H10亞型禽流感病毒rt-lamp可視化檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種H10亞型禽流感病毒RT-LAMP可視化檢測試劑盒。本發(fā)明提供了檢測H10亞型禽流感病毒的環(huán)介導等溫擴增引物組，為由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成的引物組A，或由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4組成的引物組B；所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分別為序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。實驗證明，本發(fā)明特異性強、靈敏度高、儀器設備及操作簡單、結果便于觀察，尤其適合在基層獸醫(yī)站、養(yǎng)殖場及邊境口岸進行H10亞型禽流感病毒的快速診斷和早期篩查。
【專利說明】H10亞型禽流感病毒RT-LAMP可視化檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及HlO亞型禽流感病毒RT-LAMP可視化檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]禽流感(Avian Influenza，Al)是禽流行性感冒的簡稱，是由正粘病毒科流感病毒屬A型禽流感流行性感冒病毒引起的一種禽類(家禽和野禽)傳染病。根據(jù)A型流感病毒表面糖蛋白(Hemagglutinin, HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase, NA)的抗原性不同，禽流感病毒(AIV)可進一步分為不同的亞型，目前已發(fā)現(xiàn)有16種HA亞型和9種NA亞型。AIV是一種有包膜、單股負鏈、分節(jié)段的RNA病毒，病毒基因組由8個分節(jié)段負鏈RNA組成。AIV基因組的分節(jié)段特性使得兩種或兩種以上不同亞型流感病毒共同感染一個細胞時，子代病毒在裝配時其核酸片段可能以同源交換的形式發(fā)生基因重排而導致抗原轉變，從而產(chǎn)生能引起大流行的新流行株。HlO亞型AIV為稀有亞型AIV，對該病的研究相對較少，但該HlO亞型AIV近期引起了廣泛的關注。2013年12月6日，江西省南昌市一名73歲女子罹患H10N8甲型禽流感，因呼吸衰竭、休克死亡，這是全球首例人類感染H10N8的死亡案例。2014年I月25日，也是在南昌，又確診一例H10N8亞型禽流感。目前，國內外尚未見有該HlO亞型AIV的檢測方法，因此，建立一種快速、簡便和特異的檢測試劑盒十分迫切，對該病的診斷具有重要意義。
[0003]目前禽流感病毒常采用的檢測方法包括病毒雞胚分離、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、免疫熒光技術(IFA)、逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、實時熒光定量RT-PCR(RRT-PCR)、基因芯片(Gene chips)。傳統(tǒng)的病毒雞胚分離方法準確、簡便，但耗時太長，通常需要兩天到一周的時間；IFA、ELISA快速但需要特殊試劑；RT-PCR、RRT-PCR、Genechips檢測技術快速、靈敏，但都需要特殊儀器和技術人員，且成本較高，不適合在基層推廣使用。
[0004]環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是利用一種具有鏈置換活性和瀑布式核酸擴增功能的Bst DNA聚合酶，在等溫條件下進行核酸的變性和自動循環(huán)的鏈置換核酸擴增反應，整個反應不需要特殊的儀器設備，僅在水浴鍋中就可完成。LAMP技術在目的基因保守區(qū)設計了針對8個特異區(qū)域的6條引物，使擴增反應具有很高的特異性。LAMP反應結果的觀察方法非常簡便，通過濁度儀實時監(jiān)測擴增過程，可通過電腦觀察擴增曲線，不需等到試驗全部結束，即可判定結果，反應結束后可通過觀察反應液的顏色變化，肉眼直接判定結果，對檢測結果進一步的驗證，如無濁度儀，可用水浴鍋代替濁度儀進行反應。由于LAMP反應的擴增效率很高，在少量cDNA存在的條件下就可進行核酸的大量擴增，所以只需要在LAMP反應體系中加入反轉錄酶，通過逆轉錄環(huán)介導等溫擴增反應(RT-LAMP)就可以完成RNA的檢測。RT-LAMP具有簡便、快速、靈敏、特異的優(yōu)勢，只需等溫條件下就可反應，尤其適合在基層開展RT-LAMP試劑盒的應用推廣。RT-LAMP技術中，引物是決定檢測結果靈敏度和特異性的關鍵因素。
【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測HlO亞型禽流感病毒的環(huán)介導等溫擴增引物組。
