一種桃芽變鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種桃芽變的鑒定方法，包括以下步驟：首先進(jìn)行連續(xù)3代嫁接鑒定，觀測(cè)表型性狀的穩(wěn)定性，對(duì)于連續(xù)3代嫁接后，性狀穩(wěn)定的疑似芽變，采集嫩葉和親本的嫩葉，提取基因組DNA，分別用SSR引物和SRAP引物對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳區(qū)分芽變，親本及疑似芽變品種電泳條帶有差異，則疑似芽變品種為芽變。本發(fā)明成功地鑒定了‘小白桃’和它的早熟芽變‘津柳早紅’桃。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便、用途廣泛，節(jié)約了大量的人力和物力，便于推廣。
【專利說(shuō)明】一種桃芽變鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明屬于園藝作物育種領(lǐng)域，涉及果樹(shù)新品種選育方法，尤其是一種桃芽變鑒定方法。
【背景技術(shù)】:
[0002]果樹(shù)芽變選種具有育種周期短、育種進(jìn)程快的特點(diǎn)，是種質(zhì)資源創(chuàng)新的重要途徑。芽變是體細(xì)胞突變的一種，是植物芽的分生組織體細(xì)胞發(fā)生的突變。芽變一般表現(xiàn)在枝、葉、花、果及物候期、成熟期等特征和特性上。選擇突變芽及其成長(zhǎng)的枝，經(jīng)過(guò)無(wú)性繁殖可以創(chuàng)造出新品種稱芽變選種。例如元帥系蘋果中的許多品種，都是利用芽變選種所得。
[0003]桃是容易出現(xiàn)芽變的果樹(shù)之一，采用芽變選種已經(jīng)培育出了許多優(yōu)良新品種，但是桃芽變的鑒定技術(shù)仍然不夠成熟，主要是無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分芽變和飾變。芽變是植物遺傳物質(zhì)發(fā)生了變化，而飾變不是遺傳物質(zhì)變化造成的，而是由于外界環(huán)境條件(如砧木、肥水、土壤、氣象因子及生物因子等)的影響，在外在形態(tài)上發(fā)生了變化。傳統(tǒng)的芽變鑒定主要通過(guò)形態(tài)學(xué)的觀察比較，但是有些情況下，芽變和飾變的形狀特征非常相似，僅通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察無(wú)法準(zhǔn)確判斷。因此，開(kāi)發(fā)準(zhǔn)確鑒定芽變的新技術(shù)，對(duì)于加速育種進(jìn)程，減少勞動(dòng)力和土地消耗，降低育種成本等具有重要意義。
[0004]嫁接是植物的人工營(yíng)養(yǎng)繁殖方法之一，即把一種植物的枝或芽，嫁接到另一種植物的莖或根上，使接在一起的兩個(gè)部分長(zhǎng)成一個(gè)完整的植株。果樹(shù)生產(chǎn)中，品種苗通常都采用嫁接繁殖獲得。
[0005]高等植物基因組存在大量重復(fù)序列，簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat,SSR)是其中一類，也稱微衛(wèi)星DNA，其串聯(lián)重復(fù)的核心序列為l_6bp，其中最常見(jiàn)是雙核苷酸重復(fù)，即(CA)n和(TG)n每個(gè)微衛(wèi)星DNA的核心序列結(jié)構(gòu)相同，重復(fù)單位數(shù)目10-60個(gè)，其高度多態(tài)性主要來(lái)源于串聯(lián)數(shù)目的不同。研究發(fā)現(xiàn)，微衛(wèi)星中重復(fù)單位的數(shù)目存在高度變異，這些變異表現(xiàn)為微衛(wèi)星數(shù)目的整倍性變異或重復(fù)單位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性。