通過(guò)合成的自我復(fù)制的RNA形成人iPS細(xì)胞的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本公開(kāi)文本提供了用于獲得誘導(dǎo)性干細(xì)胞的方法和組合物，及其制備和使用方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】通過(guò)合成的自我復(fù)制的RNA形成人iPS細(xì)胞
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年5月21日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/649, 876和2013年 3月15日提交的61/798, 229號(hào)的優(yōu)先權(quán)，在此通過(guò)引用將它們每一個(gè)全文并入。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 提供了用于從成纖維細(xì)胞產(chǎn)生和繁殖干細(xì)胞的方法和組合物。本公開(kāi)文本涉及誘 導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPS)的產(chǎn)生及其使用方法。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 干細(xì)胞為再生器官、修復(fù)組織、制備或遞送生物因子和治療疾病或病癥的潛在來(lái) 源。
[0006] 發(fā)明概述
[0007] 患者來(lái)源的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的產(chǎn)生對(duì)于在治療上使用干細(xì)胞是重要的。iPS細(xì) 胞的產(chǎn)生要求幾個(gè)多能性轉(zhuǎn)錄因子或重組因子（RF)的表達(dá)，包括Oct4、Sox2、Klf4、cMyc、 Glisl(和潛在地Nanog與Lin28)。然而，由于擔(dān)心在iPS細(xì)胞產(chǎn)生期間載體DNA(病毒和 裸DNA)整合到基因組中，排除了這些方法隨后應(yīng)用在患者中。
[0008] 本公開(kāi)文本描述了通過(guò)使用來(lái)自修飾的甲病毒（例如委內(nèi)瑞拉馬腦炎（VEE)病 毒）的合成的自我復(fù)制的RNA來(lái)異位表達(dá)RF以產(chǎn)生誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPS)的方法。在 一實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)甲病毒表達(dá)四種RF，使其具有超過(guò)mRNA轉(zhuǎn)染方法的下列優(yōu)勢(shì)：1)利用 能夠用于有限數(shù)量的細(xì)胞分裂的自我復(fù)制的單一RNA種類(lèi)，因此減少了轉(zhuǎn)染量；2)能夠在 一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)RF開(kāi)放閱讀框（0RF)處編碼；以及3)在多次細(xì)胞分裂過(guò)程 中以高閾值水平穩(wěn)定表達(dá)所有RF基因。通過(guò)使用甲病毒的自我復(fù)制骨架（已移除結(jié)構(gòu)基 因）表達(dá)RF只需要3-4次轉(zhuǎn)染（甚至只要1或2次）到原代成纖維細(xì)胞就可以產(chǎn)生iPS 細(xì)胞。甲病毒RF-RNA轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)生利用SP6 (或T7)體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，不要求特別的條件， 因此進(jìn)一步地簡(jiǎn)化了方法用于廣泛用途。通過(guò)隨時(shí)間在相同的細(xì)胞中以穩(wěn)定高水平表達(dá)四 種RF，連同用于有效數(shù)量的多次細(xì)胞傳代的甲病毒-RFRNA的復(fù)制，甲病毒-RFRNA方法 解決了與通過(guò)持續(xù)大于14天每天重復(fù)用四個(gè)單獨(dú)的RFmRNA每天轉(zhuǎn)染來(lái)嘗試產(chǎn)生iPS細(xì) 胞有關(guān)的主要的無(wú)效率問(wèn)題。甲病毒-RFRNA為不利用DNA中間物的異位方法，因此沒(méi)有 機(jī)會(huì)發(fā)生基于DNA載體的iPS細(xì)胞方法可能發(fā)生的整合突變。而且，可以通過(guò)從培養(yǎng)基撤 回B18R來(lái)調(diào)節(jié)通過(guò)降解來(lái)丟失RNA復(fù)制子的時(shí)機(jī)。使用這一方法，0CT4/KLF4/S0X2/c-MYC 與0CT4/KLF4/S0X2/GLIS1甲病毒-RFRNA方案從兩個(gè)獨(dú)立的親代人成纖維細(xì)胞群中產(chǎn)生 了大于100個(gè)獨(dú)立的iPS細(xì)胞克隆。另外，可以改造方法以表達(dá)可選的RF組合和/或向 RF-RNA骨架插入額外的RF0RF，用于從特定的細(xì)胞類(lèi)型提純iPS細(xì)胞產(chǎn)生或在驅(qū)動(dòng)分化轉(zhuǎn) 化中使用。
[0009] 本公開(kāi)文本提供了甲病毒復(fù)制子RNA，其包含至少一個(gè)來(lái)自甲病毒的非結(jié)構(gòu)性復(fù) 制酶域和至少一個(gè)編碼因子的非甲病毒的異源性序列，所述因子用于當(dāng)在體細(xì)胞中表達(dá)時(shí) 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的產(chǎn)生。在一實(shí)施方案中，復(fù)制子包含獲自甲病毒的序列，所述甲病毒選自 東方馬腦炎病毒（EEE)、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒（VEE)、埃弗格賴(lài)德病毒、穆坎博病毒、皮春納 病毒和西方馬腦炎病毒（WEE)。在另一實(shí)施方案中，復(fù)制子包含獲自甲病毒的序列，所述甲 病毒選自辛德畢斯病毒、塞姆利基森林病毒、米德?tīng)柋げ《?、基孔肯雅病毒、阿尼昂尼昂?毒、羅斯河病毒、巴馬森林病毒、蓋他病毒、鷺山病毒、貝巴魯病毒、馬雅羅病毒、烏納病毒、 奧拉病毒、瓦塔羅阿病毒、巴班肯病毒、Kyz病毒（Kyzylagachvirus)、高地J病毒、摩根堡 病毒、恩杜姆病毒、博吉河病毒。還在另一實(shí)施方案中，至少一個(gè)非甲病毒的異源性序列包 含至少2、3、4或5個(gè)非甲病毒的異源性序列。還在另一實(shí)施方案中，在上文任何的非甲病 毒的異源性序列選自編碼KLF多肽、S0X-2多肽、0CT-3/4多肽、c-MYC或n-MYC或L-MYC多 肽、GLIS1多肽、NANOG多肽和其任何組合的多核苷酸。在另一實(shí)施方案中，編碼KLF多肽的 多核苷酸編碼具有與SEQIDN0:8序列至少95%同一性的KLF多肽。在另一實(shí)施方案中， 編碼KLF多肽的多核苷酸編碼具有SEQIDN0:8序列的KLF多肽。還在另一實(shí)施方案中， 編碼KLF多肽的多核苷酸包含SEQIDNO: 7所示序列，其中"T"為"U"。在另一實(shí)施方案 中，編碼S0X-2多肽的多核苷酸編碼具有與SEQIDN0:6序列至少95%同一性的S0X-2多 肽。在另一實(shí)施方案中，編碼S0X-2多肽的多核苷酸編碼具有SEQIDN0:6序列的S0X-2 多肽。還在另一實(shí)施方案中，編碼S0X-2多肽的多核苷酸包含SEQIDN0:5所示序列，其中 "T"為"U"。在另一實(shí)施方案中，編碼0CT-4多肽的多核苷酸編碼具有與SEQIDN0:4序列 至少95%同一性的0CT-4多肽。在另一實(shí)施方案中，編碼0CT-4多肽的多核苷酸編碼具有 SEQIDN0:4序列的0CT-4多肽。還在另一實(shí)施方案中，編碼0CT-4多肽的多核苷酸包含 SEQIDN0:3所示序列，其中"T"為"U"。在另一實(shí)施方案中，編碼c-MYC多肽的多核苷酸 編碼具有與SEQIDNO: 10序列至少95%同一性的c-MYC多肽。在另一實(shí)施方案中，編碼 c-MYC多肽的多核苷酸編碼具有SEQIDNO: 10序列的c-MYC多肽。還在另一實(shí)施方案中， 編碼c-MYC多肽的多核苷酸包含SEQIDN0:9所示序列，其中"T"為"U"。在另一實(shí)施方案 中，編碼GLIS1多肽的多核苷酸編碼具有與SEQIDN0:34序列至少95%同一性的GLIS1多 肽。在另一實(shí)施方案中，編碼GLIS1多肽的多核苷酸編碼具有SEQIDN0:34序列的GLIS1 多肽。還在另一實(shí)施方案中，編碼GLIS1多肽的多核苷酸包含SEQIDN0:33所示序列，其 中"T"為"U"。在另一實(shí)施方案中，編碼NAN0G多肽的多核苷酸編碼具有與SEQIDNO:2序 列至少95%同一性的NANOG多肽。在另一實(shí)施方案中，編碼NANOG多肽的多核苷酸編碼具 有SEQIDN0:2序列的NAN0G多肽。還在另一實(shí)施方案中，編碼NAN0G多肽的多核苷酸包含 SEQIDNO: 1所示序列，其中"T"為"U"。在一實(shí)施方案中，在上文任何的復(fù)制子從5'到3' 包含：(VEERNA復(fù)制酶）-(啟動(dòng)子）-(RFJ-(自切割肽）-(RF2)-(自切割肽）-(RF3) -(IRES 或核心啟動(dòng)子）-(RF4) - (IRES或任選的啟動(dòng)子）-(任選的選擇性標(biāo)記物）-(VEE3 'UTR和聚 腺苷酸尾）_(任選的選擇性標(biāo)記物）_啟動(dòng)子；其中RFh為誘導(dǎo)體細(xì)胞去分化為多能細(xì)胞 的因子，其中RF2_3為任選的、RF3_4為任選的、或RF4為任選的；其中RFh選自0ct-4、Klf4、 Sox-2、c-Myc、Nanog和Glisl。在另一實(shí)施方案中，復(fù)制子包含與SEQIDN0:29、30、31或 32從大約位置1到大約位置756190%、95%、98 %、99 %或100 %同一的序列，其中序列的 "T"被"U"取代，接著是一個(gè)或多個(gè)RF，再接著是3'UTR和聚腺苷酸尾，其中一個(gè)或多個(gè)RF 選自O(shè)ct-3/4、Sox-2、Klf4、c-Myc、Nanog和Glisl;其中當(dāng)存在多個(gè)RF時(shí)，編碼序列可被 內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES)或小啟動(dòng)子所分隔。在另一實(shí)施方案中，復(fù)制子括與選自SEQ 10吣:29、30、31或32的序列至少95%、98%、99%或100%同一的序列，其中"!'"為1"。
[0010] 本公開(kāi)文本也提供了組合物，其包含被如以上任何實(shí)施方案和本文進(jìn)一步所述的 實(shí)施方案中所述的復(fù)制子轉(zhuǎn)化的人細(xì)胞。在一實(shí)施方案中，組合物還包含B18R條件培養(yǎng) 基。在另一實(shí)施方案中，人細(xì)胞為體細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，人細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。
[0011] 本公開(kāi)文本也提供了制備干細(xì)胞的方法，其包括在表達(dá)復(fù)制子的編碼序列的條件 下培養(yǎng)以上和本文他處所述的組合物至少30天，和分離干細(xì)胞。
[0012] 本公開(kāi)文本也提供了制備干細(xì)胞的方法，其包括用本公開(kāi)文本的復(fù)制子轉(zhuǎn)化體細(xì) 胞，在促進(jìn)復(fù)制子表達(dá)的條件下培養(yǎng)體細(xì)胞，和分離干細(xì)胞。在一實(shí)施方案中，培養(yǎng)包括在 B18R條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，通過(guò)將B18RmRNA轉(zhuǎn)染到原代人成纖維 細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生B18R條件培養(yǎng)基。
[0013] 本公開(kāi)文本也提供了通過(guò)本文所述的方法所獲得的分離的干細(xì)胞，其中干細(xì)胞沒(méi) 有逆轉(zhuǎn)錄病毒的DNA或RNA。
[0014] 本公開(kāi)文本也提供了方法，其包括：使人體細(xì)胞與異位的自我復(fù)制的RNA復(fù)制子 接觸，所述復(fù)制子包含編碼至少四個(gè)選自以下的去分化因子的多核苷酸：（i)KLF4、（ii) 0CT4、（iii)SOX2、（iv)c-MYC或n-MYC或L-MYC、（v)GLISl和（vi)NANOG;培養(yǎng)體細(xì)胞以表 達(dá)去分化因子；選擇呈現(xiàn)干細(xì)胞形態(tài)和/或干細(xì)胞標(biāo)志物的細(xì)胞；和繼代培養(yǎng)細(xì)胞以獲得 誘導(dǎo)性干細(xì)胞群。在一實(shí)施方案中，通過(guò)檢測(cè)腫瘤排斥抗原1-60和/或1-81的表達(dá)選擇 細(xì)胞。
[0015] 本公開(kāi)文本也提供了用于產(chǎn)生人干細(xì)胞的載體系統(tǒng)，其包含至少一個(gè)自我復(fù)制 的RNA復(fù)制子，所述復(fù)制子包含一個(gè)或多個(gè)編碼選自以下的去分化因子的多核苷酸：KLF4、 0CT4、S0X2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、GLIS1和NAN0G或其任何組合。在一實(shí)施方案中，復(fù) 制子包含（a) 0ct4、Sox2、Klf4 與c_Myc，或（b) 0ct4、Sox2、Klf4 和Glisl。在另一實(shí)施方 案中，至少一個(gè)自我復(fù)制的RNA載體源自甲病毒。在另一實(shí)施方案中，甲病毒為VEE。
[0016] 本公開(kāi)文本也提供了包含異位的RNA復(fù)制子的分離的人體細(xì)胞，所述復(fù)制子包含 一個(gè)或多個(gè)去分化多核苷酸序列。在另一實(shí)施方案中，其中在表達(dá)異位的RNA復(fù)制子中去 分化多核苷酸的培養(yǎng)條件下，體細(xì)胞去分化。
[0017] 本公開(kāi)文本也提供了包含人體細(xì)胞的細(xì)胞群，所述人體細(xì)胞含有異位的RNA復(fù)制 子，所述復(fù)制子包含一個(gè)或多個(gè)去分化多核苷酸序列。
[0018] 本公開(kāi)文本也提供了通過(guò)以下方法獲得的細(xì)胞群：通過(guò)使人體細(xì)胞與異位的自 我復(fù)制的RNA復(fù)制子接觸，所述復(fù)制子包含編碼至少四個(gè)選自以下的去分化因子的多核苷 酸：（i)KLF4,（ii)0CT4,（iii)S0X2,（iv)c-MYC或n-MYC或L-MYC，（v)GLISl和（vi)NANOG; 培養(yǎng)體細(xì)胞以表達(dá)去分化因子；選擇呈現(xiàn)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)和/或干細(xì)胞標(biāo)志物的細(xì)胞；和繼 代培養(yǎng)細(xì)胞以獲得誘導(dǎo)性干細(xì)胞群。在一實(shí)施方案中，通過(guò)檢測(cè)腫瘤排斥抗原1-60和/或 1-81的表達(dá)選擇細(xì)胞。
[0019] 本公開(kāi)文本也提供了含有編碼B18R的異位的RNA分子的重組的人成纖維細(xì)胞。在 一實(shí)施方案中，編碼B18R的RNA包含SEQIDN0:39,其中"T"被"U"代替。在另一實(shí)施方 案中，RNA編碼包含SEQIDNO:40所示序列的多肽。
[0020] 本公開(kāi)文本也提供了制備B18R條件培養(yǎng)基的方法，其包括在允許B18R表達(dá)的條 件下培養(yǎng)用編碼B18R的RNA轉(zhuǎn)化的人成纖維細(xì)胞，和從培養(yǎng)分離培養(yǎng)基。
[0021] 附圖簡(jiǎn)述
[0022] 圖1A-E顯示了親代人成纖維細(xì)胞中合成的VEE-RFRNA復(fù)制子的結(jié)構(gòu)和持久性。 (A)VEE-RFRNA復(fù)制子的示意圖。5'末端nsPl-4:非結(jié)構(gòu)蛋白1-4;3'末端C，E2，E1:結(jié)構(gòu) 蛋白。26S內(nèi)部啟動(dòng)子，核糖體轉(zhuǎn)移2A肽，IRES序列，嘌呤霉素（Puro)耐藥基因和用于PCR 檢測(cè)復(fù)制子的區(qū)域的位置如所示。（B)B18RmRNA與VEERNA復(fù)制子的共轉(zhuǎn)染能夠在第1天 表達(dá)VEE-GFP。（C)B18R條件培養(yǎng)基（B18R-CM)和嘌呤霉素選擇是VEE-GFPRNA持久超過(guò) 7天必需的。（D)B18R-CM和嘌呤霉素是VEE-GFPRNA保留必需的。如所示的在第7天GFP 表達(dá)的圖片。條，200ym。（E)VEERNA的免疫印跡分析表示的在第1天HFF細(xì)胞中表達(dá)的 重編程因子，與逆轉(zhuǎn)錄病毒（RV-4FS)表達(dá)比較。
[0023] 圖2A-E顯示了通過(guò)VEE-RFRNA產(chǎn)生iPS細(xì)胞。（A)表觀遺傳的VEE-RFRNAiPS 細(xì)胞產(chǎn)生方案的示意圖。在第〇天（d0)平板接種人成纖維細(xì)胞并且在第1天用VEE-RFRNA 復(fù)制子加上B18RmRNA(3:l比率）共轉(zhuǎn)染（Tfx)(匯合，約4X105個(gè)細(xì)胞）并且如所示的 用嘌呤霉素處理直到第7天（或第10天）。細(xì)胞在B18R-CM中培養(yǎng)直到在第25-30天分離 iPS細(xì)胞集落。（B)VEE-OKS-iMRNA產(chǎn)生用堿性磷酸酶染色的iPS細(xì)胞集落，但VEE-0MKS 1?嫩不產(chǎn)生。（〇如所示的從第1、4、7、10天轉(zhuǎn)染方案，從耵或冊(cè)？所產(chǎn)生的1?3細(xì)胞集落 的堿性磷酸酶染色。（D)如所示的來(lái)自BJ或HFF成纖維細(xì)胞的VEE-OKS-iMRNA第26天和 VEE-OKS-iGRNA第22天的iPS細(xì)胞集落的典型圖像。條，100ym。（E)如所示的產(chǎn)生分離 的iPS細(xì)胞克隆中多能ES標(biāo)志物基因的免疫組化染色。從26個(gè)其他iPS細(xì)胞克?。偣?30個(gè)克?。┇@得的相似的結(jié)果。條，100ym;插圖，10倍放大率。
