一種附子多糖誘導(dǎo)nkt細(xì)胞增殖的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了中藥附子多糖誘導(dǎo)自然殺傷T細(xì)胞(Nature?Killer?T?cell，NKT)增殖的培養(yǎng)方法，其中包括如下特征：人外周血、骨髓或臍帶血來源的單個核細(xì)胞，在中藥附子多糖和人重組白介素2條件下連續(xù)培養(yǎng)，獲得大量自然殺傷T細(xì)胞，表達(dá)NK1.1+和CD8+，并分泌干擾素γ，在第14天時占淋巴細(xì)胞的比例16.15％以上，數(shù)量級可達(dá)5×109以上；具有有效的抗腫瘤和抗病毒功能。本發(fā)明還提供了一種含通過上述方法而得到的NKT細(xì)胞的臨床應(yīng)用。
【專利說明】一種附子多糖誘導(dǎo)NKT細(xì)胞增殖的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種附子多糖誘導(dǎo)自然殺傷T細(xì)胞增殖的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明涉及的采用人外周血、骨髓或臍帶血經(jīng)體外分離純化獲得的單個核細(xì)胞，在中藥附子多糖和人重組白介素2條件下連續(xù)培養(yǎng)，簡便地獲得大量的NKT細(xì)胞，表達(dá)NKl.1+和CD8+，并分泌IFN-Y，具有抗腫瘤和抗病毒的功能，可用于各類癌癥包括實體瘤和血液腫瘤在內(nèi)，以及多種病毒感染的多個療程的免疫治療。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫細(xì)胞抗腫瘤抗病毒已在臨床上得到廣泛的應(yīng)用，特別是細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞，沒有目前常規(guī)治療帶來的毒副作用，其相對安全，保證了患者的生活品質(zhì)和尊嚴(yán)。構(gòu)成機體免疫系統(tǒng)的淋巴細(xì)胞中，除T、B、NK細(xì)胞外，還存在一種新的細(xì)胞系-NKT細(xì)胞。這種細(xì)胞不僅其本身具有抗腫瘤、抗病毒和抑制自身免疫性疾病的功效，而且還能刺激T、NK等免疫細(xì)胞的活性，增強其細(xì)胞毒效應(yīng)，抑制GVHD的發(fā)生。NKT細(xì)胞疫苗多療程治療對患者療效和生存期有著明顯的幫助，并得到臨床上認(rèn)可。
[0003]目前，獲得NKT細(xì)胞的來源主要為從患者外周血或骨髓中分離出單個核細(xì)胞，在多種細(xì)胞因子單獨或組合誘導(dǎo)作用下，如重組人白介素2、重組人白介素15、重組人白介素
4、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、重組人白介素12、重組人白介素18,或與α-半乳糖神經(jīng)鞘胺醇(a -Galcer)聯(lián)合誘導(dǎo)作用，得到NKl.1+和TCR β +的NKT細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量級為5Χ IO8個左右，僅滿足1-2次的臨床治療，很大程度上影響了給患者的治療，而且多療程治療時需要再次采血，給予患者很大的精神壓力。
[0004]附子多糖對免疫系統(tǒng)有重要的調(diào)節(jié)作用，不僅能激活T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、細(xì)胞毒細(xì)胞和LAK，能有效促使樹突狀細(xì)胞成熟，還能促進(jìn)白介素、腫瘤壞死因子α、集落刺激因子和干擾素等細(xì)胞因子的生成。本發(fā)明通過人外周血、骨髓或臍帶血中白細(xì)胞，經(jīng)體外純化獲得的單個核細(xì)胞，應(yīng)用附子多糖和重組白介素2聯(lián)合連續(xù)培養(yǎng)，簡便地獲得大量的NKl.1+和⑶8+ΝΚΤ細(xì)胞，并分泌IFN- Y。這樣不僅可以滿足多療程NKT細(xì)胞免疫治療，持續(xù)發(fā)揮NKT細(xì)胞的免疫功能，有助于提高臨床療效和延長患者生存期，而且應(yīng)用附子多糖可以大大降低成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]現(xiàn)有技術(shù)主要通過從人外周血、骨髓或臍帶血中分離純化出單個核細(xì)胞，一般為20毫升到300毫升， 在多種細(xì)胞因子單獨或組合誘導(dǎo)作用下，如重組人白介素2、重組人白介素15、重組人白介素4、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、重組人白介素12、重組人白介素18，或與α-半乳糖神經(jīng)鞘胺醇(a-Galcer)聯(lián)合誘導(dǎo)作用，連續(xù)培養(yǎng)獲得NKT細(xì)胞，其數(shù)量是有限的，僅為5X IO8個細(xì)胞左右。