如果能夠?qū)⑦@些變異揭示出來(lái)，就能發(fā)現(xiàn)不同的SSR在不同的種甚至不同個(gè)體間的多態(tài)性，基于這一想法，人們發(fā)展了 SSR標(biāo)記由于基因組中某一特定的微衛(wèi)星的側(cè)翼序列通常都是保守性較強(qiáng)的單一序列，因而可以將微衛(wèi)星側(cè)翼的DNA片段克隆、測(cè)序，然后根據(jù)微衛(wèi)星的側(cè)翼序列就可以人工合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而將單個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增出來(lái)。由于單個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)重復(fù)單元在數(shù)量上的變異，個(gè)體的擴(kuò)增產(chǎn)物在長(zhǎng)度上的變化就產(chǎn)生長(zhǎng)度的多態(tài)性，這一多態(tài)性稱為簡(jiǎn)單序列重復(fù)長(zhǎng)度多態(tài)性每一擴(kuò)增位點(diǎn)就代表了這一位點(diǎn)的一對(duì)等位基因。
[0006]相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(Sequence-relatedamplified polymorphism, SRAP)標(biāo)記技術(shù)是一種新型的基于PCR擴(kuò)增的分子標(biāo)記技術(shù)，其上游引物長(zhǎng)17bp，針對(duì)基因外顯子里GC含量豐富而啟動(dòng)子和內(nèi)含子里AT含量豐富的特點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，因不同個(gè)體的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔區(qū)長(zhǎng)度不等而產(chǎn)生多態(tài)性。SRAP標(biāo)記的基本原理:利用SRAP技術(shù)設(shè)計(jì)引物很關(guān)鍵，它是通過(guò)特殊引物對(duì)開(kāi)放閱讀框(ORFs)進(jìn)行擴(kuò)增。正向引物(F-primer)含17個(gè)堿基，5'端的IObp是一段非特異性的填充序列，接著是CCGG序列，這14bp組成核心序列，最后是3'端的3個(gè)選擇性堿基，對(duì)外顯子進(jìn)行擴(kuò)增，反向引物含18個(gè)堿基，在5'端前11個(gè)是填充序列，和緊接的AATT組成核心序列，3'端是3個(gè)選擇堿基，對(duì)內(nèi)含子區(qū)域和啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，由于不同個(gè)體及物種的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔序列變異很大，所以產(chǎn)生多態(tài)性擴(kuò)增產(chǎn)物。SRAP是一種基于PCR的新型分子標(biāo)記技術(shù)，它無(wú)需任何序列信息即可直接擴(kuò)增，具有簡(jiǎn)單快捷的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)兼具多態(tài)性和穩(wěn)定性，還具有可靠性好、重復(fù)性高、快速、易于測(cè)序等特點(diǎn)，是簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)又有效的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種桃芽變的鑒定方法，通過(guò)本方法中提供的引物對(duì)，能夠找到并確定桃芽變植株。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
[0009]一種桃芽變的鑒定方法，包括以下步驟:
[0010]首先進(jìn)行連續(xù)三代嫁接鑒定,觀測(cè)表型性狀的穩(wěn)定性,對(duì)于連續(xù)三代嫁接后，性狀穩(wěn)定的疑似芽變，采集嫩葉和親本的嫩葉，提取基因組DNA，分別用SSR引物和SRAP引物對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳區(qū)分芽變，親本及疑似芽變品種電泳條帶有差異，則疑似芽變品種為芽變；
