一種新型高強(qiáng)度羊毛的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新型高強(qiáng)度羊毛，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)和胚胎移植的方法，制備了以毛囊特異表達(dá)載體表達(dá)擬蜘蛛牽絲蛋白基因的克隆羊。將蜘蛛絲與羊毛的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合，得到了平均拉伸度增加1.6倍的蛛絲毛羊。利用此種細(xì)毛羊生產(chǎn)的羊毛紡紗，會有效減少損失，生產(chǎn)出的紡織產(chǎn)品也具有輕便、耐磨，不易變形等特點(diǎn)，產(chǎn)品舒適度和美觀度將大大增加，對于紡織行業(yè)的發(fā)展有重要的促進(jìn)意義。
【專利說明】一種新型高強(qiáng)度羊毛
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種新型高強(qiáng)度羊毛，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]羊毛是一種重要的紡織原料，在紡織行業(yè)中應(yīng)用廣泛，中國是畜牧業(yè)大國，細(xì)毛綿羊毛紡出的絲線支數(shù)高，制備的成品輕便、細(xì)膩，深受百姓的喜愛。但毛直徑小，利用此種羊毛加工毛紗斷裂帶來的損失大大增加了紡織成本，紡織品的耐磨性也較差。目前國內(nèi)市場改良物種的手段是引入優(yōu)質(zhì)公羊，通過體外受精和胚胎移植的手段提高畜產(chǎn)品的優(yōu)良性狀，但毛的強(qiáng)度性狀由基因決定，要想有效改善此問題，提高毛的利用率和紡織性能，就需要利用生物工程手段來解決，傳統(tǒng)的育種方法達(dá)不到此目的。
[0003]細(xì)度是確定毛纖維品質(zhì)和使用價值的重要工藝特性，用纖維的直徑微米或品質(zhì)支數(shù)表示。細(xì)度越小，支數(shù)越高，紡出的毛紗越細(xì)。但毛越細(xì)斷裂強(qiáng)度越小，由于強(qiáng)度差毛紡企業(yè)在梳毛過程中由于斷裂的問題損失率為5-10%，使得紡織成本大大增加。新疆美利奴細(xì)毛羊毛的平均直徑為21.5-25.0 μ m，是目前中國市場細(xì)度最佳的品種，要想增強(qiáng)其紡織性能，提高強(qiáng)伸度是有力手段。自誕生了首例轉(zhuǎn)生長激素基因“超級小鼠”以來，世界各國科學(xué)家均將轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用于動物生產(chǎn)，目前做的較多的有利用其提高動物生長速度、生產(chǎn)性能、改善動物產(chǎn)品品質(zhì)、抗病育種等幾個方面。1994年，Powell等克隆了 IGF-1 cDNA并克隆超高硫角蛋白啟動子并構(gòu)建了毛囊特異表達(dá)載體，待受精卵體外發(fā)育到原核期后利用顯微注射的方法把連有目的基因的載體注入受精卵的原核中，通過胚胎移植的手段生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因羊的羊毛含脂率得到明顯提高，光澤度增強(qiáng)。
[0004]蜘蛛絲主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，是目前自然界發(fā)現(xiàn)的最為堅(jiān)韌的天然纖維材料，其中以牽絲最優(yōu)，是很好的纖維材料，用于軍事、醫(yī)療和國防等各個領(lǐng)域。但人工飼養(yǎng)蜘蛛困難，蛛絲蛋白的重復(fù)序列特性被破解后，世界各國科學(xué)家均采用轉(zhuǎn)基因手段利用工程菌、動物生物反應(yīng)器和植物生產(chǎn)人工蛛絲蛋白。但人們獲得蜘蛛絲蛋白基因的表達(dá)產(chǎn)物后都存在一個非常重要的問題，就是如何將蛛絲蛋白紡織成絲纖維進(jìn)而得到有效利用。就又開始從紡織技術(shù)提高入手，來提高蛛絲纖維的紡織水平，但由于蜘蛛紡錘腺的特殊性，還沒有摸索出適宜的蛛絲紡織方式，使人工絲蛋白合成纖維具有天然絲纖維的特征，所以進(jìn)展緩慢。