若一次NKT細(xì)胞疫苗治療至少使用5X IO8個細(xì)胞，最多能滿足1-2次的治療。另外，NKT細(xì)胞激活后可通過分泌IL-4和IFN- Y調(diào)節(jié)Th細(xì)胞的分化，從而實現(xiàn)對免疫應(yīng)答和自身免疫的調(diào)節(jié)。因而，為了實現(xiàn)NKT細(xì)胞的抗腫瘤、抗病毒的免疫應(yīng)答，還需要促使NKT細(xì)胞分泌IFN- Y，發(fā)揮Thl的細(xì)胞免疫應(yīng)答作用。
[0006]NKT細(xì)胞能對外源性快速增殖的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷，NKT細(xì)胞需要持續(xù)地進(jìn)行加強，維持對機體“非我”的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷，有效地抑制腫瘤細(xì)胞的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因而NKT細(xì)胞疫苗在臨床應(yīng)用中需要進(jìn)行多次治療，更好地提高患者臨床療效和延長生存期。通過現(xiàn)有技術(shù)獲得的NKT細(xì)胞數(shù)量，沒法完成患者的多次的治療和保證患者的長期療效。
[0007]附子多糖具有促進(jìn)B、T淋巴細(xì)胞增殖的作用，并促使人白細(xì)胞分泌干擾素Y、腫瘤壞死因子α等，促使淋巴細(xì)胞向Thl細(xì)胞分化，而介導(dǎo)免疫應(yīng)答。本發(fā)明技術(shù)通過人外周血、骨髓和臍帶血經(jīng)體外純化獲得單個核細(xì)胞，經(jīng)附子多糖和IL-2共同刺激作用，簡便地增殖獲得大量的NKT細(xì)胞，數(shù)量級可大于5 X IO9以上，每次治療時使用0.5 X IO9NKT細(xì)胞，可用于多達(dá)5次以上。同時NKT細(xì)胞可表達(dá)NKl.1+和⑶8+，分泌IFN-Y，可產(chǎn)生對腫瘤細(xì)胞的Thl細(xì)胞免疫應(yīng)答。
[0008]本發(fā)明涉及一種中藥附子多糖誘導(dǎo)自然殺傷T細(xì)胞增殖的制備方法，其特征在于，包括如下工序:人外周血、骨髓或臍帶血來源的單個核細(xì)胞，在中藥附子多糖和人重組白介素2條件下連續(xù)培養(yǎng)，獲得大量自然殺傷T細(xì)胞，表達(dá)NKl.1+和⑶8+，并分泌干擾素Y，在第14天時占淋巴細(xì)胞的比例12.61%以上，酶聯(lián)免疫斑點檢測干擾素Y為30個以上，數(shù)量級可達(dá)5 X IO9以上；具有有效的抗腫瘤和抗病毒的Thl細(xì)胞免疫應(yīng)答功能。
[0009]采集的約50mL人外周血進(jìn)行體外分離純化，去除紅細(xì)胞、血小板和粒細(xì)胞等，獲得單個核細(xì)胞，單個核細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基重懸，苔盼蘭染色計數(shù)，使用RPMI1640完全培養(yǎng)基(含 lug/mL-1000ug/mL 附子多糖，lIU-400IU/mL IL-2,10% (v/v)胎牛血清)調(diào)整到細(xì)胞濃度為1-5X106/mL，將細(xì)胞培養(yǎng)液放置到75cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶30ml，于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0010]于第3、6、9、11、13、15、17天補充一倍體積的新鮮RPMI1640完全培養(yǎng)基(含Iug/mL-1000ug/mL 附子多糖，lIU-400IU/mLIL-2,10% (v/v)胎牛血清)，培養(yǎng)到第 14、16 和 18天收獲NKT細(xì)胞；
[0011]優(yōu)選地，本發(fā)明所述方法為:誘導(dǎo)培養(yǎng)NKT細(xì)胞使用的RPMI1640完全培養(yǎng)基優(yōu)選為含有 10ug/mL-500ug/mL 附子多糖，5IU-200IU/mL IL-2,10% (v/v)胎牛血清。
[0012]將所述的NKT細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活率、細(xì)胞表型和干擾素Y酶聯(lián)免疫斑點檢測，細(xì)胞活率達(dá)到98%以上;其表達(dá)NKl.1+和CD8+分子，其中，NKl.1+和CD8+細(xì)胞為大于12.61%,干擾素Y酶聯(lián)免疫斑點檢測為30個以上。
