹽或組合)、約0.1 M還原劑(例如β -ME、DTT、DMSO,甲酰胺、TCEP或其任何組合)、約0.1%表面活性劑/消泡劑(例如有機(jī)娃聚合物[例如，Antifoam A?]或聚山梨醇酯[例如,Tween?]或其任何組合)和約1.0 μδ/100μ1磁性親和珠的組合物。
[0036]本發(fā)明的樣品采集組合物的另外的示例性配方包括，而不限于，包含約3 M離液劑(例如硫氰酸胍、鹽酸胍、異氰酸胍或其任何組合)、約I mM-Ο.5 M還原劑(例如，β-ΜΕ、TCEP、甲酰胺、DTT、DMSO或其任何組合)、約1-約10 mM螯合劑(例如，EGTA、HEDTA、DTPA、NTA、EDTA、無(wú)水檸檬酸、檸檬酸鈉、檸檬酸鈣、檸檬酸銨、檸檬酸氫銨、檸檬酸、檸檬酸二銨、檸檬酸鐵銨、檸檬酸鋰或其任何組合)、約0.25%洗滌劑(例如SDS、LDS、NaTDC、NaTC、NaGC、NaDC、膽酸鈉、NaABS, NLS或其任何鹽或組合)和任選但優(yōu)選約0.0002%消泡劑(也稱(chēng)為抗泡沫劑)(例如有機(jī)娃聚合物或聚山梨醇酯或其任何組合)、約100 mM緩沖劑(例如Tris, MES、BES、Bis-Tris, HEPES, MOPS、碳酸氫鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其任何組合)和約
1.0 μ@/100μ1磁性親和珠的組合物。
[0037]所公開(kāi)的多核苷酸分離和穩(wěn)定組合物的另一個(gè)示例性配方包括，而不限于，包含約1-約4 M離液劑(例如硫氰酸胍、鹽酸胍或異氰酸胍)、約0.5-100 mM螯合劑(例如EDTA或檸檬酸鈉或二者)、約0.1-約1%陰離子洗滌劑(例如SDS或月桂酰肌氨酸鈉鹽)、約0.001-約0.0001%表面活性劑或濕潤(rùn)劑(例如有機(jī)硅聚合物、Antifoam A?、e)、約10-約500 mM緩沖劑(例如Tris-HCl)、約10-約25%短鏈烷醇(例如乙醇)和約1.0 μδ/100μ1磁性親和珠的組合物。
[0038]在特別的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含約2.5 M硫氰酸胍、約0.5 mM TCEPjS 10mM檸檬酸鈉、約0.4%斧月桂酰肌氨酸鈉鹽、約0.0002% Antifoam A、約100 mM Tris-HCl,約0.1 mM EDTA、約23%乙醇和約1.0 μδ/100μ1磁性親和珠的組合物。
[0039]本發(fā)明還提供用于從樣品獲取核酸群的方法。所述方法一般包括樣品與一定量的本發(fā)明組合物之一在有效從樣品獲取核酸群的條件下混合。本發(fā)明任選包括幫助DNA/RNA從生物樣品的細(xì)胞或細(xì)胞結(jié)構(gòu)中釋放和親和濃縮期需的核酸群用于后期的核酸和/或序列分析。
[0040]本發(fā)明還提供制備本文所述用于采集大分子例如蛋白質(zhì)、RNA和/或DNA的采集/裂解/運(yùn)輸/儲(chǔ)存組合物的一步含水配方的方法。在整體認(rèn)識(shí)上，所述方法通常包括在一個(gè)反應(yīng)區(qū)中于約20°C _90°C的溫度下混合一種或多種離液劑和無(wú)核酸酶水；然后在該反應(yīng)區(qū)混合溶解的一種或多種離液劑與一種或多種還原劑、一種或多種螯合劑和一種或多種洗滌劑以形成中間組合物；任選以足夠在進(jìn)一步制備該一步含水配方期間使泡沫形成減到最少的量混合有機(jī)硅聚合物與中間組合物；向中間組合物混合入足夠量的緩沖劑以維持約6-6.9的pH ;任選向所述反應(yīng)區(qū)混合入第二種螯合劑；然后將第二個(gè)中間組合物的溫度升高至約60-95°C達(dá)約1-30分鐘并將溫度降低至環(huán)境條件；任選然后混合C^6醇與所述反應(yīng)區(qū)的內(nèi)含物；并任選將PH調(diào)節(jié)至約6.4-6.9以及加入核酸捕獲材料。
[0041]在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于制備適合從生物樣品或樣本中獲得核酸群的一步含水配方的方法。該方法通常涉及至少以下步驟:a)使樣品與一定量的一步含水配方接觸，其有效:i)至少基本上殺死或滅活樣品中的潛在-傳染性病原體；ii)至少化學(xué)或物理裂解部分的細(xì)胞以從樣品中釋放期需的核酸；和iii)至少基本上抑制或防止樣品中釋放的核酸進(jìn)一步水解或酶降解、修飾或失活，以便從樣品中獲得期需的核酸群。