[0024] 圖3A-E顯示了VEE-RFRNAiPS細(xì)胞克隆的特征。⑷如所示的通過(guò)qRT-RCR分 析BJ和HFF的VEE-OKS-iMiPS克隆的ES標(biāo)志物基因的表達(dá)。（B)NANOG和0CT4啟動(dòng)子 區(qū)域的DNA甲基化分析。實(shí)心圓，甲基化的；空心圓，去甲基化的。頂部數(shù)字指示相對(duì)于轉(zhuǎn) 錄起始位點(diǎn)的CpG數(shù)字。（C)與帶有所示多能性NANOG、0CT4、S0X2的親代人BJ成纖維細(xì) 胞和人HUES9胚胎干細(xì)胞比較BJ-0KS-iM#2和BJ-0KS-iG#5的全基因組mRNA序列資料散 點(diǎn)圖分析。（D)全基因組RNA序列分析的非監(jiān)督式分層系統(tǒng)樹(shù)圖顯示了與BJ成纖維細(xì)胞 比較，四個(gè)獨(dú)立的帶有HUES9的iPS細(xì)胞克隆的聚集。（E)裸鼠中BJ-0KS-iM#21克隆的畸 胎瘤形成。AE1/AE3(細(xì)胞角蛋白）、NF-1(神經(jīng)元細(xì)胞）和GFAP(神經(jīng)元細(xì)胞）用作外胚 層的標(biāo)志物；肌間線(xiàn)蛋白（肌肉細(xì)胞）用作中胚層的標(biāo)志物；以及AFP(原始的和定形內(nèi)胚 層）用作內(nèi)胚層的標(biāo)志物。條，100um。
[0025] 圖4顯示了用于檢查RNA復(fù)制子的存在的RT-PCR分析。OKS-iM-RNA復(fù)制子的質(zhì)粒 ?〇?敏感性的測(cè)量。用100、10和1€8質(zhì)粒（上圖）進(jìn)行1^?2、118?4和0(^4-了24-1(1^4(01() 區(qū)域的PCR。HFF-OKS-iMiPSC克隆的RT-PCR。+;陽(yáng)性對(duì)照，在OKS-iM-RNA復(fù)制子的轉(zhuǎn)染 后一天制備總RNA。陰性對(duì)照，從模擬的轉(zhuǎn)染HFF制備總RNA。從第8代制備來(lái)自iPS細(xì) 胞克隆的總RNA(下圖）。
[0026] 圖5顯示了iPS細(xì)胞克隆的核型分析。在每一克隆20個(gè)G顯帶分裂中期細(xì)胞進(jìn) 行HFF-0KS-iM-l、BJ-0KS-iM-2、BJ-0KS-iM-21 和BJ-OKS-iG-5 克隆的G顯帶核型分析并且 在所有克隆中判斷為正常的男性核型（細(xì)胞系GENETICS)。
[0027] 圖6A-B顯示了用ST0飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)iPS細(xì)胞克隆。收集細(xì)胞，然后肌內(nèi)地或皮 下地注射到裸鼠的后肢肌肉或背側(cè)。在注射5-8周后，切開(kāi)腫瘤并且用4%多聚甲醛固定。 (A)裸鼠中HFF-〇KS-iM#l克隆的畸胎瘤分析。AE1/AE3(細(xì)胞角蛋白）和NF-1 (神經(jīng)元細(xì) 胞）用作外胚層的標(biāo)志物；肌間線(xiàn)蛋白（肌肉細(xì)胞）用作中胚層的標(biāo)志物；以及AFP(原始 的和定形內(nèi)胚層）用作內(nèi)胚層的標(biāo)志物。條，lOOum。（B)來(lái)自BJ-OKS-iG克隆3和5的畸 胎瘤的H&E染色。條，lOOym。
[0028] 圖7A-D顯示（A)B18R條件培養(yǎng)基對(duì)VEERNA復(fù)制子的持久存在有用。頂部：GFP 陽(yáng)性細(xì)胞的％，底部：GFP陽(yáng)性群中GFP熒光的平均值。（B)細(xì)胞的圖片。條，200ym。（C) 如所示的在第10天RF的蛋白表達(dá)。（D)B18R-CM是飼養(yǎng)培養(yǎng)中iPS細(xì)胞產(chǎn)生所必需的。如 所示的用〇KS-iMRNA和B18RmRNA共轉(zhuǎn)染HFF，然后在B18R-CM和嘌呤霉素存在的情況下 培養(yǎng)細(xì)胞。在第10天（第1、3、8天轉(zhuǎn)染）或第11天（第1、4、7、10天轉(zhuǎn)染）將細(xì)胞傳代 至ST0飼養(yǎng)細(xì)胞，在B18R-CM加上/減去嘌呤霉素存在或不存在的情況下培養(yǎng)細(xì)胞。
[0029] 發(fā)明詳述
[0030] 如本文和所附的權(quán)利要求中所用的，單數(shù)形式"一（a)"、"一個(gè)（an)"和"所述 (the) "包括復(fù)數(shù)指示物，除非上下文另有明確地規(guī)定。因此，例如提及"一細(xì)胞"包括許多 此類(lèi)細(xì)胞和提及"一試劑"包括提及本領(lǐng)域中那些技術(shù)人員已知的一個(gè)或多個(gè)試劑等。
[0031] 而且，"或"意指"和/或"除非另有說(shuō)明。相似地，"包含（comprise)"，包含 (comprises) "、"包含（comprising) "、"包括（include) "、"包括（includes)" 和"包括 (including)"為可互換的并且不以此為限。
[0032] 還應(yīng)理解的是其中各自實(shí)施方案的描述使用術(shù)語(yǔ)"包含"，本領(lǐng)域中那些技術(shù)人員 應(yīng)理解在一些具體實(shí)例中，可選地使用語(yǔ)言"基本上由……組成"或"由……組成"描述實(shí)施 方案。
[0033] 盡管與本文所述的那些相似的方法和材料或等同物可以用于實(shí)施所公開(kāi)的方法 和組合物，本文描述了示例性方法、裝置和材料。
[0034] 除非另有定義，本文所用的所有科技和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本公開(kāi)內(nèi)容所屬的領(lǐng)域 中普通技術(shù)人員通常理解的相同的意義。因此，如貫穿本申請(qǐng)中所用的，下列術(shù)語(yǔ)將具有下 列的意義。
[0035] 雖然誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）實(shí)際上在分子水平和功能水平上與ES細(xì)胞相 同，存在將它們的治療潛能轉(zhuǎn)化成醫(yī)學(xué)應(yīng)用的關(guān)鍵障礙。問(wèn)題之一為因?yàn)槟壳癷PS細(xì)胞的 重編程和繁殖的標(biāo)準(zhǔn)方案包括不適用于潛在的臨床目的的動(dòng)物衍生的材料，需要研發(fā)產(chǎn)生 和擴(kuò)增hiPS細(xì)胞的完全確定的方法。
[0036] 日本京都大學(xué)ShinyaYamanaka小組描述了誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPS)。Yamanaka 鑒定了在胚胎干細(xì)胞中特別活躍的基因并且將逆轉(zhuǎn)錄病毒用于用精選的那些基因轉(zhuǎn)染 小鼠成纖維細(xì)胞。最后，分離了四個(gè)對(duì)多能干細(xì)胞產(chǎn)生至關(guān)重要的關(guān)鍵的多能性基因： 0ct-3/4、S0X2、c-Myc和Klf4。通過(guò)Fbxl5+細(xì)胞的抗生素選擇分離細(xì)胞。相同的小組與其 他兩個(gè)來(lái)自哈佛，MIT和洛杉磯加利福尼亞大學(xué)的獨(dú)立的研宄小組一起發(fā)表了研宄，表明將 小鼠成纖維細(xì)胞成功的重編程到iPS并且甚至產(chǎn)生了可存活的嵌合體。
[0037] 通過(guò)四個(gè)重編程的因子（RF;也稱(chēng)為去分化因子）的逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達(dá)產(chǎn)生人iPS 細(xì)胞開(kāi)啟了基于患者特異的個(gè)人化干細(xì)胞的再生醫(yī)學(xué)治療的潛能。然而，逆轉(zhuǎn)錄病毒的插 入致突變潛能連同休眠的RF基因特別是c-MYC活化的潛能，幾乎消除了基于整合的DNA的 方法用于再生醫(yī)學(xué)治療。已研發(fā)了其他基于DNA的iPS方法，使用附加型載體，腺病毒，整合 的和離體的piggyBac轉(zhuǎn)位子或敲除的慢病毒；然而，這些方法或受iPS細(xì)胞產(chǎn)生的低效率 之苦或需要留下插入的DNA元件標(biāo)簽的基因組刪除策略。使用仙臺(tái)病毒或mRNA轉(zhuǎn)染的基于RNA的iPS細(xì)胞方法避免了與基于DNA的方法有關(guān)的潛在的整合問(wèn)題并且為內(nèi)在地更安全 的用于臨床應(yīng)用的方法。盡管仙臺(tái)病毒提供了相當(dāng)有效的iPS方法，與在iPS細(xì)胞克隆中 持久的仙臺(tái)病毒復(fù)制有關(guān)的問(wèn)題需要陰性選擇步驟，接著是幾個(gè)來(lái)自單細(xì)胞水平的再克隆 步驟以分離無(wú)病毒的iPS細(xì)胞，此類(lèi)過(guò)程導(dǎo)致了過(guò)度的iPS細(xì)胞分裂和傳代。更有希望的 非基于DNA的方法之一涉及四個(gè)單獨(dú)的RFmRNA(加上GFPmRNA)在16天里每天轉(zhuǎn)染。不 幸地，這種方法仍然是有問(wèn)題的。例如，進(jìn)行用相應(yīng)的轉(zhuǎn)染的mRNA取代KLF4和c-MYC逆轉(zhuǎn) 錄病毒的試驗(yàn)并且驗(yàn)證結(jié)果；然而不能用轉(zhuǎn)染的mRNA取代0CT4和S0X2逆轉(zhuǎn)錄病毒。這問(wèn) 題看來(lái)起源于RFmRNA的快速降解以及隨著時(shí)間不一致的細(xì)胞-細(xì)胞閾值表達(dá)水平變異， 其源自在重編程期間嘗試每天轉(zhuǎn)染四個(gè)獨(dú)立的mRNA到相同的細(xì)胞，持續(xù)大于14天。因此， 仍然存在著對(duì)產(chǎn)生人iPS細(xì)胞簡(jiǎn)單的、高度可再生的、非基于DNA的方法的重要的需求。
[0038] 本公開(kāi)文本提供了用于產(chǎn)生來(lái)自體細(xì)胞（例如成纖維細(xì)胞）的iPS細(xì)胞的方法和 組合物。組合物和方法包括衍生自甲病毒的復(fù)制子的使用。復(fù)制子包含復(fù)制所必需的編碼 非結(jié)構(gòu)性甲病毒蛋白的RNA序列和1、2、3、4個(gè)或更多的與甲病毒異源的編碼序列，其誘導(dǎo) 體細(xì)胞到干細(xì)胞表型的去分化。
[0039] 如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"甲病毒"具有它在本領(lǐng)域中常規(guī)的意義，并且包括各種物種， 諸如委內(nèi)瑞拉馬腦炎（VEE)病毒、東方馬腦炎（EEE)病毒、埃弗格賴(lài)德病毒（EVE)、穆坎博 病毒（MUC)、皮春納病毒（PIX)和西方馬腦炎病毒，所有這些都是甲病毒的VEE/EEE組的成 員。其他甲病毒包括，例如塞姆利基森林病毒（SFV)、辛德畢斯病毒、羅斯河病毒、基孔肯雅 病毒、S.A.AR86、巴馬森林病毒、米德?tīng)柋げ《?、阿尼昂尼昂病毒、蓋他病毒、覽山病毒、貝巴 魯病毒、馬雅羅病毒、烏納病毒、奧拉病毒、瓦塔羅阿病毒、巴班肯病毒、Kyz病毒、高地J病 毒、摩根堡病毒、恩杜姆病毒和博吉河病毒。在本文所述的構(gòu)建體和方法中特別有用的甲病 毒為VEE/EEE組甲病毒。
[0040] 術(shù)語(yǔ)"甲病毒RNA復(fù)制子"、"甲病毒復(fù)制子RNA"、"甲病毒RNA載體復(fù)制子"和"載 體復(fù)制子RNA"可互換地使用，指的是表達(dá)非結(jié)構(gòu)性蛋白基因的RNA分子從而使得它可以引 導(dǎo)它自己的復(fù)制（擴(kuò)增）并且在最低限度上包含5'和3'甲病毒復(fù)制識(shí)別序列，甲病毒非結(jié) 構(gòu)性蛋白的編碼序列，和多聚腺苷酸尾。它可額外地包含一個(gè)或多個(gè)指導(dǎo)異源性RNA序列 的表達(dá)，即轉(zhuǎn)錄和翻譯，的元件（例如IRES序列、核心或迷你啟動(dòng)子等）。在一實(shí)施方案中， 本公開(kāi)文本的甲病毒復(fù)制子可以包含5'和3'甲病毒復(fù)制識(shí)別序列、甲病毒非結(jié)構(gòu)性蛋白 的編碼序列、多聚腺苷酸尾和一個(gè)或多個(gè)選自SOX-2、c-Myc、OCT-3/4、Klf、Glisl和Nanog 的編碼序列。
[0041] 術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"、"核酸"或"重組的核酸"指的是諸如脫氧核糖核酸ONA)，并且 在適當(dāng)?shù)那闆r下（特別是關(guān)于復(fù)制子），核糖核酸（RNA)的多核苷酸。
[0042] 關(guān)于基因或多核苷酸的術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"指的是基因或多核苷酸的轉(zhuǎn)錄，并且視情況而 定，mRNA轉(zhuǎn)錄本到蛋白或多肽的翻譯。因此，如從上下文中清楚的是，蛋白或多肽的表達(dá)由 開(kāi)放閱讀框的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯引起。
[0043] 本領(lǐng)域中那些技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到的是，由于基因密碼的簡(jiǎn)并性質(zhì)，各種各樣在它 們的核苷酸序列中不同的密碼子可以用于編碼給定的氨基酸。只不過(guò)引用本文所述的特別 的多核苷酸或編碼多肽的基因序列來(lái)例證本公開(kāi)文本的實(shí)施方案，并且本公開(kāi)文本包括編 碼包含與本公開(kāi)文本的方法中利用的酶的蛋白和多肽相同的多肽氨基酸序列的任何序列 的多核苷酸。同樣，多肽通?？梢匀淌芤粋€(gè)或多個(gè)在它的氨基酸序列中的氨基酸取代，刪除 和插入而沒(méi)有缺失或顯著的缺失期望的活性。本公開(kāi)文本包括此類(lèi)具有可選的氨基酸序列 的多肽，本文所示的通過(guò)RNA或DNA序列所編碼的氨基酸序列只不過(guò)例證本公開(kāi)文本的實(shí) 施方案。
[0044] 本公開(kāi)文本提供了重組的DNA表達(dá)載體、RNA復(fù)制子或質(zhì)粒形式的多核苷酸，如在 本文他處更詳述的編碼一個(gè)或多個(gè)多肽。
[0045] 使用cDNA、mRNA或可選地基因組DNA作為模板和適當(dāng)?shù)墓押塑账嵋?，根?jù)標(biāo)準(zhǔn) 的PCR擴(kuò)增技術(shù)和以下實(shí)施例部分中所述的那些程序可以擴(kuò)增本公開(kāi)文本的多核苷酸。由 此擴(kuò)增的核酸可以克隆到適當(dāng)?shù)妮d體并且通過(guò)序列分析表征。而且，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的合成技術(shù)， 例如使用自動(dòng)化DNA合成儀可以制備對(duì)應(yīng)于核苷酸序列的寡核苷酸。
[0046] 在一實(shí)施方案中，本公開(kāi)文本的復(fù)制子包含從大約位置1至大約位置7561與SEQ IDN0:29、30、31或32有90%、95%、98%、99%或100%同一的序列（包括其中序列的， "T" 被"U" 取代），接著是一個(gè)或多個(gè)選自O(shè)ct-3/4、Sox-2、Klf4、c-Myc、Nanog和Glisl的 RF。當(dāng)存在多個(gè)RF時(shí)，編碼序列可被內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES)或諸如SP1小的（例如 核心）啟動(dòng)子所分隔。對(duì)本公開(kāi)文本而言RF的順序并不是關(guān)鍵的；因此順序可為Klf4、 Oct-3/4、Sox_2、c_Myc或可為Sox_2、Klf4、Oct-3/4、c_Myc或 0ct4、Klf4、Sox2、c_Myc或 RF順序的任何變化。復(fù)制子還包含選擇性標(biāo)記物（例如抗生素抗性標(biāo)記物）。在其他實(shí)施 方案中，RF的編碼序列可被諸如T2A和/或E2A自切割的肽分隔。在其他實(shí)施方案中，復(fù) 制子從5'到3'包含：(VEERNA復(fù)制酶）-(26S啟動(dòng)子）-0^)-(自切割肽）-(RF2)-(自切 割肽）_ (RF3) - (IRES或核心啟動(dòng)子）-(RF4) - (IRES或任選的啟動(dòng)子）-(任選的選擇性標(biāo)記 物）-(VEE3'UTR和聚腺苷酸尾）；其中RFg為誘導(dǎo)體細(xì)胞去分化為多能細(xì)胞的因子，其中 RF2_3為任選的，RF3_4為任選的，或RF4為任選的；其中RF^選自0ct-4、Klf4、Sox-2、c-Myc、 Nanog和Glisl。在一實(shí)施方案中，上文的復(fù)制子為RNA分子。在另一實(shí)施方案中，復(fù)制子 衍生于VEE并且包括減少致病性的突變。在一實(shí)施方案中，VEE為T(mén)C-83株（疫苗株）-帶 有一個(gè)點(diǎn)突變（nsP2P773-S突變）的基于RNA的復(fù)制子，其減少了復(fù)制子的細(xì)胞病變效應(yīng)。