[0013]培養(yǎng)到第7-12天收獲的NKT細(xì)胞均可用于凍存，即將獲得NKT細(xì)胞苔盼蘭計數(shù)，5 X IO7個NKT細(xì)胞凍存1毫升，凍存管放置程序降溫盒中，放入_80°C超低溫冰箱過夜，第二天轉(zhuǎn)至液氮凍存。NKT可在需要時復(fù)蘇進(jìn)行增殖培養(yǎng)，仍可保持同樣的細(xì)胞活率、細(xì)胞表型以及分泌干擾素Y，促使Thl細(xì)胞免疫應(yīng)答的功能。
[0014]優(yōu)選地，本發(fā)明所述方法為:培養(yǎng)到第7天收獲的NKT細(xì)胞均可用于凍存。
[0015]其中，優(yōu)選的細(xì)胞活率檢測方法為:計算培養(yǎng)到第14天的活細(xì)胞數(shù)。取ImL培養(yǎng)的培養(yǎng)液，1000rpm、4°C下離心10分鐘，細(xì)胞用培養(yǎng)基重懸，取20ul細(xì)胞液用IXPBS稀釋20倍，稀釋液加入I倍體積的苔盼蘭溶液，混勻后加入到細(xì)胞計數(shù)板，于倒置顯微鏡下觀察計數(shù)，藍(lán)色染色的為死細(xì)胞，不染色的為活細(xì)胞，細(xì)胞活率達(dá)到98%以上。
[0016]優(yōu)選的細(xì)胞表型檢測方法為:取苔盼蘭染色計數(shù)后的2X IO6細(xì)胞，分兩組，第一組分別添加到有20 μ L FITC標(biāo)記鼠抗人⑶8單抗和20 μ L PE標(biāo)記鼠抗人NKl.1單抗；第二組為同型對照，分別添加到有20 μ L FITC標(biāo)記鼠IgGl和20 μ L PE標(biāo)記鼠IgGl (BD公司)。置于4°C冰箱染色30分鐘，然后用ImL的IX磷酸鹽緩沖液洗滌三次，最后用0.5mL的IXPBS重懸洗滌后的細(xì)胞，所得洗滌后的細(xì)胞用FACSCalibur基本型流式細(xì)胞儀檢測。經(jīng)檢測，NKl.1+/CD8+細(xì)胞為 12.61%, NKl.1+細(xì)胞為 15.72%, CD8+細(xì)胞為 52.23%.檢測結(jié)果表明通過本發(fā)明所述方法得到的細(xì)胞為NKT細(xì)胞具有表達(dá)其典型的表型。
[0017]NKT細(xì)胞通過斑點酶聯(lián)反應(yīng)試劑盒(美國R&D公司)檢測干擾素Y分泌水平，NKT細(xì)胞形成很多IFN-Y的酶聯(lián)斑點，表明其能分泌IFN-Y的能力，從而引發(fā)Thl細(xì)胞的免疫應(yīng)答。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1表示本發(fā)明附子多糖誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的NKT細(xì)胞的流式細(xì)胞圖(FLl通路為FITC-CD8，F(xiàn)L2 通路為 PE-NK1.1)；
[0019]圖2表示本發(fā)明附子多糖誘導(dǎo)培養(yǎng)的NKT細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點試驗檢測干擾素Y分泌結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0020]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)通過中藥附子多糖聯(lián)合白介素2對人外周血、骨髓或臍帶血經(jīng)體外純化的單個核細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，可簡便地增殖獲得大量的NKT細(xì)胞，數(shù)量級可大于5X 109，若每次治療時使用0.5X IO9NKT細(xì)胞，`可用于多達(dá)5次以上。同時NKT細(xì)胞可表達(dá)NKl.1+和CD8+，分泌IFN-Y，可產(chǎn)生對腫瘤細(xì)胞的Thl細(xì)胞免疫應(yīng)答獲得特異的NKT細(xì)胞疫苗，可用于多達(dá)13次以上與3個療程以上的臨床應(yīng)用。
[0021]對本發(fā)明涉及的一種大規(guī)模培養(yǎng)NKT細(xì)胞疫苗的制備方法進(jìn)行具體說明。本發(fā)明涉及采用血細(xì)胞分離機通過采集人外周血中白細(xì)胞，經(jīng)體外分離純化獲得大量的單個核細(xì)胞，在人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和白介素4誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得大量未成熟NKT細(xì)胞；未成熟NKT細(xì)胞負(fù)載腫瘤特異抗原后，并在腫瘤壞死因子α與脂多糖誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下獲得具有抗腫瘤作用的成熟NKT細(xì)胞疫苗。