[0042]優(yōu)選地，本發(fā)明的方法將包括至少使樣品與一定量的一種或多種公開(kāi)的組合物在約0°C -約40°C的溫度下(更優(yōu)選在4°C -約35°C的溫度下，還更優(yōu)選在10°C -約30°C的溫度或環(huán)境溫度下)接觸至少15分鐘、更優(yōu)選30分鐘和更優(yōu)選至少8-24小時(shí)的時(shí)間。與組合物接觸期間和其后的所有時(shí)間，期需的核酸基本上保持完整，以便可檢測(cè)，而不遭受實(shí)質(zhì)性變質(zhì)、降解、酶裂解和/或消化、修飾或其它處理。
[0043]優(yōu)選地，從樣品釋放入組合物的核酸群的完整性基本上得以保持，甚至當(dāng)包含樣品的組合物在環(huán)境溫度下儲(chǔ)存時(shí)，并且甚至儲(chǔ)存延長(zhǎng)的時(shí)間段，包括，而不限于，儲(chǔ)存大于約2天、大于約5天、大于約10天、大于約20天或甚至大于約30天或更久。同樣，從樣品釋放入組合物的核酸群的完整性將基本上得以保持，甚至當(dāng)包含樣品的組合物在亞熱帶和熱帶溫度下儲(chǔ)存一甚至儲(chǔ)存延長(zhǎng)的時(shí)間段，包括，而不限于，儲(chǔ)存大于或等于約5天、大于或等于約10天、大于或等于約15天或甚至大于或等于約20、約25、約30、約35、約40、約60或約90天或甚至更久時(shí)，為期需的。
[0044]在本方法的實(shí)施中，優(yōu)選樣品內(nèi)包含的至少一種或多種生物細(xì)胞基本上被裂解以至少將所述細(xì)胞內(nèi)包含的第一核酸群或第一多數(shù)核酸釋放入組合物中。優(yōu)選地，所公開(kāi)的組合物的組分足以釋放和其后通過(guò)與基質(zhì)材料親和性結(jié)合從所有或基本上所有不需要的細(xì)胞/組織和/或樣品碎片(包括，而不限于，脂質(zhì)、磷脂、肽、蛋白質(zhì)、多糖、脂多糖、多元醇、細(xì)胞器、膜組分等)分離這樣的群。
[0045]在本方法實(shí)施中還期需，當(dāng)采集時(shí)樣品中、樣品上或樣品周?chē)嬖谝环N或多種微生物、病毒、真菌和/或其它目的病原體或生物時(shí)，一旦與幫助從業(yè)者安全處理樣品的組合物接觸，這些微生物、病毒、真菌和/或其它目的病原體或生物將被裂解、充分滅活或基本上殺死。優(yōu)選地，所公開(kāi)的組合物的一種或多種組分有效使致病樣品基本上或優(yōu)選完全非-致病，而不需向組合物中加入另外的組分。然而，在某些應(yīng)用中，以下亦是合乎需要的:組合物內(nèi)包含一種或多種另外的抗-微生物、抗-病毒或抗-真菌劑以使其基本非-致病，因此其對(duì)從業(yè)者操作而言是安全的。
[0046]優(yōu)選地，包含樣品的組合物至少足夠穩(wěn)定以允許至少基本上(或完全地)從樣品或樣本采集時(shí)間基本上直至分析或表征樣品內(nèi)至少第一個(gè)大分子群的時(shí)間，在環(huán)境、近似環(huán)境或甚至更冷或更暖的條件下儲(chǔ)存組合物中的樣品。如本文所使用的，“環(huán)境溫度”可指約18°C -25°C的溫度，或在一些實(shí)施方案中，更優(yōu)選約20°C -約22°C。
[0047]優(yōu)選地，包含疑似包含期需核酸的樣品的組合物將穩(wěn)定和分離核酸達(dá)到甚至當(dāng)組合物在環(huán)境、冰箱或零下溫度長(zhǎng)期儲(chǔ)存時(shí)其保持至少基本上無(wú)-降解(即，至少基本上穩(wěn)定)的程度。該穩(wěn)定性提供所儲(chǔ)存樣品內(nèi)包含的至少約70%、至少約85%、更優(yōu)選至少約90%、更優(yōu)選至少約95%或甚至更優(yōu)選至少約98%的核酸在長(zhǎng)期儲(chǔ)存樣品時(shí)不降解為期需的。在某些實(shí)施方案中，樣品內(nèi)包含的基本上所有期需的核酸為穩(wěn)定的，以使得其原始完整性在采集、裂解、儲(chǔ)存和運(yùn)輸所處理的樣品的過(guò)程中得以保持。
[0048]本發(fā)明還提供利用所公開(kāi)的組合物和本文所述的采集/儲(chǔ)存/運(yùn)輸/分離溶液的試劑盒和樣品采集系統(tǒng)。在具體的實(shí)施方案中，這樣的樣品采集系統(tǒng)可包括采集裝置例如棉球、刮匙或培養(yǎng)環(huán)；和包含一種或多種本文所公開(kāi)的組合物的采集容器例如小瓶、試管或樣品杯。采集容器優(yōu)選為可釋放或可打開(kāi)的，以便可將其打開(kāi)插入一步組合物并關(guān)閉和包裝、打開(kāi)插入樣品和任選一部分采集裝置并關(guān)閉用于儲(chǔ)存和運(yùn)輸或二者。采集容器可使用任何合適的可釋放或可打開(kāi)的機(jī)制，包括而不限于螺旋帽、彈簧蓋、按壓-和-打開(kāi)蓋等。