[0005]本發(fā)明是將蜘蛛牽絲的優(yōu)良性能用于改善毛羊的毛品質(zhì)，生產(chǎn)新型的紡織材料。克服了用異源宿主生產(chǎn)蛛絲蛋白產(chǎn)量低、產(chǎn)物不均一問題及紡織技術(shù)對其開發(fā)應(yīng)用的限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種擬蜘蛛牽絲蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，片段長度為560bp，編碼的蛋白序列可以形成兩種二級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)，一種是β折疊，決定纖維的強(qiáng)度，另一種是β螺旋，決定纖維的彈性。將該基因在實(shí)驗(yàn)室加倍成4聚體，4聚體的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。[0007]本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種新型高強(qiáng)度羊毛，是表達(dá)了擬蜘蛛牽絲蛋白基因的羊毛。羊毛的強(qiáng)度和彈性得到增強(qiáng)。
[0008]所述羊毛優(yōu)選表達(dá)了 SEQ ID N0.2所示擬蜘蛛牽絲蛋白基因四聚體的羊毛。更進(jìn)一步地，優(yōu)選以SEQ ID N0.3所示載體表達(dá)SEQ ID N0.2所示擬蜘蛛牽絲蛋白基因四聚體的羊毛。
[0009]本發(fā)明要解決的第三個技術(shù)問題是提供一種制備所述新型高強(qiáng)度羊毛的方法，是通過構(gòu)建攜帶擬蜘蛛牽絲蛋白基因的毛囊特異性表達(dá)載體以及體細(xì)胞核移植，制備表達(dá)擬蜘蛛牽絲蛋白基因的克隆羊，以獲得的克隆羊生產(chǎn)高強(qiáng)度羊毛。
[0010]所述制備方法，優(yōu)選以下步驟:
[0011](1)克隆角蛋白結(jié)合蛋白Kap6.1啟動子，置換載體PEGFP-Nl上的原始啟動子CMV，構(gòu)建了表達(dá)載體pKap-EGFP，載體pKap-EGFP的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示；
[0012](2)人工合成擬蜘蛛牽絲蛋白基因單體并加倍成四聚體，核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示；
[0013](3)在pKap-EGFP載體的多克隆位點(diǎn)引入目的基因擬蜘蛛牽絲蛋白四聚體(4S)，構(gòu)建了毛囊特異表達(dá)載體pKap-E4S，核苷酸序列見SEQ ID N0.4 ；
[0014](4)培養(yǎng)新疆美利奴細(xì)毛羊胎兒皮膚成纖維細(xì)胞，利用脂質(zhì)體的方法進(jìn)行了基因轉(zhuǎn)染，經(jīng)G418篩選、DNA和RNA水平鑒定后獲得陽性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞；
[0015](5)以體外成熟卵母細(xì)胞做受體，轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞做供體，利用核移植的方法制備了克隆重組胚胎，通過胚胎移植的方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆羊產(chǎn)高強(qiáng)度羊毛。
[0016]本發(fā)明要解決的第四個技術(shù)問題是提供一種產(chǎn)所述高強(qiáng)度羊毛的羊的制備方法，是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備表達(dá)擬蜘蛛牽絲蛋白基因的轉(zhuǎn)基因羊。
[0017]本發(fā)明首次利用擬蜘蛛牽絲蛋白基因通過制備被毛轉(zhuǎn)擬蜘蛛牽絲蛋白基因毛羊來提高羊毛的強(qiáng)度，通過對基因進(jìn)行優(yōu)化結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)，制造出了毛平均拉伸度增加1.6倍的蛛絲毛羊，利用此種細(xì)毛羊生產(chǎn)的羊毛紡紗，會有效減少損失，生產(chǎn)出的紡織產(chǎn)品也具有輕便、耐磨，不易變形等特點(diǎn)，產(chǎn)品舒適度和美觀度將大大增加，顧客的滿意度也將顯著提高，對于紡織行業(yè)的發(fā)展有重要的促進(jìn)意義。同時蛛絲毛產(chǎn)品的國際市場也會被打開，將有效帶動國民經(jīng)濟(jì)，特別是牧業(yè)地區(qū)的經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展。
【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例1獲得擬蜘蛛牽絲蛋白基因