[0011]所述的SSR 引物包括:BPPCT00K BPPCT009、、BPPCTO15, BPPCTO16, BPPCT020、BPPCT028、BPPCT030、CPPCT008、CPPCTO13, CPPCT022、CPPCT030、UDP98-411、UDP96-019、UDP97-40UUDP96-008 ；
[0012]所述的SRAP引物包括:Mel~6，Eml~6 ;
[0013]所述的PCR 反應(yīng)體系包括:10ng DNA 模板、1.5mmol/L MgC12、0.15mmol/L dNTPs、
0.55ymol/L 引物、1.0U Taq DNA 聚合酶、I XPCR buffer，反應(yīng)總體積為 10 μ L ；
[0014]所述的PCR擴(kuò)增程序包括:
[0015]SSR 標(biāo)記擴(kuò)增程序:95°C預(yù)變性 5min, 94°C lmin、53°C lmin、72°C lmin,共 35 個(gè)循環(huán)；72°C 8min ；
[0016]SRAP標(biāo)記擴(kuò)增程序:SRAP反應(yīng)程序共40個(gè)循環(huán)，94°C預(yù)變性5min ;前5個(gè)循環(huán):94°C變性 lmin，35°C 復(fù)性 lmin，72°C 延伸 Imin ;后 35 個(gè)循環(huán):94°C變性 lmin，50°C 復(fù)性lmin,72°C延伸Imin ;循環(huán)結(jié)束后72°C延伸lOmin。
[0017]而且，所述的嫁接鑒定，采用下面的方法進(jìn)行:
[0018]采用嫁接繁殖技術(shù)，將疑似芽變枝條的芽嫁接到毛桃砧木上，在整個(gè)生長(zhǎng)季觀測(cè)表型性狀變化，重點(diǎn)觀測(cè)生長(zhǎng)習(xí)性、開(kāi)花結(jié)實(shí)等性狀，連續(xù)進(jìn)行3代嫁接，觀測(cè)表型性狀變異的穩(wěn)定性。
[0019]而且，所述的基因組DNA提取方法，包括以下步驟:
[0020]⑴取幼嫩葉片或幼嫩植物材料0.5-1.0g，去葉脈，加入液氮研磨成很細(xì)的粉末，轉(zhuǎn)入7ml離心管；
[0021]⑵加入2.5mlCTAB提取液，放入65°C水浴鍋中，溫浴0.5h，晾至室溫；
[0022]⑶加入等體積氯仿-異戊醇混合液輕輕地顛倒抽提約0.5h ；
[0023]⑷置離心機(jī)中，10000r/min離心20min，[0024](5)吸取上清液，置新離心管，再加入等體積氯仿-異戊醇混合液，輕輕地顛倒抽提
0.5h ；
[0025](6)重復(fù)步驟⑷；
[0026](7)吸取上清液，置新離心管，加入2.5倍體積無(wú)水乙醇，放入一 20°C冰箱中，沉淀
0.5h ；
[0027](8)置離心機(jī)中，10000r/min 離心 15min ；
[0028](9)倒掉上清液，用70%乙醇400ul洗滌2次，晾至至無(wú)乙醇味，加400ulTE溶解，放入-20°C冰箱貯存。
[0029]而且，所述氯仿-異戊醇混合液的混合比例為氯仿:異戊醇的體積比=24:1。
[0030]而且，所述SRAP 引物對(duì)為 mel/em5, me2/eml, me2/em5, me3/em2, me3/em6, me5/em5, me5/em6, me6/em2 ；
[0031]所述SSR 引物對(duì)為 BPPCTOO I，CPDCT008, BPPCT009, BPPCT020 和 UDP98-411 ；
[0032]所述的PCR 反應(yīng)體系包括:10ng DNA 模板、1.5mmol/L MgCl2、0.15mmol/L dNTPs、
0.55ymol/L 引物、1.0U Taq DNA 聚合酶、I XPCR buffer，反應(yīng)總體積為 10 μ L。
[0033]而且，所述親本桃為小白桃,芽變后的為津柳早紅桃。
[0034]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果如下:
[0035]1、本發(fā)明通過(guò)將表觀判`斷與SRAP標(biāo)記技術(shù)、SSR結(jié)合進(jìn)行對(duì)桃是否進(jìn)行了芽變進(jìn)行判斷，通過(guò)表觀判斷后，增加了芽變篩選的幾率，通過(guò)進(jìn)一步兩個(gè)基因水平的篩選，確定了芽變的真是發(fā)生情況，盡早確定有益芽變，進(jìn)行大規(guī)模種植，提高經(jīng)濟(jì)收益。