[0022]本發(fā)明涉及中藥附子多糖誘導(dǎo)自然殺傷T細(xì)胞增殖的制備方法，其特征在于，包括如下工序:人外周血、骨髓或臍帶血來源的單個核細(xì)胞，在中藥附子多糖和人重組白介素2條件下連續(xù)培養(yǎng)，獲得大量自然殺傷T細(xì)胞，表達(dá)NKl.1+和⑶8+，并分泌干擾素Y，在第14天時占淋巴細(xì)胞的比例12.61%以上，數(shù)量級可達(dá)5Χ109以上，干擾素、酶聯(lián)免疫斑點檢測為30個以上；具有有效的抗腫瘤和抗病毒的Thl細(xì)胞免疫應(yīng)答功能。
[0023]采集的約50mL人外周血進(jìn)行體外分離純化，去除紅細(xì)胞、血小板和粒細(xì)胞等，獲得單個核細(xì)胞，單個核細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基重懸，苔盼蘭染色計數(shù)，使用RPMI1640完全培養(yǎng)基(含 lug/mL-1000ug/mL 附子多糖，lIU-200IU/mL IL-2,10% (v/v)胎牛血清)調(diào)整到細(xì)胞濃度為1-5X106/mL，將細(xì)胞培養(yǎng)液放置到75cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶30ml，于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0024]于第3、6、9、11、13、15、17天補充一倍體積的新鮮RPMI1640完全培養(yǎng)基(含Iug/mL-1000ug/mL 附子多糖，lIU-200IU/mLIL-2,10% (v/v)胎牛血清)，培養(yǎng)到第 14、16 和 18天收獲NKT細(xì)胞；
[0025]優(yōu)選地，本發(fā)明所述方法為:誘導(dǎo)培養(yǎng)NKT細(xì)胞使用的RPMI1640完全培養(yǎng)基優(yōu)選為含有 10ug/mL-500ug/mL 附子多糖，5IU-200IU/mL IL-2,10% (v/v)胎牛血清。
[0026]將所述的NKT細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活率、細(xì)胞表型和干擾素Y酶聯(lián)免疫斑點檢測，細(xì)胞活率達(dá)到98%以上;其表達(dá)NKl.1+和CD8+分子，其中，NKl.1+和CD8+細(xì)胞為大于12.61%,干擾素Y酶聯(lián)免疫斑點檢測為30個以上。
[0027]培養(yǎng)到第7-12天收獲的NKT細(xì)胞均可用于凍存，即將獲得NKT細(xì)胞苔盼蘭計數(shù)，5 X IO7個NKT細(xì)胞凍存I毫升，凍存管放置程序降溫盒中，放入_80°C超低溫冰箱過夜，第二天轉(zhuǎn)至液氮凍存。NKT可在需要時復(fù)蘇進(jìn)行增殖培養(yǎng)，仍可保持同樣的細(xì)胞活率、細(xì)胞表型以及分泌干擾素Y，促使Thl細(xì)胞免疫應(yīng)答的功能。
[0028]優(yōu)選地，本發(fā)明所述方法為:培養(yǎng)到第7天收獲的NKT細(xì)胞均可用于凍存。
[0029]作為本發(fā)明制造方法中使用的細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)袋，可例舉，為75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶、175cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶、250mL細(xì)胞培養(yǎng)袋等細(xì)胞培養(yǎng)用器材(容器)，均可用于本發(fā)明，優(yōu)選細(xì)胞培養(yǎng)袋。
[0030]本發(fā)明的制造方法中對NKT細(xì)胞進(jìn)行凍存，對凍存液無特殊限制，但優(yōu)選例如為50%小牛血清、40%細(xì)胞培養(yǎng)液和10%二甲基亞砜，其中細(xì)胞培養(yǎng)液更優(yōu)選為NKT細(xì)胞培養(yǎng)液。
`[0031]在培養(yǎng)基中可以添加血清或血漿進(jìn)行培養(yǎng)。它們在培養(yǎng)基中的添加量不受特殊限制，如大于O容量％至20容量％，且可以根據(jù)不同的培養(yǎng)階段而改變血清或血漿的用量，優(yōu)選為5% (體積比)。例如，可以階段性減少血清或血漿濃度來使用。另外，作為血清或血衆(zhòng)的來源，可以是自己(意味著與所培養(yǎng)的細(xì)胞來源相同)或非自己(意味著與所培養(yǎng)的細(xì)胞的來源不同)中的任一種，從安全性的觀點出發(fā)，優(yōu)選自己來源的血清或血漿。另外，也可以添加如人血清白蛋白之類經(jīng)分離純化的血清成分。