[0006]本發(fā)明所提供的檢測HlO亞型禽流感病毒的環(huán)介導等溫擴增引物組，為如下引物組A或引物組B:
[0007]所述引物組A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成；所述引物組B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4組成；
[0008]所述引物I (內引物FIP-H10)、所述引物2 (內引物BIP-H10)、所述引物3 (外引物F3-H10)、所述引物4 (外引物B3-H10)、所述引物5 (環(huán)引物LF-H10)和所述引物6 (環(huán)引物LB-H10)的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。
[0009]所述引物組A中，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩爾比具體可為8:8:1:1:4:4 ;所述引物組B中，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩爾比具體可為8:8:1:1。
[0010]在本發(fā)明的一個實施例中，所述引物I (內引物FIP-H10)和所述引物2 (內引物BIP-HlO)在環(huán)介導等溫擴增反應體系中的終濃度均為1.6 μ Μ，所述引物3 (外引物F3-H10)和所述引物4 (外引物Β 3-Η10)在環(huán)介導等溫擴增反應體系中的終濃度均為0.2 μ Μ，所述引物5 (環(huán)引物LF-HlO)和所述引物6 (環(huán)引物LB-HlO)在環(huán)介導等溫擴增反應體系中的終濃度均為0.8 μ Mo
[0011]序列I由44個核苷酸組成，序列2由44個核苷酸組成，序列3由20個核苷酸組成，序列4由20個核苷酸組成，序列5由20個核苷酸組成，序列6由20個核苷酸組成。
[0012]本發(fā)明的第二個目的是提供一種檢測HlO亞型禽流感病毒的逆轉錄環(huán)介導等溫擴增試劑。
[0013]本發(fā)明所提供的檢測HlO亞型禽流感病毒的逆轉錄環(huán)介導等溫擴增試劑，包括鏈置換型DNA聚合酶、甜菜堿、dNTPs、Mg2+、反轉錄酶和如上所述的引物組(引物組A或引物組B)。
[0014]當所述引物組為所述引物組A時，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg2+、所述鏈置換型DNA聚合酶、所述反轉錄酶和所述甜菜堿在所述擴增試劑中的配比為40pmol:40pmol:5pmol:5pmol:20pmol:20pmol:35nmol: 125nmol:8U:5U:20umol。
[0015]當所述引物組為所述引物組B時，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物
4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述鏈置換型DNA聚合酶、所述反轉錄酶和所述甜菜堿在所述擴增試劑中的配比為 40pmol:40pmol:5pmol:5pmol:35nmol: 125nmol:8U:5U:20 μ mo I。
[0016]在本發(fā)明中，所述鏈置換型DNA聚合酶具體可為Bst DNA聚合酶大片段或Bst DNA
聚合酶。
[0017]在本發(fā)明的一個實施例中，所述Bst DNA聚合酶大片段具體為New EnglandBiolabs公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為M0275。
[0018]在本發(fā)明中，所述反轉錄酶具體可為AMV反轉錄酶。
[0019]根據(jù)需要，所述檢測HlO亞型禽流感病毒的逆轉錄環(huán)介導等溫擴增試劑還包括熒光顯色劑。
[0020]所述熒光顯色劑可為含有鈣黃綠素和MnCl2的水溶液；所述熒光顯色劑中，所述鈣黃綠素和所述MnCl2的配比可為50μπιΟ1 =Immol0在本發(fā)明的一個實施例中，所述熒光顯色劑具體為含有625 μ mol/L的鈣黃綠素和12.5mmol/L的MnCl2的水溶液。
[0021]進一步，在所述檢測HlO亞型禽流感病毒的逆轉錄環(huán)介導等溫擴增試劑中，所述鈣黃綠素和所述引物I的配比為625pmol:40pmolo
[0022]所述檢測HlO亞型禽流感病毒的逆轉錄環(huán)介導等溫擴增試劑中，還包括10 X等溫反應緩存液。
[0023]所述IOX等溫反應緩存液的溶劑為水，溶質及其濃度如下:200mM Tris-HCl,IOOmM KCl、IOOmM(NH4)2S04、20mM MgS04、l% (體積分數(shù))Triton X-100，各濃度均為相應組分在IOX等溫反應緩存液中的終濃度。