[0036]2、本發(fā)明通過(guò)凝膠電泳篩選出來(lái)的多態(tài)性、重復(fù)性好的SRAP引物對(duì)mel/em5, me2/eml, me2/em5, me3/em2, me3/em6, me5/em5, me5/em6, me6/em2,和 SSR 引物對(duì) BPPCT001，CPDCT008, BPPCT009, BPPCT020 和 UDP98-411，用于‘小白桃’和‘津柳早紅’基因組 DNA差異檢測(cè)，成功地鑒定了 ‘小白桃’和它的早熟芽變‘津柳早紅’桃，具體操作簡(jiǎn)便、用途廣泛，節(jié)約了大量的人力和物力，便于推廣。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
[0037]圖1為SSR標(biāo)記瓊脂糖凝膠電泳圖(樣品代號(hào):T ‘津柳早紅’，C ‘小白桃’)。
[0038]圖2為SRAP標(biāo)瓊脂糖凝膠記電泳圖(樣品代號(hào):Τ ‘津柳早紅’，C ‘小白桃’)。
【具體實(shí)施方式】:
[0039]下面結(jié)合附圖并通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0040]材料:
[0041]本發(fā)明選取早熟桃品種‘小白桃(Prunus persica cv.Xiaobaitao) ’和它的芽變新品系‘津柳早紅(Prunus persica cv.Jinliuzaohong)’，均來(lái)自天津市學(xué)香果蔬有限公司桃育種圃。
[0042]1、嫁接鑒定
[0043](I) 2004年5月下旬在天津?qū)W香果蔬有限公司果園中發(fā)現(xiàn)一株3年生普通桃樹(shù)(當(dāng)?shù)厮追Q白桃)的一個(gè)主枝背上枝上所結(jié)的2個(gè)果實(shí)表現(xiàn)特別的個(gè)大，且已經(jīng)開(kāi)始上色。而當(dāng)時(shí)全株樹(shù)，包括整個(gè)果園的同一品種中其他的樹(shù)所結(jié)果實(shí)果個(gè)全部很小(按照生物學(xué)特征分析，果實(shí)剛進(jìn)入硬核期)，與當(dāng)時(shí)新發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)果實(shí)所表像的現(xiàn)象差距十分明顯。隨即做好標(biāo)記并進(jìn)行觀察，當(dāng)年8月下旬將生長(zhǎng)特異果實(shí)的枝條進(jìn)行嫁接，當(dāng)時(shí)共嫁接18株樹(shù)。2006年所嫁接的18株樹(shù)全部結(jié)果，且所結(jié)的果實(shí)的各項(xiàng)指標(biāo)與原母枝的結(jié)果性狀基本一致，
[0044]⑵2007年又在這18株樹(shù)中選取生長(zhǎng)比較健壯的2株樹(shù)取芽，開(kāi)始第二代繁殖，當(dāng)年共繁殖300株芽接苗并建成0.2km的小型實(shí)驗(yàn)園。第二代嫁接樹(shù)2008年開(kāi)始結(jié)果。以后經(jīng)過(guò)08-09年2年觀察發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)園中的300株果樹(shù)所結(jié)果實(shí)與原母樹(shù)結(jié)果狀況基本一致。
[0045]⑶在此基礎(chǔ)上2009年8月下旬又在實(shí)驗(yàn)園中選取健壯植株取芽繁殖新苗1200株。當(dāng)年冬季建成三代園0.7km。三代園2012年開(kāi)始結(jié)果，且結(jié)果性狀與原母樹(shù)基本相同。遂初步認(rèn)為此發(fā)現(xiàn)為新的芽變品系。
[0046]2、DNA 提取
[0047]基因組DNA提取按照下述步驟:
[0048]所述的基因組DNA提取方法，包括以下步驟:
[0049](I)取幼嫩葉片0.5-1.0g，去葉脈，加入液氮研磨成很細(xì)的粉末，轉(zhuǎn)入7ml離心管;
[0050](2)加入2.5ml CTAB提取液，放入65°C水浴鍋中，溫浴0.5h，晾至室溫；
[0051](3)加入等體積氯仿-異戊醇混合液(氯仿:異戊醇體積比=24:1)，輕輕地顛倒抽提約0.5h ；