這樣的系統(tǒng)還可進(jìn)一步任選包含一種或多種另外的試劑、儲(chǔ)存裝置、運(yùn)輸裝置和/或用于在此種系統(tǒng)中獲取、采集、裂解、儲(chǔ)存或運(yùn)輸樣品的說(shuō)明書(shū)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的一步組合物可已經(jīng)被排列在可混合樣品的反應(yīng)區(qū)。在這樣的實(shí)施方案中，本發(fā)明僅需要采集裝置和采集容器。所述試劑盒優(yōu)選包括一種或多種分離或提取元件以幫助從一種或多種其它的生物分子或樣品組分中放出和/或分離樣品內(nèi)包含的一個(gè)或多個(gè)核酸群以獲得適于鑒定、檢測(cè)或進(jìn)一步分子分析的至少部分上或基本上純化的核酸。
[0049]試劑盒還可進(jìn)行包裝用于商業(yè)流通，并且可進(jìn)一步任選包含一種或多種用于樣本或樣品采集、操作或處理的采集、遞送、運(yùn)輸、儲(chǔ)存和/或分離裝置。用于此種試劑盒的容器可通常包括至少一個(gè)可放置組合物的小瓶、試管、燒瓶、瓶子、杯子或其它合適的容器或采集裝置，并且，優(yōu)先地，合適地等分用于個(gè)體樣品采集、運(yùn)輸和/或儲(chǔ)存。試劑盒還可包括包含上述較小的單獨(dú)容器連同其它采集裝置、設(shè)備、試劑、說(shuō)明書(shū)等的較大容器，例如箱子。試劑盒還可任選包含一種或多種另外的緩沖劑、化合物或組合物，并且還可進(jìn)一步任選包含一個(gè)或多個(gè)詳細(xì)說(shuō)明試劑盒在采集或儲(chǔ)存一種或多種生物學(xué)、臨床、診斷、環(huán)境或法醫(yī)樣品中使用的說(shuō)明書(shū)。任選地，試劑盒還可進(jìn)一步提供用于運(yùn)輸放置在一種或多種所公開(kāi)組合物中的樣品的說(shuō)明書(shū)，甚至可包括詳細(xì)說(shuō)明使用從樣本或樣品分離的核酸的一種或多種后續(xù)分析方法或測(cè)定的說(shuō)明書(shū)或另外的試劑。這樣的試劑盒可還包含多種不同的采集裝置和采集容器以及待包含的任何其它組分，以使得該試劑盒可用于從相同或不同來(lái)源采集多個(gè)樣品。在一個(gè)商業(yè)應(yīng)用中，試劑盒一組5個(gè)或更多個(gè)包裝以便于出售和使用。
[0050]任選地，本發(fā)明的組合物可包含適當(dāng)?shù)目蓹z測(cè)標(biāo)志物(即，“標(biāo)簽”)用于檢測(cè)目的大分子的存在。本領(lǐng)域已知多種多樣的適當(dāng)指示劑化合物和組合物，包括，而不限于，熒光、放射性、酶或其它配體，例如親和素/生物素等，其能夠被檢測(cè)。使用熒光標(biāo)簽或酶標(biāo)記例如脲酶、堿性磷酸酶或過(guò)氧化物酶代替放射性或其它環(huán)境較不期需的試劑可為合乎需要的。對(duì)于酶標(biāo)記的情況，已知可利用比色、發(fā)色或熒光指示劑底物提供用于檢測(cè)人眼可見(jiàn)的樣品的方法，或通過(guò)分析方法例如閃爍掃描術(shù)、熒光測(cè)定法、分光光度法等，以鑒定特定大分子。
[0051]一般而言，所述探針可用作PCR的溶液雜交中(以檢測(cè)特定的核酸序列)以及利用固相的實(shí)施方案中的試劑兩者。一個(gè)為人熟知的擴(kuò)增方法為聚合酶鏈反應(yīng)(稱(chēng)為PCR)，其在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，683，195,4, 683，202和4，800，159中詳細(xì)描述，每個(gè)專(zhuān)利通過(guò)引用以其整體結(jié)合到本文中。另一個(gè)用于擴(kuò)增的方法為連接酶鏈反應(yīng)(“LCR”)，在例如EPA N0.320308和美國(guó)專(zhuān)利4，883，750中公開(kāi)，每個(gè)通過(guò)對(duì)其明確引用以其整體結(jié)合到本文中。鏈置換擴(kuò)增(SDA)為另一種進(jìn)行核酸等溫?cái)U(kuò)增的方法，涉及多輪鏈置換和合成，即，切口平移。相似的方法，名為修復(fù)鏈反應(yīng)(RCR)，涉及退火遍及靶向擴(kuò)增區(qū)域的數(shù)個(gè)探針，接著為其中僅存在四個(gè)堿基中的兩個(gè)的修復(fù)反應(yīng)。其它兩個(gè)堿基可作為生物素化衍生物加入以便容易檢測(cè)。SDA中使用了相似的方法。靶特異性序列還可使用循環(huán)探針?lè)磻?yīng)(CPR)檢測(cè)。在CPR中，具有非特定DNA的3'和5'序列和特定RNA中間序列的探針與樣品中存在的DNA雜交。一旦雜交，反應(yīng)用RNA酶II處理，探針產(chǎn)物經(jīng)鑒定為消化后釋放的獨(dú)特產(chǎn)物。原始模板退火至另一個(gè)循環(huán)探針，重復(fù)反應(yīng)。