[0024]在本發(fā)明中，所述檢測HlO亞型禽流感病毒的逆轉錄環(huán)介導等溫擴增試劑(每管20 μ L)，組成如下:終濃度均為2.0 μ M的所述引物I和所述引物2、終濃度均為0.25 μ M的所述引物3和所述引物4、終濃度均為1.0 μ M的所述引物5和所述引物6、終濃度為0.4U/μ L的所述Bst DNA聚合酶大片段、終濃度為0.25U/ μ L的所述AMV反轉錄酶、終濃度為
1.75mM的所述dNTPs、終濃度為6.25mM的MgSO4、終濃度為1.0M的所述甜菜堿、終濃度為
31.25 μ M的所述鈣黃綠素、終濃度為0.625mM的所述MnCl2,以及2.5 μ L所述IOX等溫反應緩存液，余量為水。
[0025]更加具體的，在本發(fā)明的一個實施例中，所述檢測HlO亞型禽流感病毒的逆轉錄環(huán)介導等溫擴增試劑(每管20 μ L)，組成如下:引物組A預混液I μ L (所述引物I濃度為40 μ Μ、所述引物2濃度為40 μ Μ、所述引物3濃度為5 μ Μ、所述引物4濃度為5 μ M溶液、所述引物5濃度為20 μ Μ、所述引物6濃度為20μΜ)、2.5yL所述IOX等溫反應緩存液、
Iμ L濃度為8U/ μ L的所述Bst DNA聚合酶大片段溶液、I μ L濃度為5U/ μ L的所述AMV反轉錄酶溶液、3.5 μ L濃度為IOmM的所述dNTPs溶液、5 μ L濃度為25mM的MgSO4溶液、4 μ L濃度為5Μ的所述甜菜堿溶液、I μ L濃度為625 μ M的所述鈣黃綠素溶液，以及I μ L濃度為
12.5mM的MnCl2溶液。各溶液的溶劑均為水。
[0026]本發(fā)明的第三個目的是提供一種檢測HlO亞型禽流感病毒的逆轉錄環(huán)介導等溫擴增試劑盒。
[0027]本發(fā)明所提供的檢測HlO亞型禽流感病毒的逆轉錄環(huán)介導等溫擴增試劑盒含有如上所述的引物組，或如上所述的試劑。
[0028]進一步，所述檢測HlO亞型禽流感病毒的逆轉錄環(huán)介導等溫擴增試劑盒還可包括陽性對照和陰性對照。其中，陽性對照可為HlO亞型禽流感病毒RNA ;陰性對照可為滅菌超純水。
[0029]另外，所述試劑盒中還包括說明書；所述說明書中記載:向每管20 μ L的所述試劑中加入1-5 μ L的模板RNA，其余以滅菌超純水補足至25 μ L，形成RT-LAMP反應體系。
[0030]在上述檢測HlO亞型禽流感病毒的環(huán)介導等溫擴增引物組或上述檢測HlO亞型禽流感病毒的逆轉錄環(huán)介導等溫擴增試劑或檢測HlO亞型禽流感病毒的逆轉錄環(huán)介導等溫擴增試劑盒中，各引物可分別單獨包裝或按照所述比例混合后共同包裝。
[0031]如下a)或b)的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍:[0032]a)如上所述的引物組在制備所述試劑或所述試劑盒中的應用；
[0033]b)所述引物組，或所述試劑，或所述試劑盒在制備檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有HlO亞型禽流感病毒的產(chǎn)品中的應用。
[0034]應用所述引物組，或所述試劑，或所述試劑盒檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有HlO亞型禽流感病毒的方法，包括如下步驟:用所述引物組，或所述試劑，或所述試劑盒在63°C條件下對所述待測樣品進行時長50min的逆轉錄環(huán)介導等溫擴增反應，之后在800C 5min終止反應。通過實時觀察濁度擴增曲線，判定試驗結果，反應結束后，觀察反應液顏色進一步驗證實驗結果。在反應過程中，通過電腦實時監(jiān)測生成的焦磷酸鎂沉淀，如生成擴增曲線(S型曲線)，判為陽性，如檢測為直線，判為陰性，可較快地判定結果。反應結束后，直接肉眼觀察反應液顏色判定結果，陽性反應液肉眼可見顏色變綠，陰性仍為淺桔色，實現(xiàn)了 RT-LAMP反應結果的可視化觀察同時也避免了打開反應管蓋后引起環(huán)境污染而造成下次實驗的假陽性結果。反應開始之前鈣黃綠素與熒光淬滅劑錳離子結合而不發(fā)熒光，反應液為淺桔色。隨著反應的擴增，產(chǎn)生大量的焦磷酸根離子，而焦磷酸根離子更易與錳離子結合從而釋放了鈣黃綠素。游離的鈣黃綠素就可自發(fā)熒光，鎂離子還可以加強這種熒光效果。如無濁度儀，可以水浴鍋代替濁度儀，反應結束后，通過肉眼觀察反應液顏色，直接判定結果O
[0035]在本發(fā)明中，以上所有的所述HlO亞型禽流感病毒均可為H10N3型禽流感病毒或H10N7型禽流感病毒。
[0036]更加具體的，在本發(fā)明是一個實施例中，所述H10N3亞型禽流感病毒具體為禽流感病毒毒株A/duck/HK/876/80 (H10N3);所述H10N7型禽流感病毒具體為禽流感病毒毒株A/Turkey/MN/24838-590/79(H10N7)。