[0052](4)置離心機(jī)中，10000r/`min 離心 20min，
[0053](5)吸取上清液，置新離心管，再加入等體積氯仿-異戊醇混合液(同上)，輕輕地顛倒抽提0.5h ；
[0054](6)重復(fù)步驟⑷；
[0055](7)吸取上清液，置新離心管，加入2.5倍體積無(wú)水乙醇，放入一 20°C冰箱中，沉淀
0.5h ；
[0056](8)置離心機(jī)中，10000r/min 離心 15min ；
[0057](9)倒掉上清液，用70%乙醇400ul洗滌2次，晾至無(wú)乙醇味，加400ul TE溶解，放入-20°C冰箱貯存。
[0058]3、SSR 檢測(cè)
[0059]SSR 引物包括:BPPCT001、BPPCT009、BPPCT015、BPPCTO16, BPPCT020、BPPCT028、BPPCT030、CPPCT008、CPPCTO13, CPPCT022、CPPCT030、UDP98-411、UDP96-019、UDP97-401、UDP96-008。
[0060]PCR 反應(yīng)體系包括:10ng DNA 模板、1.5mmol/L MgCl2、0.15mmol/L dNTPs、
0.55ymol/L 引物、1.0U Taq DNA 聚合酶、I XPCR buffer，反應(yīng)總體積為 10 μ L。
[0061]SSR 標(biāo)記擴(kuò)增程序:95°C預(yù)變性 5min, 94°C lmin、53°C lmin、72°C lmin,共 35 個(gè)循環(huán)；72°C 8min。
[0062](I)按照PCR反應(yīng)體系進(jìn)行試劑混合于PCR小管中。
[0063](2)將(I)中的PCR管放置在熱循環(huán)儀上，按照SSR標(biāo)記擴(kuò)增程序設(shè)定運(yùn)行程序，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。[0064](3)取(2)的產(chǎn)物5 μ L，加入Loading bufferl μ L混勻，用微量移液器加入到
1.5%瓊脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔中，120V電泳35min，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，篩選出多態(tài)性好和重復(fù)性好的SSR引物對(duì)。
[0065]SSR擴(kuò)增結(jié)果分析:
[0066]篩選出來(lái)的多態(tài)性、重復(fù)性好的引物對(duì)BPPCT001, CPDCT008, BPPCT009, BPPCT020和UDP98-411，用于‘小白桃’和‘津柳早紅’基因組DNA差異檢測(cè)。選取的這5對(duì)引物都可以獲得清晰的擴(kuò)增條帶，如圖1所示。BPPCT001、BPPCT020和UDP98-411在兩個(gè)品種中都獲得一條擴(kuò)增產(chǎn)物，但是條帶的長(zhǎng)度不同；而CPDCT008，BPPCT009在兩個(gè)品種中獲得兩條擴(kuò)增產(chǎn)物條帶。因此，這5對(duì)SSR引物可以有效區(qū)分開(kāi)桃芽變。
[0067]4、SRAP 檢測(cè)
[0068]SRAP 引物包括:Mel ~6，Eml ~6。
[0069]PCR 反應(yīng)體系包括:10ng DNA 模板、1.5mmol/L MgCl2、0.15mmol/L dNTPs、
0.55ymol/L 引物、1.0U Taq DNA 聚合酶、I XPCR buffer，反應(yīng)總體積為 10 μ L。
[0070]SRAP標(biāo)記擴(kuò)增程序:SRAP反應(yīng)程序共40個(gè)循環(huán)，94°C預(yù)變性5min ;前5個(gè)循環(huán):94°C變性 lmin，35°C 復(fù)性 lmin，72°C 延伸 Imin ;后 35 個(gè)循環(huán):94°C變性 lmin，50°C 復(fù)性lmin,72°C延伸Imin ;循環(huán)結(jié)束后72°C延伸lOmin。 [0071](I)按照PCR反應(yīng)體系進(jìn)行試劑混合于PCR小管中。
