引物和其用途以及檢測小麥春化基因啟動子區(qū)插入變異的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種引物，其包括上游引物VRN-D1cF和下游引物VRN-D1cR，本發(fā)明提供的引物對小麥VRN-D1啟動子序列有很強的特異性，能夠區(qū)分小麥的A\B染色體組的干擾。使用本發(fā)明提供的引物進行檢測的操作簡單、快速、特異性強、且檢測成本較低，可用于檢測VRN-D1啟動子區(qū)的MITE轉座子插入，為小麥冬春性的準確鑒定提供科學依據(jù)。
【專利說明】引物和其用途以及檢測小麥春化基因啟動子區(qū)插入變異的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物檢測領域，具體涉及一種引物和其用途以及檢測小麥春化基因啟動子區(qū)插入變異的方法。
【背景技術】
[0002]小麥春化發(fā)育特性是決定小麥種植區(qū)劃、引種用種、栽培技術等的主要因素。小麥春化發(fā)育特性主要是由春化基因VRNl調控的。春化基因不同等位基因的組成決定了小麥品種在世界各地不同生態(tài)環(huán)境中的適應性。
[0003]小麥春化作用關鍵基因VRN-A1、VRN-BU VRN-Dl分別位于小麥染色體5A、5B、OT的長臂上。VRNl位點不同的顯性等位基因VRN-A1、VRN-BU VRN-Dl之間并無加性效應，任何一個位點的顯性等位基因都能決定該品種為春性。從效應分析VRN-A1、VRN-BU VRN-Dl作用依次減小，即包含VRN-Al的小麥品種完全不需要春化就能正常成熟，VRN-Dl需要部分春化，VRN-Bl對春化需求則介于兩者之間。相關研究發(fā)現(xiàn)，一粒小麥的VRNl編碼一個MADS-box基因，是擬南芥APl(apetalal)的直系同源基因，其表達隨著春化時間逐步升高。在普通小麥中，VRN-Al存在4種等位位點,分別為Vrn-Ala、Vrn-Alb> Vrn-Alc和vrn_Al,其中Vrn-Ala、Vrn-Alb> Vrn-Alc表現(xiàn)顯性,是春性品種，vrn-Al為隱性，品種表現(xiàn)冬性。VRN-Bl是由于第一內含子的插入突變引起的，而對應的野生型是vrn-Bl。Dl位點上存在4種等位變異，其中，三種顯性突變，一是VRN-Dla(第一內含子有大片段缺失)，二是VRN-Dlb (第一內含子缺失 和點突變同時存在)，第三是我們新發(fā)現(xiàn)的VRN-Dlc (啟動子區(qū)存在類MITE轉座子插入)，另外一種是隱性基因型vrn-Dl。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明目的在于提供一種引物。
[0005]具體的方案為:
[0006]一種引物，包括上游引物VRN-DlcF和下游引物VRN-DlcR，其核苷酸序列具體如下:
[0007]上游引物VRN-DlcF:5' -CGACCCGGGCGGCACGAGTG-3':
[0008]下游引物VRN-DlcR:5' -GCGGGACGAAAGAGGAAATGC-3'。
[0009]將該引物用于檢測小麥春化基因VRN-Dl啟動子區(qū)MITE轉座子是否插入變異，鑒定小麥是否表現(xiàn)出半冬性特征。
[0010]利用引物檢測小麥春化基因啟動子區(qū)插入變異的方法，包括如下步驟:
[0011]S1:提取小麥葉片或組織的基因組DNA ；
[0012]S2:以SI中提取的DNA為模板用上述引物進行PCR擴增，回收PCR擴增產物待用；
[0013]S3:取S2中的PCR擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，經Gelred染色后，用凝膠成像系統(tǒng)分析結果:若在225bp處有條帶的為隱性，在399bp處產生條帶，則小麥春化基因VRN-Dl啟動子區(qū)MITE轉座子插入突變，為VRN-Dlc型。