[0047] 在上文的任何實(shí)施方案中，RF包括變體和簡(jiǎn)并的多核苷酸序列。例如，RF可以包 含0CT-4多肽、KLF4多肽、S0X-2多肽、c-MYC多肽、NANOG多肽或GLIS1的同源物和變體。 例如，在本文所述的任何復(fù)制子實(shí)施方案中有用的NANOGRF編碼序列可以包含（i)編碼 SEQIDN0:2多肽的多核苷酸；（ii)包含與SEQIDN0:1至少95%同一性并且編碼具有 NANOG活性的多肽的多核苷酸；（iii)具有如前所述的SEQIDNO: 1的多核苷酸或（iv)編 碼含有1-10個(gè)保守的氨基酸取代并且其中多肽具有Nanog活性的SEQIDNO: 2多肽的多 核苷酸；其中任何上文所述的核酸序列可以具有被"U"取代的"T"。例如，在本文所述的任 何復(fù)制子實(shí)施方案中有用的〇ct-4RF編碼序列可以包含（i)編碼SEQIDN0:4多肽的多核 苷酸；（ii)包含與SEQIDNO: 3至少95%同一性并且其編碼具有Oct-4活性的多肽的多核 苷酸；（iii)具有如前所述的SEQIDNO:3的多核苷酸或（iv)編碼含有1-10個(gè)保守的氨 基酸取代并且其中多肽具有〇ct-4活性的SEQIDNO:4多肽的多核苷酸；其中任何上文所 述的核酸序列可以具有被"U"取代的"T"。例如，在本文所述的任何復(fù)制子實(shí)施方案中有用 的Sox-2RF編碼序列可以包含（i)編碼SEQIDN0:6多肽的多核苷酸；（ii)包含與SEQID NO: 5至少95%同一性并且其編碼具有S0X-2活性的多肽的多核苷酸；（iii)具有如前所述 的SEQIDNO: 5的多核苷酸或（iv)編碼含有1-10個(gè)保守的氨基酸取代并且其中多肽具有 S0X-2活性的SEQIDN0:6多肽的多核苷酸；其中任何上文所述的核酸序列可以具有被"U" 取代的"T"。例如，在本文所述的任何復(fù)制子實(shí)施方案中有用的KLF4RF編碼序列可以包含 (i)編碼SEQIDN0:8多肽的多核苷酸；（ii)包含與SEQIDN0:7至少95%同一性并且其 編碼具有KLF4活性的多肽的多核苷酸；（iii)具有如前所述的SEQIDNO: 7的多核苷酸或 (iv)編碼含有1-10個(gè)保守的氨基酸取代并且其中多肽具有KLF4活性的SEQIDN0:8多肽 的多核苷酸；其中任何上文所述的核酸序列可以具有被"U"取代的"T"。例如，在本文所述 的任何復(fù)制子實(shí)施方案中有用的〇-1^0 1^編碼序列可以包含（1)編碼5￡0 10勵(lì):10多肽 的多核苷酸；（ii)包含與SEQIDN0:9至少95%同一性并且其編碼具有c-MYC活性的多肽 的多核苷酸；（iii)具有如前所述的SEQIDNO: 7的多核苷酸或（iv)編碼含有1-10個(gè)保 守的氨基酸取代并且其中多肽具有c-MYC活性的SEQIDN0:10多肽的多核苷酸；其中任何 上文所述的核酸序列可以具有被"U"取代的"T"。例如，在本文所述的任何復(fù)制子實(shí)施方 案中有用的GLIS1RF編碼序列可以包含（i)編碼SEQIDN0:34多肽的多核苷酸；（ii)包 含與SEQIDN0:33至少95%同一性并且其編碼具有GLIS1活性的多肽的多核苷酸；（iii) 具有如前所述的SEQIDNO:33的多核苷酸或（iv)編碼含有1-10個(gè)保守的氨基酸取代并 且其中多肽具有GLIS1活性的SEQIDN0:34多肽的多核苷酸；其中任何上文所述的核酸序 列可以具有被"U"取代的"T"。
[0048] Nanog為在胚胎干細(xì)胞（ESC)中表達(dá)的基因并且在維持多能性方面發(fā)揮重要作 用。Nanog被認(rèn)為是與S0X2 -起行使功能。編碼Nanog的多核苷酸和多肽分別示于SEQID N0:1和2中。而且，SEQIDN0:1包含被"T"可以被"U"取代的DNA序列。人NANOG蛋白 (例如見(jiàn)通過(guò)引用并入本文的檢索號(hào)NP_079141)為帶有位于細(xì)胞的核部分的同源域基序 的305個(gè)氨基酸蛋白。與小鼠的NANOG相似，人NANOG的N末端區(qū)域富含Ser、Thr和Pro 殘基并且C末端包含Trp重復(fù)序列。人NANOG中的同源域范圍在大約95個(gè)殘基-大約155 個(gè)殘基。已知人Nanog的同源物。
[0049] "Oct多肽"指的是轉(zhuǎn)錄因子的八聚物家族的任何天然存在的成員，或與最相關(guān)的 天然存在的家族成員相比維持相似的轉(zhuǎn)錄因子活性（在至少50%、80%或90%活性?xún)?nèi)）的 變體，或包含至少天然存在的家族成員的DNA結(jié)合域的多肽，還可以包含轉(zhuǎn)錄激活域。示 例性O(shè)ct多狀包括Oct_l、0ct_2、0ct_3/4、0ct_6、0ct_7、0ct_8、0ct_9 和Oct_l1。例如 0ct3/4(本文稱(chēng)作"0ct4"）包含POU域，在Pit-1、Oct-1、Oct-2和uric-86之間保守的 150 個(gè)氨基酸序列。見(jiàn)Ryan,A.K. &Rosenfeld,M.G.GenesDev. 11，1207-1225 (1997)。在一 些實(shí)施方案中，變體在它們的全序列與天然存在的Oct多肽家族成員，諸如以上所列的或 諸如基因庫(kù)登錄號(hào)NP002692. 2 (人0ct4)或NP038661. 1 (小鼠0ct4)中所列的那些序列比 較具有至少85%，90%或95%氨基酸序列同一性。Oct多肽（例如0ct3/4)可以來(lái)源于 人、小鼠、大鼠、牛、豬或其他動(dòng)物。通常，相同的蛋白種類(lèi)可與基因改造的細(xì)胞種類(lèi)一起使 用。0ct-4(八聚物-4)為P0U家族的同源域轉(zhuǎn)錄因子并且調(diào)節(jié)許多基因的表達(dá)（例如見(jiàn) J.Biol.Chem.，Vol. 282,Issue29, 21551-21560, 2007 年 7 月 20 日，通過(guò)引用并入本文）。 編碼0ct4的多核苷酸和多肽分別示于SEQIDN0:3和4中。而且，SEQIDN0:3包含被"T" 可以被"U"取代的DNA序列。人Oct-4的同源物為已知的，示于下列的檢索號(hào)NP_038661. 1 和NM_013633. 1 (小家鼠）、NP_001009178 和NM_001009178(褐家鼠）、以及NP_571187 和NM_131112 (斑馬魚(yú)），通過(guò)引用將這些并入本文。
[0050] SPY(性別決定區(qū)Y)-盒2,又名SOX2,為在未分化的胚胎干細(xì)胞的自我更新、Fgf4 的反式激活以及調(diào)控DNA彎曲度中發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄因子（例如見(jiàn)Scaffidietal.J.Biol. Chem.，Vol. 276,Issue50, 47296-47302, 2001 年 12 月 14 日，通過(guò)引用并入本文）。"Sox 多肽"指的是SRY有關(guān)的HMG-盒（Sox)轉(zhuǎn)錄因子的任何天然存在的成員，通過(guò)高迀移率 族（HMG)域的存在所表征，或其維持與最相關(guān)的天然存在的家族成員相比相似的轉(zhuǎn)錄因子 活性（在至少50%、80%或90%活性?xún)?nèi)）的變體，或包含至少天然存在的家族成員的DNA 結(jié)合域的多肽，還可以包含轉(zhuǎn)錄激活域。例如見(jiàn)Dang,D.T.，etal.，Int.J.Biochem.Cell Biol. 32:1103-1121 (2000)。示例性Sox多肽包括，例如Soxl、Sox-2、Sox3、Sox4、Sox5、 Sox6、Sox7、Sox8、Sox9、Soxl0、Soxll、Soxl2、Soxl3、Soxl4、Soxl5、Soxl7、Soxl8、Sox-21和 Sox30。Soxl已顯示以如Sox2相似的效率產(chǎn)生iPS細(xì)胞，并且基因Sox3、Soxl5和Soxl8也顯 不了產(chǎn)生iPS細(xì)胞，盡管比Sox2 的效率稍低。見(jiàn)Nakagawa，etal.，NatureBiotechnology 26:101-106(2007)。在一些實(shí)施方案中，變體在它們的全序列與天然存在的Sox多肽家族 成員，諸如以上所列的或諸如基因庫(kù)登錄號(hào)CAA83435(人Sox2)中所列的那些比較具有至 少85%，90 %或95 %氨基酸序列同一性。Sox多肽（例如Soxl、Sox2、Sox3、Soxl5或Soxl8) 可以來(lái)源于人、小鼠、大鼠、牛、豬或其他動(dòng)物。通常，相同的蛋白種類(lèi)可與基因改造的細(xì)胞 種類(lèi)一起使用。編碼Sox2的多核苷酸和多肽分別示于SEQIDN0:5和6中。而且，SEQID N0:5包含被"T"可以被"U"取代的DNA序列。人Sox2的同源物為已知的。
[0051] Kruppel樣因子4,又名KLF4,在干細(xì)胞維持和生長(zhǎng)中發(fā)揮作用。"Klf多肽"指的 是Kruppel樣因子（Klf)家族，含有與果幡胚胎模式調(diào)節(jié)子Kruppel那些相似的氨基酸序 列的鋅指蛋白，的任何天然存在的成員，或維持與最相關(guān)的天然存在的家族成員相比相似 的轉(zhuǎn)錄因子活性（在至少50%、80%或90%活性?xún)?nèi)）的變體，或包含至少天然存在的家族 成員的DNA結(jié)合域的多肽，還可以包含轉(zhuǎn)錄激活域。見(jiàn)Dang,D.T.，Pevsner,J. &Yang,V. W. ,CellBiol. 32, 1103-1121 (2000)。示例性Klf家族成員包括Klfl、Klf2、Klf3、Klf-4、 Klf5、Klf6、Klf7、Klf8、Klf9、Kin〇、Kim、Kin2、Kin3、Kin4、Kin5、Kin6 和Klfl7。 發(fā)現(xiàn)Klf12和Klf14為能夠在小鼠中產(chǎn)生iPS細(xì)胞的因子，并且有關(guān)的基因Klf1和Klf5 也可以，盡管效率減低。見(jiàn)Nakagawa等，NatureBiotechnology26:101-106(2007)。在 一些實(shí)施方案中，變體在它們的全序列與天然存在的Klf多肽家族成員，諸如以上所列的 或諸如基因庫(kù)登錄號(hào)CAX16088(小鼠Klf4)或CAX14962(人Klf4)中所列的那些比較具有 至少85%、90%或95%氨基酸序列同一性。Klf多肽（例如Klfl、Klf4和Klf5)可以來(lái)源 于人、小鼠、大鼠、牛、豬或其他動(dòng)物。通常，相同的蛋白種類(lèi)可與基因改造的細(xì)胞種類(lèi)一起 使用。到了本文所述的Klf多肽的程度，可以用雌激素有關(guān)的受體(Essrb)多肽取代它。 因此，對(duì)本文所述的每一Klf多肽實(shí)施方案而言意圖是，同樣地描述了使用Essrb取代Klf4 多肽的對(duì)應(yīng)的實(shí)施方案。編碼KLF4的多核苷酸和多肽分別示于SEQIDN0:7和8中。而 且，SEQIDN0:7包含被"T"可以被"U"取代的DNA序列。人KLF4的同源物為已知的并且 包括NP_034767、NM_010637 (小家鼠），通過(guò)引用將其并入本文。
[0052] 細(xì)胞基因的MYC家族由c-myc、N_myc和L-myc組成，三個(gè)在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和 凋亡中發(fā)揮功能的基因（HenrikssonandLuscher1996;FacchiniandPenn1998)ZMyc 多肽"指的是Myc家族的任何天然存在的成員（例如見(jiàn)Adhikary,S. &Eilers,M.Nat.Rev.Mol.CellBiol. 6:635-645 (2005))，或其維持與最相關(guān)的天然存在的家族成員相比相似的 轉(zhuǎn)錄因子活性（在至少50%、80%或90%活性?xún)?nèi)）的變體，或包含至少天然存在的家族成 員的DNA結(jié)合域的多肽，還可以包含轉(zhuǎn)錄激活域。示例性Myc多肽包括，例如c-Myc、N_Myc 和L-Myc。在一些實(shí)施方案中，變體在它們的全序列與天然存在的Sox多肽家族成員，諸如 以上所列的或諸如基因庫(kù)登錄號(hào)CAA25015 (人Myc)中所列的那些比較具有至少85%、90% 或95%氨基酸序列同一性。Myc多肽（例如c-Myc)可以來(lái)源于人、小鼠、大鼠、牛、豬或其 他動(dòng)物。通常，相同的蛋白種類(lèi)可與基因改造的細(xì)胞種類(lèi)一起使用。盡管myc家族基因具 有共同的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性。N-Myc為MYC家族的成員并且編碼具有堿性螺旋（bHLH)域蛋 白。c-myc和N-myc的基因組結(jié)構(gòu)為相似地組織的并且包括三個(gè)外顯子。第一外顯子的大 部分和第三外顯子的3'部分包含運(yùn)載轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)序列的非翻譯區(qū)。在細(xì)胞核中發(fā) 現(xiàn)N-myc蛋白并且與另一bHLH蛋白形成二聚物以便結(jié)合DNA。編碼c-Myc的多核苷酸和多 肽分別示于SEQIDN0:9和10中。而且，SEQIDN0:9包含被"T"可以被"U"取代的DNA 序列。蛋白的Myc家族的同源物和變體為本領(lǐng)域中已知的。
[0053] Glisl(Glis家族鋅指1)為編碼相同名稱(chēng)的KrUppel樣蛋白的基因，在染色體 lp32. 3上發(fā)現(xiàn)了它的基因座。在未受精卵和某一細(xì)胞階段的胚胎中富含該基因，并且其可 以用于促進(jìn)直接重編程體細(xì)胞為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。Glisl可以用作重編程體細(xì)胞為誘 導(dǎo)性干細(xì)胞中所用的四個(gè)因子的其中之一。所用的其他三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子為0ct3/4、Sox2和 1(1料。人61丨81(匪_147193)和多肽示于5￡0 10勵(lì):33和34中（分別為〇0嫩和多肽）。
[0054] 使用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)可以克隆和表達(dá)編碼人oct4(pour5fl)、sox2、klf4、 c-myc(n-myc或L-myc)、Glisl和nanog的cDNA，其變體和同源物。使用本文所示的編碼一 個(gè)或多個(gè)去分化因子的多核苷酸序列可以克隆到合適的載體用于在目標(biāo)細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)。
[0055] RF"活性"（例如RF變體活性）指的是當(dāng)與本領(lǐng)域中已知的其他RF組合表達(dá)時(shí) 去分化體細(xì)胞的能力。例如，通過(guò)在體細(xì)胞中與klf4、Sox-2和c-myc共表達(dá)Oct-4變體并 且檢測(cè)體細(xì)胞是否去分化來(lái)測(cè)量Oct-4變體的Oct-4活性。如果細(xì)胞去分化，然后就可以 說(shuō)Oct-4變體具有Oct-4活性。
[0056] 在另一實(shí)施方案中，復(fù)制子包含如SEQIDN0:29、30、31或32中所示的序列。還 在另一實(shí)施方案中，復(fù)制子包含與SEQIDN0:29、30、31或32大約90%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%、99.5%同一的序列，其中當(dāng)復(fù)制子被轉(zhuǎn)染到體細(xì)胞中時(shí)，體細(xì) 胞被"誘導(dǎo)"變?yōu)楦杉?xì)胞。另外，任何SEQID^):29、30、31或32，其中"!'"被""'取代。
[0057] 在一實(shí)施方案中，SEQIDN0:29提供了本公開(kāi)文本的復(fù)制子。在另一實(shí)施方案 中，SEQIDN0:29的序列具有被"U"取代的"T"。復(fù)制子包含核苷酸1至大約核苷酸7561 的VEERNA復(fù)制酶，核苷酸7562-8671的人Oct-4序列，核苷酸8678-8731的T2A自切割 肽的編碼序列，8738-10147的人Klf4序列，核苷酸10154-10213的自切割E2A肽的編碼 序列，10223-11176的人Sox-2序列，11195-11805的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，11818-13140 的人c-Myc序列，13165-13776的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，13777-14376的嘌呤霉素抗性基 因，14383-14510的VEE3'UTR和多聚腺苷酸尾，14679-15539的氨芐青霉素抗性基因和 16320-16337 的SP6 啟動(dòng)子。
[0058] 在一實(shí)施方案中，SEQIDNO: 30提供了本公開(kāi)文本的復(fù)制子。在另一實(shí)施方案中， 5￡〇10勵(lì):30具有被1"取代的"!'"。復(fù)制子包含核苷酸1至大約核苷酸7561的￥￡￡1?隱 復(fù)制酶，核苷酸7592-8671的人Oct-4序列，核苷酸8678-8731的T2A自切割肽的編碼序列， 8738-10147的人Klf4序列，核苷酸10154-10213的自切割E2A肽的編碼序列，10223-11176 的人Sox-2序列，11195-11805的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，11818-13140的人c-Myc序列， 13165-13776的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，13777-14376的嘌呤霉素抗性基因，14383-14510的 VEE3'UTR和多聚腺苷酸尾，14679-15539的氨芐青霉素抗性基因和16319-16336的17啟 動(dòng)子。
[0059] 在一實(shí)施方案中，SEQIDNO: 31提供了本公開(kāi)文本的復(fù)制子。在另一實(shí)施方案中， SEQIDN0:31具有被"U"取代的"T"。復(fù)制子包含核苷酸1至大約核苷酸7561的VEERNA 復(fù)制酶，核苷酸7592-8671的人Oct-4序列，核苷酸8678-8731的T2A自切割肽的編碼序列， 8738-10147的人Klf4序列，核苷酸10154-10213的自切割E2A肽的編碼序列，10223-11176 的人Sox-2序列，11195-11805的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，11818-13680的人Glisl序列， 13689-14300的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，14301-14900的嘌呤霉素抗性基因，14907-15034的 VEE3'UTR和多聚腺苷酸尾，15203-16063的氨芐青霉素抗性基因和16844-16861的SP6啟 動(dòng)子。