[0052]下列實(shí)施例說(shuō)明了本發(fā)明的實(shí)施方案，但不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例
[0053]一經(jīng)配制,PrimeStore ?原液在4°C或低于4°C穩(wěn)定至少一年或更久的時(shí)間。配制的PrimeStore?溶液(PSS)在環(huán)境溫度(例如，約20_30°C )下穩(wěn)定許多個(gè)月的時(shí)間。一旦樣品與如本文所公開(kāi)的PrimeStore ?配方接觸，其可合理預(yù)期在0°C或更低的溫度下無(wú)限期儲(chǔ)存、在冷藏(例如，?4°C )下儲(chǔ)存至少一年或更久和在環(huán)境溫度(例如，約20-30°C)下儲(chǔ)存至少30天或更久，而樣品的核酸組成、保真度或完整性無(wú)明顯損失。例如，而不限于，當(dāng)包含樣品的組合物在約-20°C -約40°C的溫度下儲(chǔ)存約30天-約60天時(shí)，獲自樣品的多核苷酸群的完整性至少基本上維持，以及優(yōu)選完全維持，而無(wú)可檢測(cè)的降解。
[0054]實(shí)施例1 -示例性?xún)?chǔ)存溶液的配方
本實(shí)施例提供本發(fā)明的PSS組合物的一般配方。PSS組合物的另外的配方在實(shí)施例2-5中例示。
[0055]用于制備PrimeStore ?組合物的示例性組分的配方范圍化合物終濃度范圍離液劑，例如:
硫氰酸胍約0.5 M-約6 M
或鹽酸胍約0.5 M-約6 M
或異氰酸胍約0.5 M-約6 M
陰離子洗滌劑，例如:
N~月桂酰肌氨酸(特別是鈉鹽)約0.15%-約1% (wt./vol.)
或十二燒基硫酸鈉約0.15%-約1% (wt./vol.)
十二燒基硫酸鋰約0.15%-約1% (wt./vol.)
甘膽酸鈉約0.15%-約1% (wt./vol.)
脫氧膽酸鈉約0.15%-約1% (wt./vol.)
牛磺脫氧膽酸鈉，或約0.15%-約1% (wt./vol.)
膽酸鈉約 0.1%-約 1% (wt./vol.)
還原劑，例如:
TCEP約 0.5 mM-約 30 mM
或 β -ME、DTT、甲酰胺或 DMSO約 0.05 M-約 0.3 M
螯合劑，例如:
檸檬酸鈉約0.5 mM-約50 mM
或 EGTA、HEDTA, DTPA, NTA、APCA 等約 0.01 mM-約 I mM
緩沖劑(例如 TRIS、HEPES, Bis-Tris 等)約 I mM-約 I M 酸(例如，HCl或檸檬酸)適量，以將pH調(diào)為


6-7，優(yōu)選約 6.4-6.8 無(wú)核酸酶水適量，至期需的終體積
任選以下一種或多種: 表面活性劑/消泡劑，例如:
Antifoam A? 或 Tween?約 0.0001%-約 0.3%(wt./vol.)
烷醇(例如，甲醇、乙醇、丙醇等) 約1%_約25% (vol./vol.)
載體 /IPC RNA 或 DNA約 I pg-約 I Pg/mL
磁性 NACM約 I ng-10 Pg 每 100 μ?
硫氰酸胍、朽1檬酸鈉、Antifoam A? Concentrate和斧月桂酰肌氨酸鈉鹽均購(gòu)自SigmaChemical C0.(St.Louis, MO, USA)。三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)獲自 SoltecVentures Inc.(Beverly, MA, USA)。2_ 氨基 _2_ 輕甲基-丙燒-1，3_ 二醇(TRIS)獲自Applied B1systems/Amb1n (Austin, TX, USA)。2_[2_(雙(羧甲基)氨基)乙基-(羧甲基)氨基]乙酸(EDTA) GIBCO? Ultra Pure 獲自 Invitrogen Corp.(Carlsbad, CA,USA)。所有其它試劑可從Sigma-Aldrich或USB Corporat1n市售獲得。
[0056]實(shí)施例2 -示例性?xún)?chǔ)存溶液的配方
本實(shí)施例描述了本發(fā)明組合物的第一種示例性配方。該配方或者稱(chēng)為“PrimeStore?溶液”或“PSS”版本I。
[0057]PrimeStore ?組合物(版本I)的制備化合物終濃度硫氰酸胍 4 M
檸檬酸鈉30 mM
十二燒基硫酸鈉0.25% (wt./vol.)