[0037]實驗證明，本`發(fā)明提供的檢測HlO亞型禽流感病毒的環(huán)介導等溫擴增引物組、試劑和試劑盒可特異性地檢測HlO亞型禽流感病毒，而對其它亞型禽流感病毒、呼吸道病原體無交叉反應，針對HlO亞型禽流感病毒HA基因的RT-LAMP方法最少可以檢測到IO2拷貝/μ L的HlO亞型禽流感病毒，RT-LAMP方法對臨床樣品的檢出率與經(jīng)典的雞胚分離方法一致。本發(fā)明特異性強、靈敏度高、儀器設備及操作簡單、結果便于觀察，尤其適合在基層獸醫(yī)站、養(yǎng)殖場及邊境口岸進行HlO亞型禽流感病毒的快速診斷和早期篩查。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1為HlO亞型禽流感病毒的RT-LAMP試劑盒的特異性分析結果。其中，A為擴增曲線；Β為反應后各組反應液的顏色變化。A中，I為Η10Ν3 ；2-9依次為HlNl、Η3Ν2、Η5Ν3、Η6Ν8、Η7Ν2、Η9Ν2、Η11 和陰性對照。B 中，1-9 依次為 Η10Ν3、Η1Ν1、Η3Ν2、Η5Ν3、Η6Ν8、Η7Ν2、Η9Ν2、Η11和陰性對照。
[0039]圖2為HlO亞型禽流感病毒的RT-LAMP試劑盒的靈敏度分析結果。其中，A為擴增曲線；Β為反應后各組反應液的顏色變化。A中，I為IO5拷貝/ μ L的HlO亞型禽流感病毒HA基因靶片段的質粒HlOHA-pGEM-T ；2為IO4拷貝/ μ L的HlO亞型禽流感病毒HA基因靶片段的質粒HlOHA-pGEM-T ；3為IO3拷貝/ μ L的HlO亞型禽流感病毒HA基因靶片段的質粒HlOHA-pGEM-T ；4為IO2拷貝/ μ L的HlO亞型禽流感病毒HA基因靶片段的質粒HlOHA-pGEM-T ;5為10拷貝/ μ L的HlO亞型禽流感病毒HA基因靶片段的質粒HlOHA-pGEM-T ；6為陰性對照。B中，1-6依次為IO5拷貝/ μ L、IO4拷貝/ μ L、IO3拷貝/ μ L、IO2拷貝/ μ L、10拷貝/ μ L的HlO亞型禽流感病毒HA基因靶片段的質粒H10HA-pGEM-T，以及陰性對照。
【具體實施方式】
[0040]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0041]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0042]AMV反轉錄酶、dNTPs購自大連寶生物公司；膠回收試劑盒購自北京全氏金公司；Bst DNA聚合酶(大片段)購自New England Biolabs公司；!\%304和甜菜堿(Betaine)購自Sigma公司。
[0043]禽流感病毒毒株A/duck/HK/876/80(H10N3):記載在“XieZ7Pang Y S，Liu J，etal.A multiplex RT-PCR for detection of type a influenza virus and differentiation ofavianH5, H7and H9hemagglutinin subtypes[J].Mol Cell Probes，2006，20 (3-4):245_249”—文中，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。
[0044]禽流感病毒毒株A/Duck/Guangxi/030D/2009 (HlNl)、A/Duck/Guangxi/N42/2009 (H3N2)、A/Turkey/CA/35621/84 (H5N3)、A/Turkey/0ntario/63 (H6N8)、A/Chicken/NY/273874/03 (H7N2)、A/Duck/Guangxi/RX/09(H9N2)、A/Chicken/Guangxi/43C/09 (Hll)、A/Mallard/Alberta/77 (H2N3)、A/Duck/Guangxi/047D16/2010 (H3)、A/Duck/Guangxi/027D/2009 (H4)、A/Turkey/GA/209092/02 (H5N2)、A/waterfowl/GA/269452-56/03 (H5N7)、A/Turkey/WI/68 (H5N9)、A/Turkey/0ntario/6118/67 (H8N4)、A/Turkey/MN/24838-590/79 (H10N7)、A/Duck/Alberta/60/76 (H12N5)、A/Gull/MD/704/77 (H13N6)、A/Duck/Australia/341/83 (H15N8)，以及新城疫病毒 Newcastle diseasevirus (NDV) (Lasota)、傳染性支氣管炎病毒 Infectious bronchitis virus (IBV) (M41)、傳染性喉氣管炎病毒 Infectious Laryngotracheitis virus( ILTV)和雞毒支原體(Mycoplasmagallisepticum) (S6):均記載在 “Yi Peng, et al.Visual detection of H3subtype avianinfluenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplificationassay.Virology Journal2011, 8:337” 一文中，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。