[0060] 在一實(shí)施方案中，SEQIDNO: 32提供了本公開(kāi)文本的復(fù)制子。在另一實(shí)施方案中， SEQIDN0:32具有被"U"取代的"T"。復(fù)制子包含核苷酸1至大約核苷酸7561的VEERNA 復(fù)制酶，核苷酸7592-8671的人Oct-4序列，核苷酸8678-8731的T2A自切割肽的編碼序列， 8738-10147的人Klf4序列，核苷酸10154-10213的自切割E2A肽的編碼序列，10223-11176 的人Sox-2序列，11195-11805的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，11818-13680的人Glisl序列， 13689-14300的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，14301-14900的嘌呤霉素抗性基因，14907-15034的 VEE3'UTR和多聚腺苷酸尾，15203-16063的氨芐青霉素抗性基因和16843-16860的17啟 動(dòng)子。
[0061] 在另一實(shí)施方案中，可使用多個(gè)甲病毒復(fù)制子，每一復(fù)制子包含一個(gè)或多個(gè)誘導(dǎo) 體細(xì)胞變?yōu)楦杉?xì)胞的因子的編碼序列，其中多個(gè)甲病毒復(fù)制子的組合包括所有用于誘導(dǎo)去 分化到干細(xì)胞所必需的所有RF的編碼序列。
[0062] 在更為具體的實(shí)施方案中，甲病毒復(fù)制子包含用于OCT-3/4、SOX-2、KLF、c-MYC、 GLIS1和/或NAN0G表達(dá)的編碼序列。在具體的實(shí)施方案中，甲病毒復(fù)制子包含用于0CT-4、 KLF4、S0X-2、GLIS1 和c-MYC的編碼序列。
[0063] 復(fù)制子也可被基因改造為表達(dá)甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白。美國(guó)專(zhuān)利7, 045, 335、7, 078, 218、 7, 425, 337和7, 442, 381號(hào)描述了許多此類(lèi)甲病毒RNA復(fù)制子的構(gòu)建體，其由5'和3'甲病 毒復(fù)制識(shí)別序列、甲病毒非結(jié)構(gòu)性蛋白的編碼序列和多聚腺苷酸尾組成，并且通過(guò)引用將 此類(lèi)構(gòu)建體并入本文。甲病毒RNA復(fù)制子的具體實(shí)施方案可包含一個(gè)或多個(gè)減毒突變，減 毒突變?yōu)楹塑账釀h除、添加、或一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、或包含重排或嵌合構(gòu)建的突變， 該突變導(dǎo)致了含有突變的活病毒中毒力相對(duì)于適當(dāng)?shù)囊吧图撞《居袚p失。
[0064] 術(shù)語(yǔ)"一個(gè)或多個(gè)甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白"指的是一個(gè)甲病毒所編碼的結(jié)構(gòu)蛋白或甲病 毒所編碼的結(jié)構(gòu)蛋白的組合。通過(guò)病毒產(chǎn)生的這些蛋白如多聚蛋白并且在文獻(xiàn)中通常表示 為C-E3-E2-6k-El。E3和6k用作兩個(gè)糖蛋白E2和E1的膜易位/轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)。因此，本文術(shù) 語(yǔ)E1的使用可以指的是E1、E3-El、6k-El或E3-6k-El，本文術(shù)語(yǔ)E2的使用可以指的是E2、 E3-E2、6k-E2或E3-6k-E2。減毒突變可以引入到任何一個(gè)或多個(gè)甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白。
[0065] 另外，如以上所提及的，用于產(chǎn)生代謝物有用的酶的同源物包含在本文所提供的 微生物和方法中。第一家族或物種的初始酶或基因所用的術(shù)語(yǔ)"同源物"指的是第二家族或 物種的不同的酶和基因，通過(guò)功能的、結(jié)構(gòu)的或基因組的分析確定對(duì)應(yīng)于第一家族或物種 的初始酶或基因的第二家族或物種的酶或基因。通常來(lái)說(shuō)，同源物具有功能的、結(jié)構(gòu)的或基 因組的相似性。通過(guò)已知的技術(shù)使用基因探針和PCR可以容易地克隆酶或基因的同源物。 使用功能測(cè)定和/或通過(guò)基因的基因組作圖可以確定如同源物的克隆序列的同一性。
[0066] 如果編碼蛋白的核酸序列具有與編碼第二蛋白的核酸序列相似的序列，則蛋白與 第二蛋白具有"同源性"或?yàn)?同源的"?？蛇x地，如果兩個(gè)蛋白具有"相似的"氨基酸序列， 則蛋白具有與第二蛋白的同源性。（因此，術(shù)語(yǔ)"同源蛋白"定義為兩個(gè)蛋白具有相似的氨 基酸序列）。
[0067] 如本文所用的，當(dāng)氨基酸序列具有至少大約30%、40%、50%、60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性時(shí)，兩 個(gè)蛋白（或蛋白的區(qū)域）是基本上同源的。為檢測(cè)兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸序列的百分 比同一性，出于最佳比對(duì)的目的比對(duì)序列（例如可以將缺口引入到第一和第二氨基酸或核 酸序列的一個(gè)或兩個(gè)用于最佳比對(duì)并且出于比較的目的可以忽視非同源性序列）。在一實(shí) 施方案中，比對(duì)用于比較目的的參考序列的長(zhǎng)度為至少30%、通常至少40%、更通常至少 50 %、甚至更通常至少60 %、并且甚至更通常至少70 %、80 %、90 %、100 %的參考序列的長(zhǎng) 度。然后比較在對(duì)應(yīng)的氨基酸位置或核苷酸位置處氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄形?置如第二序列中對(duì)應(yīng)的位置被相同的氨基酸殘基或核苷酸所占據(jù)，然后分子在那個(gè)位置是 相同的（如本文所用的氨基酸或核酸"同一性"等同于氨基酸或核酸"同源性"）。兩個(gè)序 列之間百分比同一性為序列所共用的相同的位置數(shù)目的函數(shù)，考慮到缺口的數(shù)目，每一缺 口的長(zhǎng)度，其需要引入用于兩個(gè)序列的最佳比對(duì)。
[0068] 當(dāng)所用的蛋白或肽"同源的"時(shí)，應(yīng)認(rèn)識(shí)到的是不同的殘基位置通常相差保守的氨 基酸取代。"保守的氨基酸取代"為其中氨基酸殘基被另一具有側(cè)鏈（R基）和相似的化學(xué) 特性（例如電荷或疏水性）氨基酸殘基所取代的那個(gè)。通常，保守的氨基酸取代基本上不 會(huì)改變蛋白的功能特性。在兩個(gè)或多個(gè)氨基酸序列彼此不同于保守的取代的情況下，可向 上調(diào)整百分比序列同一性或同源性的程度以校正取代的保守性。進(jìn)行這種調(diào)整的方法為本 領(lǐng)域中那些技術(shù)人員熟知的（例如見(jiàn)Pearsonetal.，1994,在此通過(guò)引用將其并入）。
[0069] "保守的氨基酸取代"為其中用一具有相似的側(cè)鏈的氨基酸殘基取代氨基酸殘基。 本領(lǐng)域中已定義了具有相似的側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括帶有堿性側(cè)鏈（例 如賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸）、酸性側(cè)鏈（例如天冬氨酸、谷氨酸）、無(wú)電荷極性側(cè)鏈（例如甘 氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、非極性側(cè)鏈（例如丙氨酸、纈氨酸、亮 氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、分支側(cè)鏈（例如蘇氨酸、纈氨 酸、異亮氨酸）和芳族側(cè)鏈（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸）的氨基酸。下列六組 每一組包含彼此保守取代的氨基酸：1)絲氨酸（S)、蘇氨酸（T) ;2)天冬氨酸（D)、谷氨酸 (E) ;3)天冬酰胺（N)、谷氨酰胺（Q) ;4)精氨酸（R)、賴(lài)氨酸（K) ;5)異亮氨酸（I)、亮氨酸 (L)、甲硫氨酸（M)、丙氨酸（A)、纈氨酸（V);和6)苯丙氨酸（F)、酪氨酸（Y)、色氨酸（W)。
[0070] 通常使用序列分析軟件測(cè)量多肽的序列同源性，其也可稱(chēng)為百分比序列同一性。 例如見(jiàn)遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組（GCG)的序列分析軟件包，威斯康星大學(xué)生物技術(shù)中心，910大學(xué) 路，麥迪遜，Wis。53705。使用分配給各種取代、刪除和其他修飾，包括保守的氨基酸取代的 同源性測(cè)量蛋白分析軟件匹配相似的序列。例如，GCG包含諸如"Gap"和"Bestfit"的程 序，其可以使用缺省參數(shù)以檢測(cè)密切相關(guān)的多肽之間序列同源性或序列同一性，諸如來(lái)自 不同有機(jī)體物種的同源多肽或野生型蛋白與其突變蛋白之間同源多肽。例如見(jiàn)GCG6. 1版 本。
[0071] 所用的比較分子序列與包含來(lái)自不同有機(jī)體的大量序列的數(shù)據(jù)庫(kù)典型的算 法為計(jì)算機(jī)程序BLAST(Altschul, 1990 ;Gish, 1993 ;Madden, 1996 ;Altschul, 1997 ; Zhang, 1997)，特別是blastp或tblastn(Altschul, 1997)。BLASTp典型的參數(shù)為：期望 值：l〇(缺?。?；濾波器：段（缺?。豢瘴淮蜷_(kāi)罰分：11(缺?。豢瘴谎由炝P分：1(缺?。?； 最大的比對(duì)：1〇〇(缺?。?；字長(zhǎng)：11(缺?。?；描述數(shù)：1〇〇(缺省）；罰分矩陣：BLOWSUM62。
[0072] 當(dāng)搜素包含來(lái)自大量不同有機(jī)體的序列的數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)，通常比較氨基酸序列。通 過(guò)本領(lǐng)域中已知的算法而不是blastp可以測(cè)量使用氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)搜索。例如，使用 FASTA，GCG6. 1版本中的程序可以比較多肽序列。FASTA提供了查詢(xún)和搜索序列之間最佳 重疊的區(qū)域的比對(duì)和百分比序列同一性（Pearson，1990,在此通過(guò)引用將其并入）。例如， 使用FASTA，其缺省參數(shù)（字長(zhǎng)2,得分矩陣PAM250)，如GCG6. 1版本中所提供的可以檢測(cè) 氨基酸序列之間百分比序列同一性，在此通過(guò)引用將其并入。
[0073] 如本文所用的，本公開(kāi)文本的組合物和方法提供了去分化體細(xì)胞形成干細(xì)胞的能 力（例如誘導(dǎo)干細(xì)胞的形成）。干細(xì)胞為能夠分化為其他細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞，其包括具有特別 的、特異的功能的那些（例如組織特異性細(xì)胞、實(shí)質(zhì)細(xì)胞和其祖細(xì)胞）。有各種種類(lèi)的干細(xì) 胞，其可以以他們分化為期望的細(xì)胞/組織類(lèi)型的能力表征。例如，"祖細(xì)胞"為專(zhuān)能干細(xì)胞 或多能干細(xì)胞。祖細(xì)胞為可以產(chǎn)生不同終末分化的細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞，能夠產(chǎn)生各種祖細(xì)胞 的細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)"多能的"或"多能性"指的是具有產(chǎn)生后代細(xì)胞能力的細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)臈l件下 可以經(jīng)歷分化為細(xì)胞類(lèi)型，其共同地展示了與來(lái)自所有三個(gè)胚層（內(nèi)胚層、中胚層和外胚 層）細(xì)胞系有關(guān)的特征。多能干細(xì)胞可以有助于產(chǎn)前的、出生后的或成年動(dòng)物的所有胚胎 源性組織。標(biāo)準(zhǔn)的本領(lǐng)域公認(rèn)的測(cè)試，諸如在8-12周齡SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力，可 以用于建立細(xì)胞群的多能性；然而各種多能干細(xì)胞特征的鑒定也可用于檢測(cè)多能細(xì)胞。"多 能干細(xì)胞特征"指的是從其他細(xì)胞中區(qū)別多能干細(xì)胞的細(xì)胞的特征。在適當(dāng)條件下可以經(jīng) 歷分化為共同地展示了與來(lái)自所有三個(gè)胚層（內(nèi)胚層、中胚層和外胚層）細(xì)胞系有關(guān)的特 征的細(xì)胞類(lèi)型的產(chǎn)生后代的能力為多能干細(xì)胞特征。分子標(biāo)志物的某些組合的表達(dá)或非表 達(dá)也為多能干細(xì)胞特征。例如，人多能干細(xì)胞表達(dá)至少一些，并且在一些實(shí)施方案中，所有 來(lái)自下列非限制列表的標(biāo)志物：SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、ALP、 Sox2、E-鈣黏蛋白、UTF-l、0ct4、ReXl和Nanog。與多能干細(xì)胞有關(guān)的細(xì)胞形態(tài)也是多能干 細(xì)胞的特征。相比之下，與多能干細(xì)胞比較，多能干細(xì)胞能夠分化為細(xì)胞子集。例如，多能 干細(xì)胞能夠經(jīng)歷分化為三個(gè)胚層的一個(gè)或兩個(gè)。如本文所用的，"非多能細(xì)胞"指的是不是 多能細(xì)胞的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。此類(lèi)細(xì)胞的實(shí)例包括分化細(xì)胞及專(zhuān)能細(xì)胞。分化細(xì)胞的實(shí)例包 括但不限于來(lái)自骨髓、皮膚、骨骼肌、脂肪組織和外周血組織的細(xì)胞。示例性細(xì)胞類(lèi)型包括 但不限于成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、成肌細(xì)胞、神經(jīng)元、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和T細(xì)胞。
[0074] 甚至比多能干細(xì)胞更原始的（即定向的特別分化命運(yùn)）另一細(xì)胞種類(lèi)為所謂的 "全能的"干細(xì)胞（例如已受精的卵母細(xì)胞，處于發(fā)育的兩個(gè)和四個(gè)細(xì)胞階段胚胎細(xì)胞），其 具有分化為任何特定物種的細(xì)胞類(lèi)型的能力。例如，單一的全能干細(xì)胞可產(chǎn)生完整的動(dòng)物 及特定物種（例如人）中發(fā)現(xiàn)的無(wú)數(shù)細(xì)胞類(lèi)型的任何。
[0075] 多能干細(xì)胞為經(jīng)歷自我更新同時(shí)維持產(chǎn)生所有三個(gè)胚層源性組織和生殖細(xì)胞系 的能力的細(xì)胞類(lèi)型。盡管源自人囊胚的多能人胚胎干細(xì)胞（hES)細(xì)胞為有希望的基于細(xì)胞 治療來(lái)治療諸如帕金森疾病、心肌梗塞、脊髓損傷、糖尿病的疾病和病癥的來(lái)源，它們的臨 床潛能受限于它們的免疫原性和倫理關(guān)懷。
[0076] 術(shù)語(yǔ)"前體細(xì)胞"、"祖細(xì)胞"和"干細(xì)胞"在本領(lǐng)域中可互換地使用，并且在本文中 指的是多能的或譜系定向祖細(xì)胞，其潛在地能夠無(wú)限量的有絲分裂以更新它的細(xì)胞系或產(chǎn) 生后代細(xì)胞，其將分化為成纖維細(xì)胞或能夠自我更新并且能夠分化為實(shí)質(zhì)細(xì)胞類(lèi)型的譜系 定向祖細(xì)胞和它的后代。不同于多能干細(xì)胞，通常認(rèn)為譜系定向祖細(xì)胞能夠產(chǎn)生許多彼此 表型不同的細(xì)胞類(lèi)型。反而，它們產(chǎn)生一種或可能兩種譜系定向的細(xì)胞類(lèi)型。
[0077] 本公開(kāi)文本顯示了使用異位的mRNA表達(dá)系統(tǒng)（例如復(fù)制子系統(tǒng)）可以誘導(dǎo)終 末分化的人細(xì)胞（例如人皮膚成纖維細(xì)胞）去分化。本公開(kāi)文本考慮了各種去分化（也 稱(chēng)為重編程的因子（RF))編碼序列的使用，例如包含編碼KLF4、0CT4、SOX2、c-MYC或 n-MYC(L-Myc)、GLIS1、NAN0G或其任何組合（例如KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC(L-Myc) 和任選地NANOG)的多核苷酸。通過(guò)體內(nèi)或體外將細(xì)胞與一個(gè)或多個(gè)自我復(fù)制的RNA載體 接觸完成去分化，所述載體保持對(duì)宿主細(xì)胞基因組異位的并且編碼誘導(dǎo)去分化的因子。在 各種實(shí)施方案中，通過(guò)在B18R存在的情況下培養(yǎng)自我復(fù)制的RNA轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以控制 本公開(kāi)文本異位的自我復(fù)制的RNA載體。用于促進(jìn)去分化的方法提供了促進(jìn)被損傷或疾病 所損害的哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織的再生的方法。本公開(kāi)文本也提供了用于富集誘導(dǎo)性干細(xì)胞 和包含此類(lèi)豐富干細(xì)胞的細(xì)胞群的方法。