斧月桂酰肌氨酸鈉鹽0.25% (wt./vol.)
2-巰基乙醇(β-ME)0.1 M
Anti foam A0.1% (wt./vol.)
檸檬酸適量，以將pH調(diào)節(jié)到6.5
無(wú)核酸酶水11.82 mL
磁性NACM珠I Pg
實(shí)施例3 -第二種示例性?xún)?chǔ)存溶液的配方
本實(shí)施例描述本發(fā)明的另一種示例性?xún)?chǔ)存溶液的制備。該配方可稱(chēng)為PSS或PrimeStore ?版本 2。
[0058]PrimeStore ?組合物(版本2)的制備化合物量終濃度
硫氰酸胍35.488 gm3 M
TCEP0.02867 gmI mM
檸檬酸鈉0.2931 gm10 mM
斧月桂酰肌氨酸鈉鹽(NLS)0.5 gm0.5%
Antifoam A (10% 溶液)200 μ?0.002%
TRIS (I Μ)10 mL100 mM
EDTA (0.5 Μ)20 μ?0.1 mM
鹽酸(HCl)適量，以調(diào)節(jié)pH到6.7 —
無(wú)核酸酶水適量，至100 mL—磁性NACM珠I Pg—
實(shí)施例4 -第三種示例性?xún)?chǔ)存溶液的配方
本實(shí)施例描述了本發(fā)明的另一種示例性?xún)?chǔ)存溶液的制備。該配方可稱(chēng)為PSS或PrimeStore ?版本 2.2。
[0059]PrimeStore ?組合物(版本2.2)的制備化合物量終濃度
硫氰酸胍35.488 gm2.5 M
TCEP0.02867 gm0.5 mM
檸檬酸鈉0.2931 gm10 mM
斧月桂酰肌氨酸鈉鹽(NLS) 0.5 gm0.4%
Antifoam A (10% 溶液)200 μ?0.002%
TRIS (I Μ)10 mL100 mM
EDTA (0.5 Μ)20 μ?0.1 mM
乙醇，分子級(jí)(96-100%)23 mL23% (vol./vol.)
鹽酸(HCl)適量，以調(diào)節(jié)pH到6.7 —
無(wú)核酸酶水適量，至100 mL—
磁性NACM珠I Pg—
實(shí)施例5
將來(lái)自被其它生物污染的痰或其它含粘液樣品的革蘭氏陽(yáng)性分枝桿菌滅活是困難的，這是因?yàn)榉种U菌常常被樣品內(nèi)的高粘性痰粘液內(nèi)容物庇護(hù)。PSS中存在的組分通過(guò)磷脂膜剪切、蛋白質(zhì)變性、螯合和緩沖作用化學(xué)滅活/殺死而安全滅活18濃度的分枝桿菌。然而，所采集的包含人血清白蛋白、粘多糖和粘蛋白成分的原始痰樣品中存在的分枝桿菌可庇護(hù)和保護(hù)生物不被PSS中化學(xué)滅活機(jī)制直接滅活。促進(jìn)采集在PSS中的原始痰樣品的分枝桿菌失活的另外的策略包括使用各種不同大小的瓷、陶瓷、塑料或玻璃珠物理攪拌。當(dāng)結(jié)合渦旋時(shí)，痰基質(zhì)被物理破壞使生物暴露在PSS中并促進(jìn)更大的失活。此外，使用用二氧化硅包覆并磁化的相同或不同小珠結(jié)合和濃縮通過(guò)PSS化學(xué)過(guò)程從滅活的細(xì)胞和微生物中釋放的DNA和RNA。核酸(DNA/RNA)與二氧化硅的高親和性粘附的必要條件為:1)優(yōu)選的6.8-7.0的pH，和2)優(yōu)選離液劑存在。此兩個(gè)優(yōu)選項(xiàng)為PSS配方的現(xiàn)有特征。包含小珠的PSS促進(jìn)殺死原始痰樣品中的分枝桿菌。進(jìn)一步添加磁化的、二氧化硅包覆的用于采集管并與磁性架組合的小珠還濃縮原始樣品中的核酸。除了通過(guò)基于小珠的渦旋的物理攪拌，加熱(在50-90°C的溫度范圍內(nèi))和/或超聲處理促進(jìn)滅活和殺死原始痰樣品中的分枝桿菌。
[0060]實(shí)施例6用于PSS制備的示例性方案
首先將40 mL無(wú)核酸酶水加入到具有攪拌棒的干凈燒杯中。將燒杯放置在熱板/攪拌器上并將溫度調(diào)至60-65°C。攪拌速度設(shè)置為中級(jí)，緩慢向水中加入35.488 gm硫氰酸胍，使其隨加入而溶解。接著，向燒杯中加入0.0287 gm TCEP并增加攪拌速度以幫助溶解晶體。向燒杯中加入0.2931 gm檸檬酸鈉，接著向溶液中加入0.5 gm NLS0然后再次增加攪拌速度以在燒杯中產(chǎn)生渦旋。此渦旋將NLS拉入溶液內(nèi)并幫助溶解試劑。將制備好的10%Antifoam A溶液(I mL Antifoam A濃縮物+ 9 mL無(wú)核酸酶水)潤(rùn)旋并將200 μ I 10%Anti foam A吸移入溶液中。接著，向溶液中加入10 mL I M TRIS和20 μ? 0.5 M EDTA。升高溫度以使溶液至75-80°C，攪拌3-5分鐘。將燒杯從熱源處移走，使溶液冷卻至室溫
22-250C )。向溶液中加入23 mL乙醇并充分混合，用HCl將pH調(diào)至6.9。將溶液倒入干凈的100 mL量筒中。隨無(wú)核酸酶水加入I Pg磁性親和基質(zhì)小珠，使總體積至100 mL。將溶液轉(zhuǎn)移至標(biāo)記的無(wú)菌容器中并室溫22-25°C )儲(chǔ)存。優(yōu)選每種試劑完全溶解，然后加入下一種。