[0045]實施例1、檢測HlO亞型禽流感病毒的環(huán)介導等溫擴增試劑盒的制備及使用方法
[0046]一、檢測HlO亞型禽流感病毒的環(huán)介導等溫擴增引物組的制備
[0047]本實施例的檢測HlO亞型禽流感病毒的環(huán)介導等溫擴增引物組，由內引物FIP-H10、內引物BIP-H10、外引物F3-H10、外引物B3-H10、環(huán)引物LF-H10和環(huán)引物LB-H10組成。這六條引物是本發(fā)明的發(fā)明人通過比較分析大量的HlO亞型禽流感病毒的HA基因序列后設計得到的，它們的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6 (表1)。
[0048]表1RT-LAM P引物序列
[0049]
【權利要求】
1.檢測HlO亞型禽流感病毒的環(huán)介導等溫擴增引物組，為引物組A或引物組B;所述引物組A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成；所述引物組B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4組成； 所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。
2.根據(jù)權利要求1所述的引物組，其特征在于:所述引物組A中所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩爾比為8:8:1:1:4:4 ;所述引物組B中所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩爾比為8:8:1:1。
3.檢測HlO亞型禽流感病毒的逆轉錄環(huán)介導等溫擴增試劑，包括鏈置換型DNA聚合酶、甜菜堿、dNTPs、Mg2+、反轉錄酶和權利要求1或2所述的引物組。
4.根據(jù)權利要求3所述的試劑，其特征在于:所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg2+、所述鏈置換型DNA聚合酶、所述反轉錄酶和所述甜菜堿在所述擴增試劑中的配比為40pmol:40pmol:5pmol:5pmol:20pmol:20pmol:35nmol: 125nmol:8U:5U:20 μ moI ;或 所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述鏈置換型DNA聚合酶、所述反轉錄酶和所述甜菜堿在所述擴增試劑中的配比為40pmol:40pmol:5pmol:5pmol:35nmol: 125nmol:8U:5U:20umol。
5.根據(jù)權利要求3或4所述的試劑，其特征在于:所述鏈置換型DNA聚合酶為BstDNA聚合酶大片段或Bst DNA聚合酶。
6.根據(jù)權利要求3-5中任一所述的試劑，其特征在于:所述反轉錄酶為AMV反轉錄酶。
7.根據(jù)權利要求3-6中任一所述的試劑，其特征在于:所述試劑還包括熒光顯色劑。
8.根據(jù)權利要求7所述的試劑，其特征在于:所述熒光顯色劑為含有鈣黃綠素和MnCl2的水溶液； 所述突光顯色劑中，所述鈣黃綠素和所述MnCl2的配比為50μηιο1: Immol0
9.檢測HlO亞型禽流感病毒的逆轉錄環(huán)介導等溫擴增試劑盒，其特征在于:所述試劑盒含有權利要求1或2所述引物組，或權利要求3-8中任一所述的試劑。
10.如下a)或b)的應用: a)權利要求1或2所述的引物組在制備權利要求3-8中任一所述試劑或權利要求9所述試劑盒中的應用； b)權利要求1或2所述的引物組，或權利要求3-8中任一所述的試劑，或權利要求9所述的試劑盒在制備檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有HlO亞型禽流感病毒的產(chǎn)品中的應用。
【文檔編號】C12Q1/70GK103820577SQ201410066340
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年2月26日 優(yōu)先權日:2014年2月26日
【發(fā)明者】謝芝勛, 羅思思, 劉加波, 龐耀珊, 鄧顯文, 謝志勤, 謝麗基, 范晴 申請人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所