[0078] 患者特異性多能干細(xì)胞的產(chǎn)生具有急劇加速干細(xì)胞實(shí)現(xiàn)臨床用途從而治療退行 性疾病的潛能。本公開(kāi)文本提供了應(yīng)用來(lái)自患者的易于捐獻(xiàn)的基質(zhì)細(xì)胞諸如皮膚成纖維細(xì) 胞并且通過(guò)一套包含編碼（i)KLF4、0CT4、S0X2、c-MYC或n-MYC(L-Myc)、NAN0G或其任何組 合；（ii)KLF4、0CT4、S0X2 和GLIS1 ;以及（iii)KLF4、0CT4、S0X2 和NANOG的RNA去分化因 子的異位表達(dá)產(chǎn)生人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（hiPS或iPS)的方法。產(chǎn)生的細(xì)胞系在生理學(xué)和 形態(tài)學(xué)上與人胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)所產(chǎn)生的人胚胎干細(xì)胞（HESC)沒(méi)有區(qū)別。hiPS細(xì)胞與兩個(gè) 已建立的HESC細(xì)胞系分享了幾乎同一的基因表達(dá)譜。
[0079] 術(shù)語(yǔ)"去分化"為本相關(guān)領(lǐng)域中技術(shù)人員所熟悉。通常去分化表示譜系定向細(xì)胞 退化為干細(xì)胞的狀態(tài)，例如通過(guò)"誘導(dǎo)"去分化的表型。例如如本文進(jìn)一步地所述的，KLF4、 0CT4、S0X2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、GLIS1和/或Nanog可以誘導(dǎo)譜系定向有絲分裂抑制 的細(xì)胞中有絲分裂的去分化和誘導(dǎo)。
[0080] 在一實(shí)施方案中，本公開(kāi)文本提供了包含已用本公開(kāi)文本的復(fù)制子轉(zhuǎn)化的人體細(xì) 胞的細(xì)胞培養(yǎng)。在一實(shí)施方案中，體細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，體細(xì)胞為角質(zhì) 細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，復(fù)制子包含與SEQIDN0:29、30、31或32從大約位置1-大約 位置7561有90%、95%、98%、99%或100%同一的序列（包括其中序列的"1'"被1"取 代），接著是一個(gè)或多個(gè)選自0ct-3/4、Sox-2、Klf4、c-Myc、Nanog和Glisl的RF，再接著是 VEE3'UTR和聚腺苷酸尾。其中當(dāng)存在多個(gè)RF時(shí)，編碼序列可被內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES) 或?。ɡ绾诵模﹩?dòng)子諸如SP1所分隔。對(duì)本公開(kāi)文本而言RF的順序并不是關(guān)鍵的； 因此順序可為Klf4、Oct-3/4、Sox_2、c_Myc或可為Sox_2、Klf4、Oct-3/4、c_Myc或 0ct4、 Klf4、Sox2、c-Myc或RF順序的任何變化。在一實(shí)施方案中，復(fù)制子包含與SEQIDN0:29、 30、31或32所示的序列至少大約95%、98%、99%或100%同一的序列。還在另一實(shí)施方案 中，細(xì)胞培養(yǎng)在包含B18R的條件培養(yǎng)基中和/或與編碼B18R的多核苷酸共轉(zhuǎn)化。
[0081] 本公開(kāi)文本也提供了制備來(lái)自于包含已用本公開(kāi)文本的復(fù)制子轉(zhuǎn)化的人體細(xì)胞 的干細(xì)胞、在促進(jìn)復(fù)制子中編碼序列表達(dá)的條件下培養(yǎng)體細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞足夠的時(shí)間段以 便去分化細(xì)胞為干細(xì)胞的方法。在一實(shí)施方案中，細(xì)胞傳代至少5、10、15、20或更多次。在 另一實(shí)施方案中，培養(yǎng)細(xì)胞至少10、20、30或更多天。還在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)在包 含B18R的條件培養(yǎng)基中和/或與編碼B18R的多核苷酸共轉(zhuǎn)化。
[0082] 本公開(kāi)文本也提供了通過(guò)本文所述的方法誘導(dǎo)性干細(xì)胞培養(yǎng)。在一實(shí)施方案中， 干細(xì)胞不包含細(xì)胞的基因組DNA中任何異源性RF因子。在另一實(shí)施方案中，干細(xì)胞不包含 任何逆轉(zhuǎn)錄病毒的DNA或RNA(例如無(wú)逆轉(zhuǎn)錄病毒的DNA或RNA的干細(xì)胞）。
[0083] 在一實(shí)施方案中，本公開(kāi)文本提供了單獨(dú)地或群體地分離的誘導(dǎo)性干細(xì)胞。當(dāng)提 及本公開(kāi)文本的干細(xì)胞時(shí)術(shù)語(yǔ)"分離的"或"純化的"意指基本上沒(méi)有攜帶與譜系專(zhuān)有有關(guān) 標(biāo)志物的細(xì)胞的細(xì)胞。在特別的實(shí)施方案中，人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞為至少30%、35 %、40 %、 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%沒(méi)有此類(lèi)污染的細(xì) 胞類(lèi)型。在另一實(shí)施方案中，分離的干細(xì)胞也基本上無(wú)可溶的天然存在的分子。如下文更 完全談?wù)摰?，例如可以通過(guò)從培養(yǎng)源提取（例如經(jīng)由密度梯度離心和/或流式細(xì)胞術(shù)）獲 得本公開(kāi)文本基本上純化的干細(xì)胞。可以通過(guò)任何適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)量純度。例如可以通過(guò)流 式細(xì)胞術(shù)（例如FACS分析）純化本公開(kāi)文本的干細(xì)胞，如本文所述的。此類(lèi)純化的iPS細(xì) 胞沒(méi)有任何逆轉(zhuǎn)錄病毒的DNA或RNA。
[0084] 在一實(shí)施方案中，本公開(kāi)文本提供了誘導(dǎo)性干細(xì)胞的富集群。"誘導(dǎo)性干細(xì)胞的富 集群"為其中本公開(kāi)文本的誘導(dǎo)性干細(xì)胞與其他細(xì)胞類(lèi)型部分地分離從而使得由此得到的 細(xì)胞群具有比初始的細(xì)胞群更高的誘導(dǎo)性干細(xì)胞的濃度。誘導(dǎo)性干細(xì)胞的富集群可以具 有比分離之前初始細(xì)胞群高大約10倍、100倍、500倍、1，000倍、2, 000倍、3, 000倍、4, 000 倍、5, 000倍、6, 000倍、7, 000倍、8, 000倍、9, 000倍、10, 000倍或更高的濃度的誘導(dǎo)性干 細(xì)胞。例如本公開(kāi)文本誘導(dǎo)性干細(xì)胞由至少5%、10%、15%、20%、35%、30%、35%、40%、 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99% 或更多的干細(xì)胞富集 群組成。例如通過(guò)選擇抗與分化細(xì)胞有關(guān)的細(xì)胞顯示標(biāo)志物、或其他不期望的細(xì)胞類(lèi)型、和 /或選擇與本公開(kāi)文本的人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞有關(guān)的細(xì)胞顯示標(biāo)志物（例如TRA-1-81和/ 或TRA-1-60)，和/或通過(guò)在特定的培養(yǎng)系統(tǒng)中再生分離的干細(xì)胞可獲得誘導(dǎo)性干細(xì)胞的 富集群?？蛇x地，或除標(biāo)志物表達(dá)富集之外，標(biāo)志物表達(dá)的缺失也可用作富集。此類(lèi)富集的 iPS細(xì)胞將沒(méi)有任何逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA或DNA通常用于轉(zhuǎn)化帶有RF的細(xì)胞。
[0085] 在另一實(shí)施方案中，本公開(kāi)文本提供了誘導(dǎo)性干細(xì)胞的細(xì)胞系。如本文所用的， "細(xì)胞系"意指本公開(kāi)文本的干細(xì)胞培養(yǎng)或在延長(zhǎng)的時(shí)間段優(yōu)選無(wú)限期地可以再生的其后 代細(xì)胞，并且術(shù)語(yǔ)包括例如，培養(yǎng)、低溫貯藏和再培養(yǎng)接下來(lái)低溫貯藏的細(xì)胞。如本文所用 的"培養(yǎng)"意指生長(zhǎng)在培養(yǎng)基中并且任選地相應(yīng)地傳代的誘導(dǎo)性干細(xì)胞群。干細(xì)胞培養(yǎng)可 為原代培養(yǎng)（例如沒(méi)有傳代的培養(yǎng)）或?yàn)槔^代或隨后的培養(yǎng)（例如再培養(yǎng)或傳代一次或多 次的細(xì)胞群）。
[0086] 在一實(shí)施方案中，本公開(kāi)文本提供了去分化為干細(xì)胞（例如誘導(dǎo)性干細(xì)胞）的細(xì) 胞，所述干細(xì)胞包含包括自我更新的能力和分化為中胚層、內(nèi)胚層和外胚層特征，其中通過(guò) 使用復(fù)制RNA載體一個(gè)或多個(gè)RF異位表達(dá)到宿主細(xì)胞基因組可以產(chǎn)生去分化的細(xì)胞。在 一實(shí)施方案中，復(fù)制子載體衍生于甲病毒（例如委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒）。
[0087] 本公開(kāi)文本的人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的治療用途包括移植人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞、干 細(xì)胞群或其后代細(xì)胞到個(gè)體以治療包括癌癥、腫瘤、損傷、病毒感染、糖尿病等造成的疾病 和病癥的各種病理狀態(tài)。干細(xì)胞或干細(xì)胞群（包括基因改造的干細(xì)胞）被引入到需要此類(lèi) 干細(xì)胞或后代細(xì)胞或需要KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NAN0G、GLIS1或任何 其編碼的或基因改造的細(xì)胞所產(chǎn)生的蛋白或分子組合的個(gè)體中。例如，在一實(shí)施方案中，人 誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞可以給藥于經(jīng)受已殺死、減少或損害了個(gè)體的干細(xì)胞或其他細(xì)胞的化療 的癌癥患者，其中誘導(dǎo)性干細(xì)胞取代損害的或死亡的細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，可以用至少 一種額外的治療因子（除了去分化因子之外）轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。例如，一 旦通過(guò)本公開(kāi)文本的方法分離或獲得本公開(kāi)文本人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，就可用編碼治療多 肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化干細(xì)胞。此類(lèi)方法和組合物可以提供用于期望的多肽產(chǎn)生的干細(xì)胞生物 反應(yīng)器或可用作基因遞送或基因治療。在這一實(shí)施方案中，可用編碼治療多肽的多核苷酸 分離、轉(zhuǎn)化iPS細(xì)胞然后植入或給藥于個(gè)體，或可分化為期望的細(xì)胞類(lèi)型并且植入和遞送 到個(gè)體。在此類(lèi)條件下多核苷酸表達(dá)在用于遞送多肽產(chǎn)物的個(gè)體中。
[0088] 如果人細(xì)胞與受體相比是異源的（非自體同源的/同種異體的），通常進(jìn)行伴隨 免疫抑制治療，例如免疫抑制劑環(huán)孢霉素或FK506的給藥。然而，由于本公開(kāi)文本的人誘 導(dǎo)性多能干細(xì)胞的不成熟的狀態(tài)，可不需要此類(lèi)免疫抑制治療。因此，在一實(shí)施方案中，不 存在免疫調(diào)節(jié)（例如免疫抑制）治療時(shí)本公開(kāi)文本的人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞可以給藥于受 體?？蛇x地，細(xì)胞可被膜密封，其允許流體交換但是阻止細(xì)胞/細(xì)胞接觸。微膠囊化細(xì)胞 的移植為本領(lǐng)域中已知的，例如Balladur等，1995,Surgery117:189-94, 1995 ;和Dixit 等，1992,CellTransplantation1:275-79。
[0089] 可直接地將細(xì)胞引入到外周血或存放在遍及全身的其他位置中，例如期望的組織 或腹膜中的微載體珠。例如，單程序中可以移植1〇 2個(gè)至10 9個(gè)細(xì)胞，并且可以如所需的進(jìn) 行額外的移植。
[0090] 可以體外誘導(dǎo)人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的分化或譜系定向（有絲分裂抑制的）細(xì)胞的 去分化，或可選地通過(guò)體內(nèi)組織接觸誘導(dǎo)（例如通過(guò)與成纖維細(xì)胞或細(xì)胞基質(zhì)成分接觸）。 任選地，分化劑或去分化劑（例如KLF4、0CT4、S0X2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NAN0G、GLIS1 或其任何組合或其激動(dòng)劑）可共給藥于或隨后給藥于個(gè)體。
[0091] 以如已顯不了 0膜島細(xì)胞的移植為糖尿病患者提供了治療（Shapiro等，2000)。 本公開(kāi)文本的人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞提供了可選的胰島細(xì)胞來(lái)源用以預(yù)防或治療糖尿病。例 如，本公開(kāi)文本的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞可以產(chǎn)生、分離和分化為胰腺細(xì)胞類(lèi)型并且遞送到個(gè) 體?？蛇x地，誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞可以被遞送到個(gè)體的胰腺并且在體內(nèi)分化為胰島細(xì)胞。因 此，細(xì)胞對(duì)移植以便預(yù)防或治療糖尿病的發(fā)生有用。
[0092] 本公開(kāi)文本考慮本文所述的體外方法可以對(duì)去分化的或再分化的細(xì)胞（例如從 相同的個(gè)體收獲細(xì)胞并且返回到相同的個(gè)體）。本公開(kāi)文本還考慮本文所述的體外方法可 對(duì)非自體移植有用。在一實(shí)施方案中，移植發(fā)生在基因相關(guān)的供體和受體之間。在另一實(shí) 施方案中，移植發(fā)生在基因不相關(guān)的供體和受體之間。在任何以上的實(shí)施方案中，本公開(kāi)文 本考慮可以在培養(yǎng)中擴(kuò)展去分化的細(xì)胞并且儲(chǔ)存用于以后的檢索和使用。相似地，本公開(kāi) 文本考慮可以在培養(yǎng)中擴(kuò)展再分化的細(xì)胞并且儲(chǔ)存用于以后的檢索和使用。
[0093] 本公開(kāi)文本的組合物和方法可應(yīng)用于其中分化的（譜系定向的）細(xì)胞從個(gè)體移 除，培養(yǎng)中去分化，然后再引入到個(gè)體或雖然仍在培養(yǎng)中，基因改造用以沿著特異的分化途 徑再分化（例如胰細(xì)胞、神經(jīng)元、干細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、心血管細(xì)胞、胃腸細(xì)胞等）的程序。然 后可以將此類(lèi)再分化的細(xì)胞引入到個(gè)體。例如，可以移除分化的成纖維細(xì)胞，去分化（例如 用本公開(kāi)文本包含KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、GLIS1、NAN0G或其任何組合 的復(fù)制子的異位表達(dá)）并且有絲分裂地?cái)U(kuò)展然后再分化（例如用KLF4、0CT4、SOX2、c-MYC 或n-MYC或L-MYC、NAN0G、GLIS1的拮抗劑或其任何組合）或已知的因子（包括物理刺激） 用以沿著譜系定向的途徑引起hESCs的分化。在一實(shí)施方案中，方法包括從受傷的或生病 的個(gè)體移除分化的細(xì)胞。來(lái)自從受傷個(gè)體收獲的細(xì)胞的去分化的細(xì)胞稍后可以返回到受傷 的或生病的個(gè)體用以治療傷口或退行性疾病。去分化的細(xì)胞可以再引入到受傷處，或細(xì)胞 可以再引入到遠(yuǎn)離受傷處的位點(diǎn)。相似地，可以從受傷的個(gè)體收獲細(xì)胞，體外去分化，體外 再分化，并且移植回到個(gè)體用以治療傷口或退行性疾病。
[0094] 本公開(kāi)文本的人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞可以從獲自哺乳動(dòng)物個(gè)體的樣品分離。個(gè)體可 以為任何哺乳動(dòng)物（例如牛、綿羊、豬、犬科、貓科動(dòng)物、馬、靈長(zhǎng)類(lèi)），包括人。細(xì)胞樣品可獲 自任何數(shù)目的不同來(lái)源，包括，例如骨髓、胎兒組織（例如胎兒肝組織）、外周血、臍帶血、胰 腺等。