[0061]實(shí)施例7用于制備具有磁珠提取的PrimeStore的方案
PrimeStore MTM在5 mL冷凍管中制備為1.5 mL溶液。本實(shí)施例使用了兩種類(lèi)型的可市售獲得的二氧化娃包覆的磁性小珠(MagAttract Material N0.1031699, Qiagen,和Agencourt, Beckman Coulter, Inc)。向 PrimeStore MTM 管中總共加入 100 μ L 小珠。通過(guò)戍二醒和超聲滅活的純化的結(jié)核分枝桿菌{Mycobacterium tuberculosis) (H27Rv)菌株以13 CFU/mL的濃度使用。向包含磁珠的PrimeStore管和無(wú)磁珠的PrimeStore管(對(duì)照)中加入結(jié)核分枝桿菌(MTB)。將PrimeStore管渦旋5-10秒，隨后將具有小珠的管粘附在磁體頂上2分鐘以將管內(nèi)小珠吸在底部。當(dāng)在磁體上時(shí)，打開(kāi)PrimeStore管的蓋子并除去溶液。將管從磁體移走，向小珠加入200 μ L無(wú)核酸酶水。將每管渦旋以從小珠洗脫核酸。將PrimeStore管放回至磁體2分鐘將小珠拉至底部。將洗出液轉(zhuǎn)移至微量離心管。將200 μ? PrimeStore (無(wú)磁珠)外加包含MTB移走并置于微量離心管內(nèi)用作未濃縮的對(duì)照。小珠-濃縮和對(duì)照管的200 μ I等分試樣使用Qiagen DNA Mini Kit (Qiagen Inc.,Valencia, CA)提取核酸。從兩個(gè)提取程序純化的核酸使用實(shí)時(shí)PCR測(cè)定在ABI實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上以復(fù)制方式擴(kuò)增。從具有磁珠的PrimeStore MTM的檢測(cè)具有復(fù)制(^值28.50，而從無(wú)磁珠的PrimeStore MTM的檢測(cè)具有復(fù)制(^值29.78。使用玻璃珠濃縮的樣品C τ值的減少指示較高的初始模板開(kāi)始濃度。這些結(jié)果證明二氧化硅包覆的小珠以及可能的其它親和基質(zhì)材料作為任何二氧化硅包覆基質(zhì)的實(shí)例，與PrimeStore MTM溶液兼容。同樣，用磁珠捕獲允許提取前樣品核酸濃度增加，并增加檢測(cè)靈敏度。這允許濃縮低水平樣品的核酸，用于可能檢測(cè)生物樣品中病原體的存在或不存在。因此，該方法學(xué)為用于在提取前濃縮所采集樣品的微量核酸(RNA和DNA)的簡(jiǎn)化和有效途徑。
[0062]對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，考慮到本文所公開(kāi)的發(fā)明的說(shuō)明書(shū)和實(shí)踐，本發(fā)明的其它實(shí)施方案和用途將顯而易見(jiàn)。本文引用的所有參考，包括所有出版物、美國(guó)和外國(guó)專(zhuān)利及專(zhuān)利申請(qǐng)，通過(guò)引用特別地和完整地結(jié)合。2011年12月27日發(fā)行的標(biāo)題為“全參樣品采集和運(yùn)輸系統(tǒng)及使用方的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)8，084，443,2012年12月20日發(fā)行的標(biāo)題為“生物樣品采集和運(yùn)輸系統(tǒng)及方法”的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)8，080, 645、2012年I月17日發(fā)行的標(biāo)、用于快速、實(shí)時(shí)檢測(cè)流感病毒A型(HlNl)豬2009的組合物和方法”的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)8，097，419,2011年4月26日提交的標(biāo)題為“用于檢測(cè)、鑒定和定量分枝桿菌1_特異性核酸的組合物和方法”的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?3/094，809和2012年4月26日提交的標(biāo)題為“廣于檢測(cè)和鑒定生物樣品中的核酸的組合物和方法”的國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2012/35253各自通過(guò)引用特別地和完整地結(jié)合。術(shù)語(yǔ)包括，無(wú)論何處使用，意在包含術(shù)語(yǔ)由……組成和基本由......組成。此外，術(shù)語(yǔ)包括(comprising)、包含(including)和含有(containing)并不意在限制。說(shuō)明書(shū)和實(shí)施例僅意在為示例性的，本發(fā)明的真實(shí)范圍和精神通過(guò)所附權(quán)利要求書(shū)指示。