[0072](2)將(I)中的PCR管放置在熱循環(huán)儀上，按照SSR標(biāo)記擴(kuò)增程序設(shè)定運(yùn)行程序，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0073](3)取(2)的產(chǎn)物SyLJnALoading buff erl μ L混勻，用微量移液器加入到
1.5%瓊脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔中，120V電泳35min，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，篩選出多態(tài)性好和重復(fù)性好的SSR引物對(duì)。
[0074]SRAP擴(kuò)增結(jié)果分析:
[0075]篩選出來(lái)的多態(tài)性、重復(fù)性好的引物對(duì)mel/em5, me2/eml, me2/em5, me3/em2, me3/em6, me5/em5, me5/em6, me6/em2,用于‘小白桃’和‘津柳早紅’基因組DNA差異檢測(cè)。其中基因引物名稱中EM同em, ME同me。
[0076]選取的這8對(duì)引物都可以獲得清晰的擴(kuò)增條帶，如圖2所示。mel/em5組，以‘小白桃’基因組DNA為模板未獲得擴(kuò)增條帶，以‘津柳早紅’基因組DNA為模板獲得兩條擴(kuò)增條帶，一條大概在400-500bp之間，另一條在900-1000bp之間；me2/eml組，以‘小白桃’基因組DNA和‘津柳早紅’基因組DNA為模板獲得了一條長(zhǎng)度相同的擴(kuò)增條帶，大概在750bp左右，但以‘津柳早紅’基因組DNA為模板還獲得一條長(zhǎng)度大概在250bp的擴(kuò)增條帶；me2/em5在兩個(gè)模板中都獲得一條長(zhǎng)度在400-500bp之間的擴(kuò)增產(chǎn)物，但以‘津柳早紅’基因組DNA為模板另獲得兩條長(zhǎng)度分別為500-600bp、750bp左右的擴(kuò)增產(chǎn)物；me3/em2組在兩個(gè)模板中都獲得多條擴(kuò)增產(chǎn)物；me2/em5組在兩個(gè)模板中都獲得一條長(zhǎng)度在1000_1200bp之間的擴(kuò)增產(chǎn)物，但以‘津柳早紅’基因組DNA為模板另獲得三條長(zhǎng)度分別為750bp、1500bp、2000bp左右的擴(kuò)增產(chǎn)物；me5/em5組兩個(gè)模板獲得了三個(gè)相同的擴(kuò)增產(chǎn)物，但是以‘小白桃’基因組DNA為模板的另獲得一條100-200bp之間的擴(kuò)增產(chǎn)物；me5/em6組以‘小白桃’基因組DNA為模板多獲得一條擴(kuò)增條帶；me5/em6組，以‘小白桃’基因組DNA為模板未獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，以‘津柳早紅’基因組DNA為模板獲得兩條擴(kuò)增條帶，長(zhǎng)多分別是600-750bp、1000bp 左右。
[0077]因此，這8對(duì)SRAP標(biāo)記可用于桃芽變檢測(cè)。
[0078]表1SSR引物對(duì)
[0079]
【權(quán)利要求】
1.一種桃芽變的鑒定方法，其特征在于:包括以下步驟: 首先進(jìn)行連續(xù)三代嫁接鑒定，觀測(cè)表型性狀的穩(wěn)定性，對(duì)于連續(xù)三代嫁接后，性狀穩(wěn)定的疑似芽變，采集嫩葉和親本的嫩葉，提取基因組DNA，分別用SSR引物和SRAP引物對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳區(qū)分芽變，親本及疑似芽變品種電泳條帶有差異，則疑似芽變品種為芽變； 所述的 SSR 引物包括:BPPCT001、BPPCT009、、BPPCT015、BPPCT016、BPPCT020、BPPCT028、BPPCT030、CPPCT008、CPPCTO13, CPPCT022、CPPCT030、UDP98-411、UDP96-019、UDP97-40UUDP96-008 ； 所述的SRAP引物包括:Mel~6，Eml~6 ; 所述的 PCR 反應(yīng)體系包括:IOng DNA 模板、1.5mmol/L MgC12、0.15mmol/L dNTPs、0.55ymol/L 引物、1.0U Taq DNA 聚合酶、I XPCR buffer，反應(yīng)總體積為 10 μ L ； 所述的PCR擴(kuò)增程序包括: SSR 標(biāo)記擴(kuò)增程序:95°C 預(yù)變性 5min，94°C Imin、53。。