[0095] 在另一實(shí)施方案中，本公開(kāi)文本提供了建立和/或維持干細(xì)胞群或其后代細(xì)胞及 包含干細(xì)胞和后代細(xì)胞混合的細(xì)胞群，和所產(chǎn)生的細(xì)胞群的方法。就本公開(kāi)文本的人誘導(dǎo) 性多能干細(xì)胞而言，一旦建立了細(xì)胞培養(yǎng)或干細(xì)胞的混合培養(yǎng)，就通過(guò)在誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的 條件下傳代到新鮮的培養(yǎng)基體外有絲分裂地?cái)U(kuò)增細(xì)胞群，如細(xì)胞密度指示，伴有或不伴有 組織形成。此類(lèi)培養(yǎng)方法可以包括在缺乏特別的誘導(dǎo)分化的生長(zhǎng)因子（例如IGF、EGF、FGF、 VEGF和/或其他生長(zhǎng)因子）的培養(yǎng)基中使細(xì)胞傳代，在KLF4、0CT4、SOX2、c-MYC或n-MYC 或L-MYC、NANOG、GLIS1或其任何組合的起刺激作用的制劑（例如激動(dòng)劑）存在的情況下， 在KLF4、0CT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NANOG、Glisl或其任何組合，或以上的任何 組合存在的情況下。包含成纖維細(xì)胞或成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的培養(yǎng)和包含干細(xì)胞和成纖維細(xì) 胞的混合的培養(yǎng)都可以轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基當(dāng)達(dá)到足夠的細(xì)胞密度時(shí)。一些干細(xì)胞類(lèi)型不 顯示典型的接觸抑制-凋亡或它們變成靜止的當(dāng)密度為最大限度時(shí)。因此，適當(dāng)?shù)膫鞔?術(shù)可以用于減少接觸抑制和靜止。因此，在一實(shí)施方案中，例如將細(xì)胞的一部分轉(zhuǎn)移到具有 新鮮培養(yǎng)基的新的培養(yǎng)皿。此類(lèi)移除或轉(zhuǎn)移可以在任何培養(yǎng)皿中完成。
[0096] -旦在培養(yǎng)中建立了本公開(kāi)文本的人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，如以上所述的，它們就 可以維持或儲(chǔ)存在細(xì)胞"庫(kù)"中，其包含需要定期的轉(zhuǎn)移的體外連續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)或已被低溫 貯藏的細(xì)胞。
[0097] 根據(jù)已知的方法進(jìn)行本公開(kāi)文本的干細(xì)胞或其他細(xì)胞的低溫貯藏，諸 如Doyle等，（eds.)，1995,Cell&TissueCulture:LaboratoryProcedures,John Wiley&Sons,Chichester中描述的那些。例如，但不限制于，細(xì)胞可懸浮在"凍結(jié)培養(yǎng)基" 中，諸如，例如培養(yǎng)基還包含15-20%胎牛血清（FBS)和10%二甲亞砜（DNSO)，有或沒(méi)有 5-10%甘油，例如大約4-10X106個(gè)細(xì)胞/ml的密度。細(xì)胞可分配在玻璃瓶或塑料瓶中，然 后將其密封并且轉(zhuǎn)移到可編程的或被動(dòng)式冰箱的冷凍室?？山?jīng)驗(yàn)主義地檢測(cè)最佳的冷凍速 率。例如，可使用通過(guò)溶解熱產(chǎn)生_1°C/min溫度改變的冷凍程序。一旦包含細(xì)胞的小瓶到 達(dá)-80°C，就將它們轉(zhuǎn)移到液氮存儲(chǔ)區(qū)。低溫貯藏的細(xì)胞可以存儲(chǔ)年多的時(shí)間，盡管應(yīng)至少 每5年檢查它們以保持活力。
[0098] 本公開(kāi)文本的低溫貯藏的細(xì)胞組成細(xì)胞庫(kù)，根據(jù)需要其部分可以通過(guò)融化取出然 后用于產(chǎn)生包含干細(xì)胞的干細(xì)胞培養(yǎng)。例如通常通過(guò)將小瓶從液氮轉(zhuǎn)移到37°C水浴快速進(jìn) 行融化。在無(wú)菌的條件下應(yīng)即刻轉(zhuǎn)移小瓶的融化內(nèi)容物到包含適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基的培養(yǎng)皿。明 智的是培養(yǎng)基中的細(xì)胞可以調(diào)整為大約1-3X105個(gè)細(xì)胞/ml的初始密度。一旦開(kāi)始培養(yǎng)， 就每天檢查細(xì)胞，例如，用倒置顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞增殖，并且只要他們達(dá)到/適當(dāng)?shù)拿芏染驮?培養(yǎng)。
[0099] 根據(jù)需要本公開(kāi)文本的人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞可從細(xì)胞庫(kù)中取出，并且用作體外新 的干細(xì)胞的產(chǎn)生，例如作為三維組織培養(yǎng)，如下文所述的，例如體內(nèi)通過(guò)直接地將細(xì)胞給予 到需要新的成纖維細(xì)胞或組織之處的位點(diǎn)。如本文所述的，本公開(kāi)文本的人誘導(dǎo)性多能干 細(xì)胞可用于產(chǎn)生個(gè)體中使用的新的組織，其中最初從個(gè)體自己的血液或其他組織（即自體 細(xì)胞）分離細(xì)胞。可選地，本公開(kāi)文本的細(xì)胞可用作普遍存在的的供體細(xì)胞用以產(chǎn)生新的 組織供任何個(gè)體中使用（即異源性細(xì)胞）。
[0100] 一旦建立，干細(xì)胞的培養(yǎng)就可以用于產(chǎn)生能夠產(chǎn)生新的組織后代細(xì)胞和/或成 纖維細(xì)胞。可以通過(guò)特異的外源性生長(zhǎng)因子或通過(guò)改變干細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)條件（例如密 度）觸發(fā)干細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞或其他細(xì)胞類(lèi)型，隨后由此組織的產(chǎn)生。因?yàn)榧?xì)胞為多 能的，它們可以用于重組已輻照的個(gè)體和/或化療治療的個(gè)體；或作為特定譜系的細(xì)胞來(lái) 源，通過(guò)為它們的成熟、增殖和分化提供一個(gè)或多個(gè)選擇的譜系?？梢杂糜谡T導(dǎo)分化的因子 的實(shí)例包括紅細(xì)胞生成素，集落刺激因子，例如GM-CSF、G-CSF或M-CSF、白細(xì)胞介素，例如 幾-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8等，白血病抑制因子仏正），青灰因子（5七1)等，與組織定向 的細(xì)胞或其他譜系定向的細(xì)胞類(lèi)型共培養(yǎng)，從而誘導(dǎo)干細(xì)胞變成定向的特定譜系。
[0101] 在另一實(shí)施方案中，人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞為基因改造的用以表達(dá)針對(duì)特異的生長(zhǎng) 因子類(lèi)型的基因用于成功的和/或改進(jìn)分化為成纖維細(xì)胞、其他基質(zhì)細(xì)胞或?qū)嵸|(zhì)細(xì)胞和/ 或可翻轉(zhuǎn)的移植前或移植后。
[0102] 本公開(kāi)文本的細(xì)胞可用于治療需要由疾病或創(chuàng)傷造成的組織的修復(fù)或置換的個(gè) 體。治療需要使用本公開(kāi)文本的細(xì)胞用于產(chǎn)生新的組織，使用因此產(chǎn)生的組織，根據(jù)本領(lǐng)域 中目前已知的或在未來(lái)研發(fā)的任何方法。例如，本公開(kāi)文本的誘導(dǎo)性細(xì)胞（例如包含表達(dá) KLF4、0CT4、S0X2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NANOG、Glisl或其任何組合的異位表達(dá)載體的 細(xì)胞）可為植入的，注射的或相反直接地給藥到組織損害部位從而使得它們可在體內(nèi)產(chǎn)生 新組織。在一實(shí)施方案中，給藥包括基因改造的干細(xì)胞的給藥。
[0103] 在一實(shí)施方案中，制備用于直接注射到期望新組織產(chǎn)生之處的位點(diǎn)的包含本公開(kāi) 文本的細(xì)胞的制劑。例如，非限制性的，本公開(kāi)文本的細(xì)胞可懸浮在用于注射的水凝膠溶液 中?？蛇x地，例如可允許包含細(xì)胞的水凝膠溶液在模具中變硬從而形成具有移植之前細(xì)胞 分散在其中的基質(zhì)。一旦基質(zhì)變硬，可培養(yǎng)細(xì)胞形成從而使得在移植前有絲分裂地?cái)U(kuò)增細(xì) 胞。水凝膠為經(jīng)由共價(jià)鍵、離子鍵或氫鍵交聯(lián)的有機(jī)聚合物（天然的或合成的）從而創(chuàng)建 其中使水分子陷入以便形成凝膠的三維的晶格結(jié)構(gòu)。可以用于形成水凝膠的材料實(shí)例包括 多糖諸如褐藻酸鹽及其鹽，聚膦嗪，和離子鍵地、聚氧化乙烯-聚丙二醇嵌段共聚物分別通 過(guò)溫度和pH交聯(lián)的聚丙烯酸酯。水凝膠材料的合成方法及制備此類(lèi)水凝膠的方法為本領(lǐng) 域中已知的。
[0104] 此類(lèi)細(xì)胞制劑還可包含一個(gè)或多個(gè)其他組分，包括選擇的細(xì)胞外基質(zhì)組分，諸如 一種或多種本領(lǐng)域中已知的膠原類(lèi)型，和/或生長(zhǎng)因子和藥物?？捎行У?fù)饺氲郊?xì)胞制劑 中的生長(zhǎng)因子包括一個(gè)或多個(gè)本領(lǐng)域中已知的組織生長(zhǎng)因子，諸如但不限于TGF-0家族 的任何成員、IGF-I和-II、生長(zhǎng)激素，諸如BMP-13的BMPs等?？蛇x地，可基因改造本公開(kāi) 文本的細(xì)胞用以表達(dá)和產(chǎn)生諸如BMP-13或TGF-0的生長(zhǎng)因子。也可包括在制劑中的其他 組分包括，例如緩沖液用以提供適當(dāng)?shù)膒H和等滲性，潤(rùn)滑劑，用來(lái)保持細(xì)胞在給藥處或靠 近給藥處（例如褐藻酸鹽、瓊脂和植物膠）的粘性材料和可產(chǎn)生給藥處期望的效應(yīng)的其他 細(xì)胞類(lèi)型（例如增強(qiáng)或修飾組織的形成或它的物理化學(xué)特性，支持細(xì)胞存活力或炎癥抑制 或排斥）?？梢酝ㄟ^(guò)適當(dāng)?shù)膫谡谏w物用以防止細(xì)胞離開(kāi)位點(diǎn)覆蓋細(xì)胞。此類(lèi)傷口遮蓋物 為本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的。
[0105] 可選地，本公開(kāi)文本的人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞可接種于三維的框架或支架并且培養(yǎng) 以允許細(xì)胞分化，生長(zhǎng)和填充基質(zhì)或即刻體內(nèi)移植，其中接種的細(xì)胞將在框架的表面上增 殖并且與個(gè)體的細(xì)胞合作形成體內(nèi)置換組織。可以植入與任何一個(gè)或多個(gè)生長(zhǎng)因子，藥物， 額外的細(xì)胞類(lèi)型或刺激形成或相反增強(qiáng)或改善本公開(kāi)文本的實(shí)踐的其他組分組合的此類(lèi) 框架。
[0106] 還在另一實(shí)施方案中，本公開(kāi)文本的人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞與三維的培養(yǎng)系統(tǒng)可以 共同在"生物反應(yīng)器"中使用用來(lái)產(chǎn)生組織構(gòu)建體，其擁有原始的人組織關(guān)鍵的生化的、物 理的和結(jié)構(gòu)特性，通過(guò)培養(yǎng)細(xì)胞并且在環(huán)境條件下產(chǎn)生通常原生組織富有經(jīng)驗(yàn)的組織。生 物反應(yīng)器可包括許多設(shè)計(jì)。通常培養(yǎng)條件包括將生理應(yīng)激置于與包含體內(nèi)遇到的那些相似 的細(xì)胞的構(gòu)建體上。
[0107] 可以在各種應(yīng)用中使用本公開(kāi)文本的人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，它們的后代細(xì)胞和組 織。這些包括但不限于分化型、未分化型、去分化型細(xì)胞的移植或植入。此類(lèi)細(xì)胞和組織用 于修復(fù)、置換或增大由于疾病或創(chuàng)傷損害或不能正常發(fā)育的組織。
[0108] 根據(jù)本公開(kāi)文本所產(chǎn)生的人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞和組織可以用于修復(fù)或置換被損 害的或被破壞的組織或增大現(xiàn)存的組織。
[0109] 另外，例如本公開(kāi)文本的細(xì)胞或組織可以用于體外篩選化合物、過(guò)敏原、生長(zhǎng)因子 /調(diào)節(jié)因子、藥物組合物等對(duì)干細(xì)胞的功效和/或細(xì)胞毒性從而通過(guò)檢測(cè)干細(xì)胞的生物活 性中的變化（例如KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NANOG、Glisl或其任何組合 表達(dá)或活性，增殖力，附著力的變化）闡明某些疾病的機(jī)制，研宄藥物和/或生長(zhǎng)因子通過(guò) 機(jī)制起作用從而調(diào)節(jié)干細(xì)胞生物活性（例如KLF4、0CT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、 NANOG、Glisl或其任何組合表達(dá)或活性），診斷和監(jiān)控患者的癌癥用于基因治療、基因遞送 或蛋白遞送；以及產(chǎn)生生物活性的產(chǎn)物。
[0110] 人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞也可用在分離和評(píng)估與干細(xì)胞分化和成熟有關(guān)的因子。因 此，人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞可用在檢測(cè)諸如條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基的活性的測(cè)定，評(píng)估用于細(xì) 胞生長(zhǎng)活性，涉及特定譜系等奉獻(xiàn)的流體。各種系統(tǒng)為可應(yīng)用的并且可以設(shè)計(jì)用于基于各 種生理應(yīng)激人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)性分化。
[0111] 本公開(kāi)文本的人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞、其后代細(xì)胞和其衍生的組織可體外用于篩選 廣泛多樣的用于藥物制劑、生長(zhǎng)因子/調(diào)節(jié)因子、抗炎癥因子等的有效性和細(xì)胞毒性制劑。 為此，本公開(kāi)文本的細(xì)胞或組織培養(yǎng)可以體外維持和暴露于待被測(cè)試的制劑。可以通過(guò)它 的損害或殺死干細(xì)胞或培養(yǎng)中它們的后代細(xì)胞的能力測(cè)量細(xì)胞毒性劑的活性。通過(guò)染色技 術(shù)可以易于評(píng)估。通過(guò)分析體外活細(xì)胞的數(shù)目，例如總細(xì)胞計(jì)數(shù)和分化細(xì)胞計(jì)數(shù)可以評(píng)估 生長(zhǎng)因子/調(diào)節(jié)因子的效應(yīng)。使用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞學(xué)的和/或組織學(xué)的技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)，包括應(yīng) 用定義類(lèi)型特異的細(xì)胞抗原的抗體的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的使用。在懸浮培養(yǎng)或三維系統(tǒng)中 可以評(píng)估各種藥物對(duì)本公開(kāi)文本的細(xì)胞的影響。在一方面，可以分析測(cè)試劑對(duì)本公開(kāi)文本 的人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的影響。
[0112] 表達(dá)目標(biāo)基因產(chǎn)物或體外由此產(chǎn)生的組織的干細(xì)胞可以植入到否則缺乏那個(gè)基 因產(chǎn)物的個(gè)體中。例如，表達(dá)能夠預(yù)防或改善各種類(lèi)型的血管疾病或病癥的癥狀的產(chǎn)物或 預(yù)防或促進(jìn)炎性疾病的基因?yàn)樘貏e目標(biāo)。在一實(shí)施方案中，基因改造從而表達(dá)抗炎性基因 產(chǎn)物的本公開(kāi)文本的細(xì)胞用于降低植入失敗的風(fēng)險(xiǎn)或減少由于炎癥反應(yīng)組織中進(jìn)一步的 退行性改變。例如，可以基因改造從而表達(dá)一個(gè)或多個(gè)例如包括對(duì)應(yīng)于抗體的個(gè)體基因 型的肽或多肽的抗炎性基因產(chǎn)物的本公開(kāi)文本的干細(xì)胞中和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激 因子（GM-CSF)、TNF、IL-1、IL-2或其他炎性細(xì)胞因子。IL-1已顯示減少蛋白聚糖和II、 IX、和XI型膠原的合成（Tyler等，1985,Biochem.J. 227:69-878;Tyler等，1988，(：〇11. Relat.Res. 82:393-405;Goldring等，1988,J.Clin.Invest. 82:2026-2037 ;和Lefebvre 等，1990,Biophys.Acta. 1052:366-72)。TNF也抑制蛋白聚糖和II型膠原的合成，盡管它比 IL-1 有效性低很多（Yaron,I等，1989,ArthritisRheum. 32:173-80 ;Ikebe,T等，1988,J. Immunol. 140:827-31 ;和Saklatvala,J.，1986,Nature322:547-49)。例如還可基因改造 從而表達(dá)編碼人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白的基因本公開(kāi)文本的細(xì)胞防止移植物被宿主排斥。例如見(jiàn) McCurry等，1995,NatureMedicine1:423-27。在另一實(shí)施方案中，可基因改造從而包括 基因或多核苷酸序列的人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞表達(dá)或引起血管生成因子的表達(dá)。