【權(quán)利要求】
1.一種含水組合物，包含: 一種或多種離液劑； 一種或多種洗滌劑； 一種或多種還原劑； 一種或多種螯合劑； 一種或多種緩沖劑，和 一種或多種核酸捕獲基質(zhì)材料， 一起以當(dāng)疑似包含所選核酸序列的樣品與組合物接觸時(shí)足以變性蛋白質(zhì)、滅活核酸酶、殺死病原體并且不降解所述樣品的酶的量存在。
2.權(quán)利要求1的組合物，進(jìn)一步包括疑似包含微生物或細(xì)胞的樣品。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中:a)—種或多種離液劑以約0.5 M-約6 M的量存在；b)一種或多種洗滌劑以約0.1%-約1% (wt./vol.)的量存在；c) 一種或多種還原劑以約0.05M-約0.3 M的量存在；d) —種或多種螯合劑以約0.01 mM-約I mM的量存在；e) —種或多種緩沖劑以約0.0001%-約0.3% (wt./vol.)或約I mM-約IM的量存在；和(f) 一種或多種NACM材料以每100 μ?約I ng-ΙΟ μδ的量存在。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中一種或多種離液劑包括硫氰酸胍、異氰酸胍、鹽酸胍或其任何組合。
5.權(quán)利要求3的組合物，其中一種或多種洗滌劑包括十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鋰、?；敲撗跄懰徕c、牛磺膽酸鈉、甘膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、膽酸鈉、烷基苯磺酸鈉、月桂酰肌氨酸或其任何組合。
6.權(quán)利要求3的組合物，其中一種或多種還原劑包括2-巰基乙醇、三(2-羧乙基)膦、二硫蘇糖醇、二甲基亞砜、三(2-羧乙基)膦或其任何組合。
7.權(quán)利要求3的組合物，其中a)—種或多種螯合劑包括乙二醇四乙酸、羥乙基乙二胺三乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、A 雙(羧甲基)甘氨酸、乙二胺四乙酸、無(wú)水檸檬酸、檸檬酸鈉、朽1檬酸韓、朽1檬酸銨、朽1檬酸氫銨、朽1檬酸、朽1檬酸二銨、朽1檬酸鐵銨、朽1檬酸鋰或其任何組合；或13) —種或多種表面活性劑包括有機(jī)硅聚合物、聚山梨醇酯或其任何組合。
8.權(quán)利要求3的組合物，其中一種或多種緩沖劑包括三(羥甲基)氨基甲烷、檸檬酸鹽、2-(?啉代)乙磺酸、雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸、1，3-雙(三(羥甲基)甲基氨基)丙烷、4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸、3-(?啉代)丙磺酸、碳酸氫鹽、磷酸鹽或其任何組合。
9.權(quán)利要求3的組合物，其中一種或多種核酸捕獲基質(zhì)材料包括用核酸結(jié)合物質(zhì)包覆的瓷、陶瓷、塑料或玻璃珠。
10.權(quán)利要求3的組合物，進(jìn)一步包括一種或多種短鏈烷醇。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述一種或多種短鏈烷醇包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇或其任何組合，以約1-約25% (vol./vol.)的量存在。
12.權(quán)利要求3的組合物，緩沖至pH約6-約7。
13.權(quán)利要求3的組合物，進(jìn)一步包含包括有機(jī)硅聚合物或聚山梨醇酯的消泡劑。
14.權(quán)利要求1的組合物，進(jìn)一步包含裸露的RNA、DNA或其組合。
15.權(quán)利要求1的組合物，其中: 一種或多種離液劑包括約4 M硫氰酸胍； 一種或多種螯合劑包括約30 mM朽1檬酸鈉； 一種或多種洗滌劑包括約0.25% (wt./vol.)十二烷基硫酸鈉和約0.25% (wt./vol.)I月桂酰肌氨酸鈉鹽； 一種或多種還原劑包括約0.1 M 2-巰基乙醇；并進(jìn)一步包含包括約0.1%有機(jī)硅聚合物(wt./vol.)的消泡劑；和 一種或多種核酸捕獲基質(zhì)材料包括用核酸結(jié)合物質(zhì)包覆的聚合物、瓷、陶瓷、塑料、聚合物或玻璃珠，或其組合。
16.權(quán)利要求15的方法，其中樣品包含與組合物接觸后被物理裂解的一種或多種病毒、細(xì)菌、真菌、動(dòng)物或植物細(xì)胞。