Imin、72。。lmin,共 35 個(gè)循環(huán)；72°C 8min ； SRAP標(biāo)記擴(kuò)增程序:SRAP反應(yīng)程序共40個(gè)循環(huán)，94°C預(yù)變性5min ;前5個(gè)循環(huán):94°C變性 lmin，35°C復(fù)性 lmin，72°C延伸 Imin ;后 35 個(gè)循環(huán):94°C變性 lmin，50°C復(fù)性 lmin,72°C延伸Imin ;循環(huán)結(jié)束后72°C延伸lOmin。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的桃芽變的鑒定方法，其特征在于:所述的嫁接鑒定，采用下面的方法進(jìn)行: 采用嫁接繁殖技術(shù)，將疑似芽變枝條的芽嫁接到毛桃砧木上，在整個(gè)生長(zhǎng)季觀測(cè)表型性狀變化，重點(diǎn)觀測(cè)生長(zhǎng)習(xí)性、開(kāi)花結(jié)實(shí)等性狀，連續(xù)進(jìn)行3代嫁接，觀測(cè)表型性狀變異的穩(wěn)定性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的桃芽變的鑒定方法，其特征在于:所述的基因組DNA提取方法，包括以下步驟: ⑴取幼嫩葉片或幼嫩植物材料0.5-1.0g，去葉脈，加入液氮研磨成很細(xì)的粉末，轉(zhuǎn)入7ml離心管； ⑵加入2.5ml CTAB提取液，放入65°C水浴鍋中，溫浴0.5h，晾至室溫； ⑶加入等體積氯仿-異戊醇混合液輕輕地顛倒抽提約0.5h ； ⑷置離心機(jī)中，10000r/min離心20min， (5)吸取上清液，置新離心管，再加入等體積氯仿-異戊醇混合液，輕輕地顛倒抽提0.5h ； (6)重復(fù)步驟⑷； (7)吸取上清液，置新離心管，加入2.5倍體積無(wú)水乙醇，放入一 20°C冰箱中，沉淀0.5h ； (8)置離心機(jī)中，10000r/min離心15min； ⑶倒掉上清液，用70%乙醇400ul洗滌2次，晾至至無(wú)乙醇味，加400ul TE溶解，放入-20°C冰箱貯存。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 所述的桃芽變的鑒定方法，其特征在于:所述氯仿-異戊醇混合液的混合比例為氯仿:異戊醇的體積比=24:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的桃芽變的鑒定方法，其特征在于:所述SRAP引物對(duì)為mel/em5, me2/eml, me2/em5, me3/em2, me3/em6, me5/em5, me5/em6, me6/em2 ； 所述 SSR 引物對(duì)為 BPPCTOOI，CPDCT008, BPPCT009, BPPCT020 和 UDP98-411 ； 所述的 PCR 反應(yīng)體系包括:10ng DNA 模板、1.5mmol/L MgCl2、0.15mmol/L dNTPs、0.55ymol/L 引物、1.0U Taq DNA 聚合酶、I XPCR buffer，反應(yīng)總體積為 10 μ L。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的桃芽變的鑒定方法，其特征在于:所述親本桃為小白桃，芽變后的為津柳 早紅桃。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103820542SQ201410037703
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年1月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月27日
【發(fā)明者】馮濤, 梁發(fā)輝, 盧興霞, 崔雁黎, 于瑋瑋, 李慧, 李愛(ài) 申請(qǐng)人:天津農(nóng)學(xué)院