[0113] 本公開(kāi)文本的誘導(dǎo)性干細(xì)胞表達(dá)一個(gè)或多個(gè)與人多能干細(xì)胞表型有關(guān)的標(biāo)志物 和/或缺少一個(gè)或多個(gè)與分化細(xì)胞（例如具有自我更新、再生或分化能力減少的細(xì)胞）和/ 或神經(jīng)元起源的細(xì)胞有關(guān)的標(biāo)志物。分子為期望的細(xì)胞類(lèi)型的"標(biāo)志物"如果在期望的細(xì)胞 類(lèi)型的足夠高百分比的細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)它或在不期望的細(xì)胞類(lèi)型的足夠低百分比的細(xì)胞上發(fā) 現(xiàn)它。通過(guò)從細(xì)胞群中選擇具有標(biāo)志物的細(xì)胞從包含期望的和不期望的細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞群 中可以使人實(shí)現(xiàn)期望的細(xì)胞類(lèi)型的期望的純化水平。標(biāo)志物可以顯示在，例如30%、35%、 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99% 或更多的期望 的細(xì)胞類(lèi)型上并且可以顯示在少于50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、 5%、1%或更少的不期望的細(xì)胞類(lèi)型上。
[0114] 如以上所討論的，本公開(kāi)文本的誘導(dǎo)性干細(xì)胞或已分化的誘導(dǎo)性干細(xì)胞通過(guò)被分 子特異地識(shí)別某些標(biāo)志物的存在和/或缺乏所表征。因此，在一方面，本公開(kāi)文本提供了標(biāo) 記本公開(kāi)文本的誘導(dǎo)性干細(xì)胞的方法。在一實(shí)施方案中，用特異性識(shí)別與本公開(kāi)文本的誘 導(dǎo)性干細(xì)胞有關(guān)的標(biāo)志物的分子標(biāo)記人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞群與 特異地結(jié)合標(biāo)志物（例如TRA-1-81)的分子在允許分子結(jié)合標(biāo)志物的條件下接觸，其中細(xì) 胞群包含至少一個(gè)具有所述標(biāo)志物的干細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞群與特異地結(jié)合標(biāo) 志物（例如TRA-1-81)的分子在允許分子結(jié)合標(biāo)志物的條件下接觸，其中細(xì)胞群包含沒(méi)有 標(biāo)志物的干細(xì)胞和具有標(biāo)志物的非干細(xì)胞。例如所用的分子可以為抗體，抗體衍生物或配 體。分子任選地可以包含額外的部分，例如可檢測(cè)的（例如熒光的或比色的標(biāo)記）部分或 幫助標(biāo)記細(xì)胞分離的部分（例如其他分子或磁粒所結(jié)合的部分）。
[0115] 在一實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化的體細(xì)胞群經(jīng)歷了腫瘤排斥抗原1-61和1-81 (TRA-1-60、 TRA-1-81)的活體染色。TRA-1-60和TRA-1-81可商購(gòu)獲得，例如購(gòu)自Chemicon國(guó)際有限 公司（Temecula，Calif.，USA)。使用單克隆抗體這些抗原的免疫學(xué)檢測(cè)已用于與其他標(biāo) 志物組合表征多能干細(xì)胞（ShamblottM.J等?（1998)PNAS95:13726-13731;Schuldiner M?等?（2000).PNAS97:11307-11312ThomsonJ.A等?（1998).Science282:1145-1147; ReubinoffB.E等? （2000).NatureBiotechlnology18:399-404;HendersonJ.K 等?（2002).StemCells20:329-337;PeraM?等?（2000).J.CellScience113:5-10)。在 一實(shí)施方案中，已用至少一個(gè)包含KLF4、0CT4、S0X2、c-MYC或n-MYC或L-MYC并且任選地或 可選地NAN0G或Glisl的異位的RNA載體轉(zhuǎn)化的體細(xì)胞群富集包含TRA-1-81或TRA-1-60 表達(dá)的細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞也可富集與逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體有關(guān)的可檢測(cè)的標(biāo)志 物的缺失。
[0116] 在另一方面，本公開(kāi)文本提供了分離本公開(kāi)文本的誘導(dǎo)性干細(xì)胞的方法。例如通 過(guò)利用結(jié)合人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞上的標(biāo)志物（例如TRA-l-81、TRA-l-60或標(biāo)志物的組合） 的分子（例如抗體、抗體衍生物、配體或Fc肽融合分子）因此陽(yáng)性地選擇結(jié)合分子的細(xì)胞 (即陽(yáng)性選擇）可以分離本公開(kāi)文本的人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。陽(yáng)性選擇方法的其他實(shí)例包 括在期望的和不期望的細(xì)胞類(lèi)型的混合群中優(yōu)選地促進(jìn)期望的細(xì)胞類(lèi)型生長(zhǎng)的方法?？蛇x 地，通過(guò)使用結(jié)合不存在于期望的細(xì)胞類(lèi)型但是存在于不期望的細(xì)胞類(lèi)型上的標(biāo)志物的分 子，可以從期望的細(xì)胞中移除包含此類(lèi)標(biāo)志物的不期望的細(xì)胞（即陰性選擇）。其他陰性選 擇方法包括在期望的和不期望的細(xì)胞類(lèi)型的混合群中優(yōu)選地殺死或抑制不期望的細(xì)胞類(lèi) 型的生長(zhǎng)。因此，通過(guò)使用陰性選擇，陽(yáng)性選擇，或其組合，可以制備富集的干細(xì)胞群。
[0117] 分離程序可包括使用抗體包被的磁珠的磁力分離，親和色譜法，連接到單克隆抗 體的細(xì)胞毒素劑，或與單克隆抗體聯(lián)合使用的此類(lèi)制劑，例如補(bǔ)體和細(xì)胞毒素，并且"淘選" 結(jié)合固體基質(zhì)（例如平板）的抗體，或其他便利的技術(shù)。提供精確的分離的技術(shù)包括熒光 激活細(xì)胞分選，其可以具有不同的成熟程度，例如許多色彩通道，低角度和鈍光散射檢測(cè)通 道以及阻抗通道。抗體可便利地與標(biāo)記結(jié)合，諸如磁珠其允許直接的分離，生物素其可與結(jié) 合到載體上的抗生素蛋白或鏈霉親和素一起除去，熒光染料其可以與熒光激活細(xì)胞分選一 起使用，諸如此類(lèi)，從而允許以便于特定的細(xì)胞類(lèi)型的分離?？蓱?yīng)用任何對(duì)人誘導(dǎo)性多能干 細(xì)胞的活力沒(méi)有過(guò)度地毒害的技術(shù)。在一實(shí)施方案中，用抗標(biāo)志物的抗體（例如TRA-1-81 抗體）孵育細(xì)胞，并且人工地選擇標(biāo)志物染色陽(yáng)性的細(xì)胞及再培養(yǎng)。
[0118] 富集方法的組合可用于改進(jìn)純化或富集的時(shí)間或效率。例如，在除去具有不指示 目標(biāo)細(xì)胞類(lèi)型的標(biāo)志物的細(xì)胞的富集步驟后，通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選（FACS)或其他具有 高特異性的方法可進(jìn)一步地分離或富集細(xì)胞。多色分析可與FACS-起應(yīng)用。在針對(duì)特定抗 原或缺乏其染色水平的基礎(chǔ)上分離細(xì)胞。熒光染料可用于標(biāo)記針對(duì)特定抗原特異的抗體。 此類(lèi)熒光染料包括藻膽蛋白，例如藻紅蛋白和別藻藍(lán)蛋白，熒光素，德克薩斯紅等。
[0119] 任何細(xì)胞類(lèi)型特異的標(biāo)志物都可以用于對(duì)特定的細(xì)胞類(lèi)型或抗特定的細(xì)胞類(lèi)型 的選擇。對(duì)富集有用的誘導(dǎo)性干細(xì)胞標(biāo)志物包含表達(dá)的標(biāo)志物諸如TRA-1-81和與逆轉(zhuǎn)錄 病毒載體或其他外源性載體有關(guān)的標(biāo)志物的缺失（例如GFP)。
[0120] 一旦分離了干細(xì)胞，就可以將它們?nèi)芜x地繁殖在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中在飼養(yǎng)層存在或 不存在的情況下。另外，本發(fā)明的人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞可培養(yǎng)在生物反應(yīng)器系統(tǒng)中。
[0121] -旦在培養(yǎng)中建立了本公開(kāi)文本的人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，如上文所述的，它們就 可以維持或儲(chǔ)存在細(xì)胞"庫(kù)"中，其包含需要定期的轉(zhuǎn)移的體外連續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)或已被低溫 貯藏的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，庫(kù)存細(xì)胞對(duì)個(gè)體的自體治療有用。
[0122] 通過(guò)分解用作成纖維細(xì)胞來(lái)源的適當(dāng)?shù)钠鞴倩蚪M織可易于分離成纖維細(xì)胞。使用 本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的技術(shù)可容易地實(shí)現(xiàn)。例如，可以機(jī)械地分解和/或用消化酶和/ 或螯合劑處理組織或器官，所述螯合劑減弱相鄰細(xì)胞間連接使得組織可能分散到個(gè)體細(xì)胞 的懸浮液中而沒(méi)有很大的細(xì)胞破壞。通過(guò)切碎組織并且用任何數(shù)量的消化酶單獨(dú)地或組合 地處理切碎的組織可以實(shí)現(xiàn)酶分解。這些包括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、膠原酶、 彈性蛋白酶和/或透明質(zhì)酸酶、脫氧核糖核酸酶、鏈酶蛋白酶、分散酶等。也可通過(guò)許多方 法包括但不限于略舉數(shù)例螺紋磨床、攪拌器、篩、均質(zhì)器、壓敏元件或絕緣體的使用實(shí)現(xiàn)機(jī) 械破碎。組織分解技術(shù)的綜述見(jiàn)Freshney,CultureofAnimalCells.AManualofBasic Technique，2dEd.，A.R.Liss，Inc.，NewYork，1987,Ch. 9,pp. 107_126〇
[0123] 一旦組織變成單個(gè)細(xì)胞的懸浮液，就可以分餾懸浮液到亞群，從其中可以獲得成 纖維細(xì)胞和/或其他基質(zhì)細(xì)胞和/或成分。也可使用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞分離技術(shù)實(shí)現(xiàn)，所述技術(shù) 包括但不限于特異細(xì)胞類(lèi)型的克隆和選擇，不想要的細(xì)胞的選擇性破壞（陰性選擇），混合 群中基于差別細(xì)胞可凝集性的分離，凍融過(guò)程，混合群中細(xì)胞的差別粘附特性，過(guò)濾，常規(guī) 的和區(qū)帶離心，離心淘選（逆流離心），單元重力分離，逆流分配，電泳和熒光激活細(xì)胞分 選?？寺∵x擇和細(xì)胞分離技術(shù)的綜述見(jiàn)Freshney,CultureofAnimalCells.AManualof BasicTechniques, 2dEd. ,A.R.Liss,Inc. ,NewYork, 1987,Ch. 11and12,pp. 137-168。
[0124] 例如可如下所述地進(jìn)行成纖維細(xì)胞的分離：徹底洗滌新鮮的組織樣品并且在漢克 斯平衡鹽溶液（HBSS)中切碎以便除去血清。切碎的組織在新鮮制備的分裂酶諸如胰蛋白 酶的溶液中孵育1-12小時(shí)。此類(lèi)孵育后，分裂的細(xì)胞為懸浮的，通過(guò)離心壓成丸，并且接種 到培養(yǎng)皿。所有成纖維細(xì)胞將在其他細(xì)胞之前粘附，因此，可以選擇性分離適當(dāng)?shù)幕|(zhì)細(xì)胞 并且使其生長(zhǎng)。
[0125] 去分化細(xì)胞將用于體內(nèi)移植或植入之處對(duì)獲得來(lái)自于患者自身組織的基質(zhì)細(xì)胞 有用。
[0126] 寡核苷酸探針和引物可以用于鑒定本文所述的及克隆和擴(kuò)增過(guò)程中各種因子的 表達(dá)。寡核苷酸探針和引物指的是長(zhǎng)度8-2000個(gè)核苷酸的核酸分子。更具體地，這些寡 核苷酸的長(zhǎng)度范圍大約8、10、15、20或30-100個(gè)核苷酸，但是通常為大約10-50個(gè)（例如 15-30個(gè)核苷酸）。本領(lǐng)域中技術(shù)人員可以經(jīng)驗(yàn)為主地確定在特定條件下本公開(kāi)文本的測(cè) 定中適當(dāng)長(zhǎng)度的寡核苷酸。
[0127] 通過(guò)任何合適的方法，包括但不限于適當(dāng)?shù)男蛄械目寺『拖拗坪突谝阎?KLF4、0CT4、S0X2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NAN0G或其任何組合多核苷酸和多肽序列直接 的化學(xué)合成可以制備寡核苷酸引物和探針。各種來(lái)自其他物種的直系同源物為本領(lǐng)域中已 知的。
[0128] 寡核苷酸引物和探針可以包含核酸類(lèi)似物，諸如例如肽核酸，鎖核酸（LNA)類(lèi)似 物和嗎啉基類(lèi)似物。可以用捕獲或可檢測(cè)的標(biāo)記使探針的3'末端功能化從而幫助KLF4、 0CT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NANOG、Glisl或其任何組合核酸的檢測(cè)。
[0129] 可以通過(guò)合并可檢測(cè)的標(biāo)記來(lái)標(biāo)記任何本公開(kāi)文本的寡核苷酸或核酸，其通過(guò)光 譜學(xué)的，光化學(xué)的，生物化學(xué)的，免疫化學(xué)的或化學(xué)的方法為可測(cè)的。例如，此類(lèi)標(biāo)記可以包 含放射性物質(zhì)（ 32P、35S、3H、125I)，熒光染料（5-溴脫氧尿苷，熒光素，乙酰氨基芴，地高辛）， 生物素，納米顆粒等。此類(lèi)寡核苷酸通常標(biāo)記在它們的3'和5'末端。
[0130] 寡核苷酸引物和探針可以固定化在固相載體上。固相載體為本領(lǐng)域中那些技術(shù) 人員已知的并且包括反應(yīng)盤(pán)、測(cè)試管、聚苯乙烯珠、磁珠、硝化纖維素條、膜、諸如膠乳粒子 的微粒，玻璃等的孔壁。固相載體不是關(guān)鍵的并且可以通過(guò)本領(lǐng)域中技術(shù)人員所選擇。因 此，膠乳粒子、微粒、磁珠或非磁珠、膜、塑料管、微量測(cè)試孔壁、玻璃或硅片等為所有合適的 實(shí)例。使寡核苷酸固定化在固相的合適的方法包括離子的，疏水的，共價(jià)的相互作用等?？?以根據(jù)它的吸引和固定捕獲試劑的固有能力選擇固相載體。寡核苷酸探針或引物可以單 獨(dú)地或以本公開(kāi)文本的大約2-10000個(gè)獨(dú)特的寡核苷酸的組粘附到單一的固相載體或固 定化到固相載體上。包含多個(gè)本公開(kāi)文本的寡核苷酸引物或探針的底物可用于檢測(cè)或擴(kuò) 增KLF4、0CT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NANOG、Glisl或其任何組合。例如，寡核苷 酸探針可用在寡核苷酸芯片諸如Affymetrix所售的或美國(guó)專(zhuān)利5, 143, 854號(hào)；PCT出版物 TO90/15070和92/10092號(hào)中所述的那些，在此通過(guò)引用將這些發(fā)明并入本文。使用機(jī)械 的合成方法或光直接合成方法可以產(chǎn)生這些測(cè)定，所述光直接合成方法包含光刻法方法和 固相寡核苷酸合成的組合。本公開(kāi)文本還考慮能夠特異地結(jié)合KLF4、0CT4、SOX2、c-MYC或 n-MYC或L-MYC、NANOG或Glisl多肽的抗體。
[0131] 參照或?qū)φ杖褐傅氖且唤M預(yù)測(cè)代表總?cè)后w個(gè)體或個(gè)人。測(cè)量測(cè)試樣品的樣品中 KLF4、0CT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NANOG、Glisl或其任何組合的量，其中數(shù)量與 對(duì)照樣品比較。