17.在疑似包含動(dòng)物或人細(xì)胞或微生物的生物樣品中檢測(cè)核酸序列、基因或基因組存在或不存在的方法，包括: 使生物樣品與一定量的含水組合物接觸，所述組合物包含核酸捕獲基質(zhì)材料和殺死或滅活細(xì)胞或微生物并物理裂解生物樣品的細(xì)胞從細(xì)胞釋放核酸的化學(xué)組分； 分離和濃縮釋放的核酸； 對(duì)分離和濃縮的核酸進(jìn)行核酸檢驗(yàn)；和 從核酸檢驗(yàn)確定病原體特有的特定核酸序列、基因或基因組的存在或不存在，以確定特定核苷酸序列在生物樣品中的存在或不存在。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述序列衍生自病毒、真菌或細(xì)菌病原體，或植物、動(dòng)物或人細(xì)胞。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述化學(xué)組分至少包括離液劑、洗滌劑、還原劑和螯合劑以及緩沖劑。
20.權(quán)利要求17的方法，其中當(dāng)包含樣品的含水組合物在約15°C-約40°C的溫度下保存約7-約14天時(shí)，至少基本上保持核酸的完整性。
21.權(quán)利要求17的方法，其中從采集時(shí)間到檢測(cè)核酸序列存在或不存在的時(shí)間，包含樣品的含水組合物基本上在環(huán)境溫度下儲(chǔ)存。
22.權(quán)利要求17的方法，其中所述核苷酸序列、基因或基因組為一個(gè)癌癥標(biāo)志物序列、多個(gè)癌癥標(biāo)志物序列、指示致病生物或感染存在的序列、指示生物表型情況的序列、指示譜系的序列、指示可鑒定特征的序列、指示突變的序列、指示從野生型或其它已知序列的變化的序列，或其組合。
23.權(quán)利要求17的方法，其中: 離液劑以約0.5 M-約6 M的量存在； 洗滌劑以約0.1%-約1% (wt./vol.)的量存在； 還原劑以約0.05 M-約0.3 M的量存在； 螯合劑以約0.01 mM-約I mM的量存在； 緩沖劑以約0.0001%-約0.3% (wt./vol.)或約I mM-約IM的量存在；和 核酸捕獲基質(zhì)材料以每100 PL約I ng-10 Pg的量存在。
24.權(quán)利要求23的方法，其中: 離液劑包括硫氰酸胍、異氰酸胍、鹽酸胍或其任何組合； 洗滌劑包括十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鋰、牛磺脫氧膽酸鈉、?；悄懰徕c、甘膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、膽酸鈉、烷基苯磺酸鈉、斧月桂酰肌氨酸或其任何組合； 還原劑包括2-巰基乙醇、三(2-羧乙基)膦、二硫蘇糖醇、二甲基亞砜、三(2-羧乙基)膦或其任何組合； 螯合劑包括乙二醇四乙酸、羥乙基乙二胺三乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、A斧雙(羧甲基)甘氨酸、乙二胺四乙酸、無(wú)水檸檬酸、檸檬酸鈉、檸檬酸鈣、檸檬酸銨、檸檬酸氫銨、檸檬酸、檸檬酸二銨、檸檬酸鐵銨、檸檬酸鋰或其任何組合； 表面活性劑包括有機(jī)娃聚合物、聚山梨醇酯或其任何組合；或 緩沖劑包括三(羥甲基)氨基甲烷、檸檬酸鹽、2-(M啉代)乙磺酸、N，Ni (2-羥乙基)-2_氨基乙磺酸、1，3_雙(三(羥甲基)甲基氨基)丙烷、4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸、3-(M啉代)丙磺酸、碳酸氫鹽、磷酸鹽或其任何組合。
25.權(quán)利要求23的方法，進(jìn)一步包含短鏈烷醇，其中短鏈烷醇包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇或其任何組合，并且以約1-約25% (vol./vol.)的濃度存在。
26.權(quán)利要求23的方法，其中所述組合物緩沖至pH約6-約7。
27.權(quán)利要求17的方法，其中核酸捕獲基質(zhì)材料包括用核酸結(jié)合物質(zhì)包覆的聚合物、瓷、陶瓷、塑料、聚合物或玻璃珠。
28.—種組合物，包含:離液劑、洗滌劑、還原劑、螯合劑和緩沖劑，一起以當(dāng)與包含細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸酶和核酸序列的生物樣品接觸時(shí)足以變性蛋白質(zhì)、滅活核酸酶、殺死細(xì)胞并且不降解核酸序列的量存在，并且進(jìn)一步包含核酸親和基質(zhì)介質(zhì)。
29.權(quán)利要求28的組合物，其中親和基質(zhì)介質(zhì)包括一種或多種用核酸結(jié)合物質(zhì)包覆的聚合物、瓷、陶瓷、塑料、聚合物或玻璃珠。
30.權(quán)利要求29的組合物，其中所述核酸結(jié)合物質(zhì)為核酸結(jié)合蛋白或化學(xué)品。
【文檔編號(hào)】C12M1/33GK104471074SQ201380028096
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2013年3月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月28日
【發(fā)明者】W. 費(fèi)希爾 G., T. 道姆 L. 申請(qǐng)人:長(zhǎng)角牛疫苗和診斷有限責(zé)任公司