[0019]分析了 Lewis等人篩選到的蜘蛛牽絲蛋白基因3'端片段MaSpl以及Hinman等人篩選到的MaSp2，得知蜘蛛牽絲蛋白序列的組成特征:(I) GPGQQ/GPGGX (X為Ala、Ser、Tyr或Val)，形成β -轉(zhuǎn)角，與蛛絲彈力成正比；(2) GGX (X為Ala、Tyr、Leu或Glu)，形成310螺旋,連接轉(zhuǎn)換β -折疊；(3) PolyGlyAla/Poly Ala,形成β-折疊，與強(qiáng)度成正比;
(4)間隔序列。我們設(shè)計(jì)了 MaSpl氨基酸序列為:Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr GlyGly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Ala Ala Ala Ala AlaAla ;MaSp2氨基酸序列為:Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly GlnGln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala，并優(yōu)化合成了人工擬蜘蛛牽絲蛋白基因單體(S)，序列大小560bp，如SEQ ID N0.1所示，前后分別加入了酶切位點(diǎn)，前端為:BamH 1、Nae I ,后端為:Sma 1、Not I ,用于基因加倍。
[0020]實(shí)施例2毛囊特異表達(dá)載體的構(gòu)建
[0021]羊毛的主要成份是角蛋白，啟動子Kap6.1啟動角蛋白結(jié)合蛋白的表達(dá)。
[0022]克隆綿羊角蛋白結(jié)合蛋白啟動子Kap6.1，以該啟動子置換載體pEGFP_Nl上的原始啟動子CMV，構(gòu)建了表達(dá)載體pKap-EGFP，該載體序列如SEQ ID N0.3所示。轉(zhuǎn)染綿羊胎兒皮膚成纖維細(xì)胞，檢測了啟動子Kap6.1活性，結(jié)果顯示其能啟動增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP在綿羊胎兒皮膚成纖維細(xì)胞表達(dá)。
[0023]在pKap-EGFP載體的多克隆位點(diǎn)引入目的基因擬蜘蛛牽絲蛋白四聚體(4S)，構(gòu)建毛囊特異表達(dá)載體pKap-E4S，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0024]實(shí)施例3生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆羊
[0025](I)培養(yǎng)了新疆美利奴細(xì)毛羊胎兒皮膚成纖維細(xì)胞，細(xì)胞傳代后轉(zhuǎn)入6孔板，接種細(xì)胞濃度為2X IO5個/mL，生長24h，匯合率達(dá)70%_80%，可進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)使用InvitrogenTMReagent公司的Lipofectamine2000試劑盒進(jìn)行。具體方法是:配置溶液1:90 μ L opt1-mem+10 μ LLipofectamine2000,室溫放置 5min ;配置溶液 I1:質(zhì)粒為 4 μ g,其他用opt1-mem補(bǔ)齊至100 μ L ;將溶液I與溶液II混合，室溫下，靜置20min ;與此同時,將6孔板中的細(xì)胞用opt1-mem輕柔洗2遍,加入400 μ L opt1-mem ;將混合液逐滴加入孔中，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻，在37°C 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5h-6h ；5h-6h后，更換含10%血清的全培養(yǎng)基，在37°C 5%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后長滿單層，用胰蛋白酶消化，按1:30的比例(六孔板一個孔傳15cm大皿5個)傳入大皿中，加入含600 μ g/ml G418篩選培養(yǎng)液。每3d換液一次，大概生長9d-10d，可見培養(yǎng)板中出現(xiàn)了單克隆，挑取單克隆細(xì)胞，先接種到24孔板，接種傳代后進(jìn)行鑒定。
[0026]分別作了 DNA和RNA水平鑒定，挑出陽性轉(zhuǎn)擬蜘蛛牽絲蛋白基因單克隆細(xì)胞凍存?zhèn)溆谩?br> [0027](2)以體外成熟卵母細(xì)胞做受體，轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞做供體，利用核移植的方法制備了克隆重組胚胎，待胚胎在體外發(fā)育后，移入同期發(fā)情的代孕母羊(小尾寒羊)子宮，妊娠期結(jié)束后，做好接產(chǎn)和鑒定工作。