[0132] 在另一方面，本公開(kāi)文本提供了沿著定向譜系分化干細(xì)胞的方法，所述方法包括 抑制KLF4、0CT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NANOG、Glisl或其任何組合的表達(dá)或活 性。就這一點(diǎn)而言有用的分化劑包括，例如抗體，反義寡核苷酸，RNAi構(gòu)建體或核糖酶。
[0133] 本公開(kāi)文本的方法中有用的培養(yǎng)技術(shù)公開(kāi)在國(guó)際專(zhuān)利出版WO2010/120785號(hào) 中，其通過(guò)引用并入本文。
[0134] 提供下列的實(shí)施例用以例證本公開(kāi)文本的某些方面并且?guī)椭绢I(lǐng)域中那些技術(shù) 人員實(shí)踐本公開(kāi)文本。絕不認(rèn)為這些實(shí)施例以任何方式限制了本公開(kāi)文本的范圍。 實(shí)施例
[0135] 實(shí)施例1
[0136] 細(xì)胞。BJ包皮成纖維細(xì)胞和STO細(xì)胞系獲自ATCC。原代人包皮成纖維細(xì)胞（HFF) 和HUES-9人ES細(xì)胞系獲自現(xiàn)有的資源。BJ、HFF和STO培養(yǎng)在包含10%FBS，MEM非必需 氨基酸（NEAA)，丙酮酸，盤(pán)尼西林和鏈霉素的DMEM中。HUES-9和iPS細(xì)胞與ES培養(yǎng)基一起 培養(yǎng)在包含20%基因敲除的SR、GlutaMAX、NEAA、2-巰基乙醇（所有都來(lái)自Invitrogen)， 盤(pán)尼西林，鏈霉素和bFGF(10ng/ml)的基因敲除的D-MEM。通過(guò)絲裂霉素C(10yg/ ml,Sigma)處理制備ST0飼養(yǎng)細(xì)胞。對(duì)iPS細(xì)胞克隆和HUES-9的無(wú)飼養(yǎng)的培養(yǎng)而言，細(xì)胞 在Matrigel?(BDBioscience)包被的孔傳代并且與ES培養(yǎng)基在制備于ST0飼養(yǎng)細(xì)胞的條 件培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0137]質(zhì)粒構(gòu)建。0CT4(登錄號(hào)NM_002701)、c-MYC(登錄號(hào)NM_002467)和GLIS1 (登錄 號(hào)BC104911)的編碼cDNA獲自O(shè)pen生物系統(tǒng)。S0X2(登錄號(hào)NM_003106)、KLF4(登錄號(hào) NM_004235)、NAN0G(登錄號(hào)BC099704)獲自ATCC。B18R(登錄號(hào)D01019)獲自Addgene。通 過(guò)引用將與每一以上的登錄號(hào)有關(guān)的多核苷酸和多肽序列并入本文。cDNA用作PCR擴(kuò)增的 模板以增加限制性酶位點(diǎn)和/或Kozak序列，并且被克隆到pBluescriptSK+載體用于核對(duì) cDNA序列。然后cDNA被克隆到用于mRNA合成的pTNT載體（Promega)和用于逆轉(zhuǎn)錄病毒 產(chǎn)生的pCX4bsrl。對(duì)使用病毒的2A肽序列的多順?lè)醋颖磉_(dá)而言，使F2A寡核苷酸、T2A寡核 苷酸和E2A寡核苷酸（表1)退火的并且分別克隆到pBluescriptSK+載體的EcoRI/Spel、 Spel/Xbal和Xbal/Notl位點(diǎn)。重編程因子的cDNA與框架中的2A肽序列連接，然后克隆到 pVEE-S-IRES-Puro。從p5'VEE/S/GFP/Pac3 構(gòu)建pVEE-S-IRES-Puro用以克隆重編程的因 子。簡(jiǎn)略地，用Xbal/Mfel消化刪除p5'VEE/S/GFP/Pac中的GFP/Pac基因和部分的3'UTR， 然后引入多克隆位點(diǎn)（MCS;NdeI、AscI、BbvCI、ClaI、MfeI、FseI和Notl)(表 1)，IRES和來(lái) 自pCX4puro的嘌呤霉素抗性基因。為了方便起見(jiàn)，這一載體被改名為pVEE-IRES-Puro。為 了產(chǎn)生帶有I7RNA核糖核酸聚合酶的RNA，通過(guò)使用VEE載體的SacI/BstZ17I片段作為模 板的PCR(表 1)，SP6 啟動(dòng)子（AITTAGGTGACACTATAG(例如見(jiàn)SEQIDN0:31，16844-16861)) 被 17 啟動(dòng)子（TAATACGACTCACTATAG(例如見(jiàn)SEQIDN0:32,16843-16860))取代（SP6 啟動(dòng) 子位于SacI位點(diǎn)旁邊）。
[0138] 表1:PCR克隆引物
[0139]
【權(quán)利要求】
1. 甲病毒復(fù)制子RNA，其包含： 至少一個(gè)來(lái)自甲病毒的非結(jié)構(gòu)性復(fù)制酶域和至少一個(gè)編碼因子的非甲病毒的異源性 序列，所述因子用于當(dāng)在體細(xì)胞中表達(dá)時(shí)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的產(chǎn)生。
2. 如權(quán)利要求1所述的甲病毒復(fù)制子RNA，其中所述復(fù)制子包含獲自甲病毒的序列，所 述甲病毒選自東方馬腦炎病毒（EEE)、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒（VEE)、埃弗格賴(lài)德病毒、穆坎 博病毒、皮春納病毒和西方馬腦炎病毒（WEE)。
3. 如權(quán)利要求1所述的甲病毒復(fù)制子RNA，其中所述復(fù)制子包含獲自甲病毒的序列，所 述甲病毒選自辛德畢斯病毒、塞姆利基森林病毒、米德?tīng)柋げ《?、基孔肯雅病毒、阿尼昂?昂病毒、羅斯河病毒、巴馬森林病毒、蓋他病毒、覽山病毒、貝巴魯病毒、馬雅羅病毒、烏納病 毒、奧拉病毒、瓦塔羅阿病毒、巴班肯病毒、Kyz病毒、高地J病毒、摩根堡病毒、恩杜姆病毒 和博吉河病毒。
4. 如權(quán)利要求1所述的甲病毒復(fù)制子RNA，其中所述至少一個(gè)非甲病毒的異源性序列 包含至少2、3、4或5個(gè)非甲病毒的異源性序列。
5. 如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的甲病毒復(fù)制子RNA，其中所述非甲病毒的異源性序 列選自編碼KLF多肽、S0X-2多肽、0CT-3/4多肽、c-MYC或n-MYC或L-MYC多肽、GLIS1多 肽、NANOG多肽及其任何組合的多核苷酸。
6. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復(fù)制子RNA，其中所述編碼KLF多肽的多核苷酸編碼與 SEQ ID N0:8序列具有至少95%同一性的KLF多肽。
7. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復(fù)制子RNA，其中所述編碼KLF多肽的多核苷酸編碼具 有SEQ ID N0:8序列的KLF多肽。
8. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復(fù)制子RNA，其中所述編碼KLF多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO: 7所示的序列，其中"T"為"U"。
9. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復(fù)制子RNA，其中所述編碼S0X-2多肽的多核苷酸編碼 與SEQ ID N0:6序列具有至少95%同一性的S0X-2多肽。
10. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復(fù)制子RNA，其中所述編碼S0X-2多肽的多核苷酸編碼 具有SEQ ID N0:6序列的S0X-2多肽。
11. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復(fù)制子RNA，其中所述編碼S0X-2多肽的多核苷酸包含 SEQ ID N0:5所示的序列，其中"T"為"U"。
12. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復(fù)制子RNA，其中所述編碼0CT-4多肽的多核苷酸編碼 與SEQ ID N0:4序列具有至少95%同一性的0CT-4多肽。
13. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復(fù)制子RNA，其中所述編碼0CT-4多肽的多核苷酸編碼 具有SEQ ID N0:4序列的0CT-4多肽。
14. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復(fù)制子RNA，其中所述編碼0CT-4多肽的多核苷酸包含 SEQ ID N0:3所示的序列，其中"T"為"U"。
15. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復(fù)制子RNA，其中所述編碼c-MYC多肽的多核苷酸編碼 與SEQ ID NO: 10序列具有至少95%同一性的c-MYC多肽。
16. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復(fù)制子RNA，其中所述編碼c-MYC多肽的多核苷酸編碼 具有SEQ ID NO: 10序列的c-MYC多肽。
17. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復(fù)制子RNA，其中所述編碼c-MYC多肽的多核苷酸包含 SEQ ID N0:9所示的序列，其中"T"為"U"。
18. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復(fù)制子RNA，其中所述編碼GLIS1多肽的多核苷酸編碼 與SEQ ID N0:34序列具有至少95%同一性的GLIS1多肽。
19. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復(fù)制子RNA，其中所述編碼GLIS1多肽的多核苷酸編碼 具有SEQ ID N0:34序列的GLIS1多肽。
20. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復(fù)制子RNA，其中所述編碼GLIS1多肽的多核苷酸包含 SEQ ID NO:33所示的序列，其中"T"為"U"。
21. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復(fù)制子RNA，其中所述編碼NANOG多肽的多核苷酸編碼 與SEQ ID NO:2序列具有至少95%同一性的NANOG多肽。
22. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復(fù)制子RNA，其中所述編碼NANOG多肽的多核苷酸編碼 具有SEQ ID NO:2序列的NANOG多肽。
23. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復(fù)制子RNA，其中所述編碼NANOG多肽的多核苷酸包含 SEQ ID N0:1所示的序列，其中"T"為"U"。
24. 如權(quán)利要求1所述的甲病毒復(fù)制子RNA，其中所述復(fù)制子從5'到3'包含：(VEE RNA復(fù)制酶）-(啟動(dòng)子）-(RFD -(自切割肽）-(RF2)-(自切割肽）-(RF3) - (IRES或核心啟 動(dòng)子）_ (RF4) - (IRES或任選的啟動(dòng)子）-(任選的選擇性標(biāo)記物）-(VEE 3 ' UTR和聚腺苷酸 尾）_(任選的選擇性標(biāo)記物）_啟動(dòng)子；其中RFg為誘導(dǎo)體細(xì)胞去分化為多能細(xì)胞的因子， 其中RF2_3為任選的，RF3_4為任選的，或RF 4為任選的；其中RFh選自O(shè)ct-4、Klf4、Sox-2、 c_Myc、Nanog 和 G1 i s 1。
25. 如權(quán)利要求1或24所述的甲病毒復(fù)制子RNA，其中所述復(fù)制子包含與SEQ ID N0:29、30、31或32從大約位置1到大約位置756190%、95%、98%、99%或100%同一的序 列，其中所述序列的"T"被"U"取代，接著是一個(gè)或多個(gè)RF，再接著是3'UTR和聚腺苷酸尾， 其中所述一個(gè)或多個(gè)RF選自0(^-3/4、5(?-2、1(1€4、(3-]\^(3、似11(^和61181;其中當(dāng)存在多 個(gè)RF時(shí)，編碼序列可被內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES)或小啟動(dòng)子所分隔。
26. 如權(quán)利要求25所述的甲病毒復(fù)制子RNA，其中所述復(fù)制子包含與選自SEQ ID 吣:29、30、31或32的序列至少95%、98%、99%或100%同一的序列，其中"!'"為1"。
27. 組合物，其包含用權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)所述的復(fù)制子轉(zhuǎn)化的人細(xì)胞。
28. 如權(quán)利要求27所述的組合物，其還包含B18R條件培養(yǎng)基。
29. 如權(quán)利要求27所述的組合物，其中所述人細(xì)胞為體細(xì)胞。
30. 如權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述人細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。
31. 制備干細(xì)胞的方法，其包括在表達(dá)復(fù)制子的編碼序列的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求27所 述的組合物至少30天，和分離干細(xì)胞。
32. 制備干細(xì)胞的方法，其包括用權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)所述的復(fù)制子轉(zhuǎn)化體細(xì)胞， 在促進(jìn)所述復(fù)制子表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述體細(xì)胞，和分離干細(xì)胞。
33. 如權(quán)利要求31或32所述的方法，其中所述培養(yǎng)包括在B18R條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)所 述細(xì)胞。
34. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中通過(guò)將B18R mRNA轉(zhuǎn)染到原代人成纖維細(xì)胞來(lái)產(chǎn) 生所述B18R條件培養(yǎng)基。
35. 從權(quán)利要求31或33所述的方法所獲得的分離的干細(xì)胞，其中所述干細(xì)胞沒(méi)有逆轉(zhuǎn) 錄病毒的DNA或RNA。
36. 方法，其包括： 使人體細(xì)胞與異位的自我復(fù)制的RNA復(fù)制子接觸，所述復(fù)制子包含編碼至少四種選 自以下的去分化因子的多核苷酸：（i)KLF4,（ii)0CT4,（iii)S0X2,（iv)c-MYC或n-MYC或 L-MYC，（v)GLISl 和（vi)NANOG ; 培養(yǎng)所述體細(xì)胞以表達(dá)所述去分化因子； 選擇呈現(xiàn)干細(xì)胞形態(tài)和/或干細(xì)胞標(biāo)志物的細(xì)胞；以及 繼代培養(yǎng)所述細(xì)胞以獲得誘導(dǎo)性干細(xì)胞群。
37. 如權(quán)利要求36所述的方法，其中通過(guò)檢測(cè)腫瘤排斥抗原1-60和/或1-81的表達(dá) 來(lái)選擇所述細(xì)胞。
38. 用于產(chǎn)生人干細(xì)胞的載體系統(tǒng)，其包含 至少一個(gè)自我復(fù)制的RNA復(fù)制子，所述復(fù)制子包含一個(gè)或多個(gè)編碼選自以下的去分化 因子的多核苷酸：1〇^4、0(^4、5(?2、(3-]^(：或11-]^(：或1-]^(：、61151、隱勵(lì)6或其任何組合。
39. 如權(quán)利要求38所述的載體系統(tǒng)，其中所述復(fù)制子包含： (a) 0ct4、Sox2、Klf4 和 c_Myc，或 (b) 0ct4、Sox2、Klf4 和 Glisl。
40. 如權(quán)利要求38所述的載體系統(tǒng)，其中一個(gè)自我復(fù)制的RNA載體源自甲病毒。
41. 如權(quán)利要求40所述的載體系統(tǒng)，其中所述甲病毒為VEE。
42. 包含異位的RNA復(fù)制子的分離的人體細(xì)胞，所述復(fù)制子包含一個(gè)或多個(gè)去分化多 核苷酸序列。
43. 如權(quán)利要求42所述的人體細(xì)胞，其中在表達(dá)所述異位的RNA復(fù)制子中的去分化多 核苷酸的培養(yǎng)條件下，所述體細(xì)胞去分化。
44. 細(xì)胞群，包含權(quán)利要求43所述的細(xì)胞。
45. 通過(guò)權(quán)利要求35所述的方法獲得的細(xì)胞群。
46. 如權(quán)利要求44或45所述的細(xì)胞群或權(quán)利要求35或36所述的方法，其中所述細(xì)胞 或方法包括在抑制所述異位的RNA復(fù)制子降解的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N5/074GK104508131SQ201380038648
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2013年5月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月21日
【發(fā)明者】史蒂文·F·道迪, 吉岡直壽 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)