[0014]步驟S2中PCR擴增條件為:PCR擴增采用20 μ L反應體系，反應體系中含2 μ LlO X緩沖液、1.5μ L(25mmol.LlMgCly0.2μ L(5U)rTaqDNA 聚合酶、1.6 μ L (2.5 μ mo I L-1)dNTP，每條引物 I μ I (10 μ mo l-1)，DNA 模板 I μ L ;
[0015]PCR擴增程序:94°C預變性 5min ;94°C變性 30s，65°C退火 30s，72°C延伸 40s，35 個循環(huán)；72°C終延伸IOmin。
[0016]步驟S3中瓊脂糖膠的濃度為1.5%，緩沖體系為IXTAE溶液，5V / cm電壓電泳30mino
[0017]本發(fā)明提供的引物具有如下效果:
[0018]1:本發(fā)明提供的引物對小麥VRN-Dl啟動子序列有很強的特異性，能夠區(qū)分小麥的A\B染色體組的干擾。
[0019]2:使用本發(fā)明提供的引物進行檢測的操作簡單、快速、特異性強、且檢測成本較低，可用于檢測VRN-Dl啟動子區(qū)的MITE轉座子插入，為小麥冬春性的準確鑒定提供科學依據(jù)。
[0020]3:本發(fā)明的建立使小麥冬春性鑒定更加精確，為小麥品種的推廣和栽培提供基礎，有利于推進小麥適應性的遺傳研究和育種工作。
[0021]通過對全國200份小麥品種和材料進行了春化基因的等位變異分析，在黃淮麥區(qū)的100份小麥品種和材料發(fā)現(xiàn)了 4份材料VRN-Dl啟動子區(qū)的MITE轉座子插入序列。根據(jù)插入位點的側翼序列設計了能特異性鑒別啟動子區(qū)插入突變的引物，建立了本發(fā)明的分子檢測引物及體系。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為VRN-Dl部分啟動子及其插入的MITE轉座子序列；
[0023]圖2為檢測的部分品種的VRN-Dl啟動子區(qū)的插入突變。
其中，I:marker ；2:平安6號；3:周麥23 ；4:中育12 ；5:濟寧9903 ；6:偃展4110 ；7:豫麥 56 ；8:百農 3217 ；9:宿 042 ；10:花培 6 ；11:豫農 202 ；12:宿 553。
【具體實施方式】
[0024]為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合實施例對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0025]實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可通過商業(yè)途徑從生物試劑公司買到。
[0026]涉及的小麥品種和材料包括:平安6號、周麥23、中育12、濟寧9903、偃展4110、豫麥56、百農3217、宿042、花培6、豫農202、宿553。
[0027]所使用的引物為:
[0028]上游引物VRN-DlcF:5' -CGACCCGGGCGGCACGAGTG-3':
[0029]下游引物VRN-DlcR:5' -GCGGGACGAAAGAGGAAATGC-3'。
[0030]實施例1小麥春化位點VRN-Dl啟動子區(qū)MITE轉座子插入突變檢測[0031]上述引物用于檢測小麥春化位點VRN-Dl啟動子區(qū)插入突變檢測方法，包括以下步驟:
[0032]步驟一、小麥基因組DNA的制備
[0033]采用CTAB法對以上11份已知基因型的小麥品種進行總DNA進行提取，具體操作為:
[0034]a:取0.25g葉片，液氮研磨成粉(勿使材料融化)加入2ml的離心管中；
[0035]b:加入700ul2X CTAB buffer充分混勻，期間搖動3-5次，65°C水浴Ihr:
[0036]
2X CTAB buffer:
2%Hexade cyltrimethylamonium bromide (CTAB )
IOOmM Tris (pH 8.0)
20mM EDTA
0.5%NaHSO3
1.4 MNaCl
1%2-mercaptoethanol