[0028](3)對誕生的7只羊的羊毛進(jìn)行了 DNA、RNA水平和毛拉力、伸度檢測，檢測時選取兩月齡、新疆美利奴細(xì)毛轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因羊各七只，分別剪一定量前腿、后退、腰部羊毛利用拉力檢測儀測定了毛的拉力和拉伸度，每個部位測200根(見表1)，測定完取平均值做了 P檢驗(yàn)，結(jié)果P〈0.001，證明轉(zhuǎn)基因羊和非轉(zhuǎn)基因羊毛拉力和伸度差異極顯著。擬蜘蛛牽絲蛋白基因已表達(dá)，毛的抗拉強(qiáng)度和伸度明顯增強(qiáng)。
[0029]表1羊毛韌性檢測數(shù)據(jù)
[0030]單位:F(N), L (mm)
[0031]
【權(quán)利要求】
1.一種擬蜘蛛牽絲蛋白基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一種擬蜘蛛牽絲蛋白基因四聚體，其特征在于，是將SEQ ID N0.1所示序列加倍成四聚體，所得四聚體基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.攜帶權(quán)利要求1或2所述基因的載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或動物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體，其特征在于，核苷酸序列如SEQID N0.4所示。
5.一種高強(qiáng)度羊毛，其特征在于，是表達(dá)了擬蜘蛛牽絲蛋白基因的羊毛。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高強(qiáng)度羊毛，其特征在于，是表達(dá)了SEQ ID N0.2所示擬蜘蛛牽絲蛋白基因四聚體的羊毛。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的高強(qiáng)度羊毛，其特征在于，是以SEQID N0.3所示的表達(dá)載體表達(dá)了 SEQ ID N0.2所示基因的羊毛。
8.一種制備權(quán)利要求5所述高強(qiáng)度羊毛的方法，是通過構(gòu)建攜帶擬蜘蛛牽絲蛋白基因的毛囊特異性表達(dá)載體以及體細(xì)胞核移植，制備表達(dá)擬蜘蛛牽絲蛋白基因的克隆羊，以獲得的克隆羊生產(chǎn)高強(qiáng)度羊毛。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，具體步驟為: (O克隆角蛋白結(jié)合蛋白Kap6.1啟動子，置換載體pEGFP-Nl上的原始啟動子CMV，構(gòu)建了表達(dá)載體pKap-EGFP，載體pKap-EGFP的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示； (2)人工合成擬蜘蛛牽絲蛋白基因單體并加倍成四聚體； (3)在pKap-EGFP載體的多克隆位點(diǎn)引入目的基因擬蜘蛛牽絲蛋白四聚體，構(gòu)建了毛囊特異表達(dá)載體pKap-E4S ； (4)培養(yǎng)新疆美利奴細(xì)毛綿羊胎兒皮膚成纖維細(xì)胞，利用脂質(zhì)體的方法進(jìn)行了基因轉(zhuǎn)染，經(jīng)G418篩選、DNA和RNA水平鑒定后獲得陽性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞； (5)以體外成熟卵母細(xì)胞做供體，轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞做受體，利用核移植的方法制備了克隆重組胚胎，通過胚胎移植的方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆羊產(chǎn)高強(qiáng)度羊毛。
10.一種產(chǎn)權(quán)利要求5所述羊毛的羊的制備方法，是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備表達(dá)擬蜘蛛牽絲蛋白基因的轉(zhuǎn)基因羊。
【文檔編號】C12N1/15GK103789318SQ201410014440
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月14日
【發(fā)明者】孟凡華, 張東, 王申元, 周歡敏, 劉羿羿, 張焱如, 劉春霞, 曹俊偉, 張立, 邢燕平, 李璐 申請人:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)