[0037]c:冷卻至室溫，加入700ul氯仿/異戊醇(24: I)，旋轉混勻至乳濁液(或置于旋轉混合器)，室溫下處理15-60min ；
[0038]d:將乳池液倒入離心管,室溫下1000Orpm離心15min ；
[0039]e:將上清液轉入潔凈離心管，加2 / 3體積異丙醇，上下顛倒數(shù)次，勾出DNA，放入另一潔凈的1.5ml離心管；
[0040]f:70%酒精清洗DNA，重復2次；倒出酒精，空氣干燥Ihr ；
[0041]g:加入 500 μ I TE 溶解 DNA后，再加入 5μ I RNase A (10mg/ml)，在 4°C 條件過夜或 37。。Ihr。
[0042]步驟二、PCR擴增
[0043]PCR擴增采用20ul的反應體系:具體包括2 μ LlOX緩沖液、1.5 μ L (25mmol l-1)MgCl2、0.2μ L(5U)rTaqDNA 聚合酶、1.6μ L(2.5μπιο1 L-1) dNTP，每條引物 I μ I (10 μ mo IL-1)，DNA模板I μ L。PCR擴增程序為:PCR反應條件為:94°C預變性5min ;94°C變性30s，65°C退火30s，72°C延伸40s，35個循環(huán)；72°C終延伸IOmin。
[0044]步驟三、電泳檢測
[0045]取8ul上述PCR產物，用濃度為1.5%的瓊脂糖膠電泳分離，緩沖體系為IXTAE溶液，5V / cm電壓電泳30min，經Gelred染色后，用凝膠成像系統(tǒng)分析。檢測結果見附圖1、2及表1所示。
[0046]表1為利用本發(fā)明提供的引物檢測11個小麥品種的結果
[0047]
【權利要求】
1.一種引物，包括上游引物VRN-DlcF和下游引物VRN-DlcR，其核苷酸序列具體如下: 上游引物 VRN-DIcF:5/ -CGACCCGGGCGGCACGAGTG-3'； 下游引物 VRN-DIcR:5/ -GCGGGACGAAAGAGGAAATGC-3'。
2.一種如權利要求1所述引物的用途，將該引物用于檢測小麥春化基因VRN-Dl啟動子區(qū)MITE轉座子是否插入變異，鑒定小麥冬春性特征。
3.一種利用如權利要求1所述引物檢測小麥春化基因啟動子區(qū)插入變異的方法，包括如下步驟: S1:提取小麥葉片或組織的基因組DNA ； S2:以SI中提取的DNA為模板用上述引物進行PCR擴增，回收PCR擴增產物待用； S3:取S2中的PCR擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，經Gelred染色后，用凝膠成像系統(tǒng)分析結果:在225bp處有條帶的為隱性；在399bp處產生條帶的小麥春化基因VRN-Dl啟動子區(qū)MITE轉座子插入突變，為VRN-Dlc型。
4.如權利要求3所述利用引物檢測小麥春化基因啟動子區(qū)插入變異的方法，其特征在于:步驟S2中PCR擴增條件為:PCR擴增采用20 μ L反應體系，反應體系中含2 μ LlO X緩沖液、1.5μ L(25mmol.LlMgCly0.2 μ L(5U)rTaqDNA 聚合酶、1.6 μ L(2.5 μ mol OdNTP，每條引物 I μ I (10 μ mo I Ι71)，DNA 模板 I μ L ； PCR擴增程序:94°C預變性5min ;94°C變性30s，65°C退火30s，72。。延伸40s，35個循環(huán)；72°C終延伸IOmin。
5.如權利要求3所述利用引物檢測小麥春化基因啟動子區(qū)插入變異的方法，其特征在于:步驟S3中瓊脂糖膠的濃度為1.5%，緩沖體系為IXTAE溶液，5V/cm電壓電泳30min。
【文檔編號】C12Q1/68GK103882016SQ201410026128
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年1月14日 優(yōu)先權日:2014年1月14日
【發(fā)明者】王翔, 尹鈞, 郭總總, 尹飛 申請人:河南農業(yè)大學