[0032]本發(fā)明的中藥附子多糖誘導(dǎo)NKT細(xì)胞增殖的制備使用上述各種成分及培養(yǎng)基來實施。本發(fā)明中使用的培養(yǎng)培養(yǎng)條件也沒有特殊限制，可以使用通常的細(xì)胞培養(yǎng)中使用的條件。例如，可在37°C、5% C02等條件下培養(yǎng)。還可以實施如下等操作:間隔適當(dāng)?shù)臅r間添加新鮮培養(yǎng)基來稀釋細(xì)胞培養(yǎng)液，或更換培養(yǎng)基，或更換細(xì)胞培養(yǎng)用器材等。
[0033]本發(fā)明還提供NKT細(xì)胞在臨床應(yīng)用中多次多療程的抗腫瘤治療，更好地在生物體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤免疫應(yīng)答，達(dá)到很好的治療效果。此外，上述NKT細(xì)胞還具有如下優(yōu)點，多次多療程NKT細(xì)胞治療將更好地引發(fā)Thl細(xì)胞免疫應(yīng)答，產(chǎn)生高效、長效地抗腫瘤免疫效應(yīng)，因此非常利于患者療效的提聞和生存期的延長。
[0034]以下，結(jié)合實施例對本發(fā)明做更具體的描述，但本發(fā)明不限于此。
[0035]實施例一
[0036]人外周血來源單個核細(xì)胞培養(yǎng)獲得NKT細(xì)胞
[0037]乳腺癌患者，女，24歲，血常規(guī)檢測結(jié)果為3.7 X IO9個白細(xì)胞/升，采集患者50ml外周血(與該患者簽署知情同意書)；采集的外周血1500rpm離心10分鐘，收集上層血漿，并在56°C水浴鍋中滅活30分鐘后，3000rpm離心10分鐘獲得自體血漿，備用。血細(xì)胞溶液用I倍體積的I XPBS (pH = 7.4)重懸后，加入1/4的0.6%羥乙基淀粉的生理鹽水，混勻后靜置30分鐘，盡量吸取白色細(xì)胞層；白色細(xì)胞層經(jīng)Ficoll-Hypaque密度梯度離心，得到單個核細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基重懸，苔盼蘭染色計數(shù)為1.62X 108。
[0038]外周血單個核細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整到細(xì)胞濃度為3X106，培養(yǎng)基含有150ug/mL附子多糖，20IU/mL IL-2和10% (v/v)胎牛血清，加入到75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶(康寧公司)中，在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中孵育；在培養(yǎng)到第三天時補充I倍體積新鮮RPMI1640培養(yǎng)基，該新鮮培養(yǎng)基含150ug/mL附子多糖，20IU/mL IL-2和體積比10% (v/v)胎牛血清。
[0039]連續(xù)培養(yǎng)到第6天，將NKT細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至250mL細(xì)胞培養(yǎng)袋中，補充I倍體積的新鮮RPMI1640完全培養(yǎng)基(含150ug/mL附子多糖，20IU/mLIL-2，10% (v/v)胎牛血清)，繼續(xù)于37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于第9、11、13、15、17天補充I倍體積的新鮮RPMI1640完全培養(yǎng)基(含150ug/mL附子多糖，20IU/mLIL-2，10% (v/v)胎牛血清)，培養(yǎng)到第14、16和18天收獲NKT細(xì)胞。
[0040]培養(yǎng)到第7天取其中I瓶NKT細(xì)胞，收獲NKT細(xì)胞，苔盼蘭計數(shù)，數(shù)量為18.7 X IO7,NKT細(xì)胞可凍存起來，50 X IO6個NKT細(xì)胞凍存I毫升，凍存管放置程序降溫盒中，放入_80°C超低溫冰箱過夜，第二天轉(zhuǎn)至液氮凍存，以備用。
[0041]計算培養(yǎng)到第14天的活細(xì)胞數(shù)。取ImL最后一天培養(yǎng)的培養(yǎng)液，1000rpm、4°C下離心10分鐘，細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基重懸，取20 μ L細(xì)胞液用lXPBS(pH7.4)稀釋20倍，稀釋液加入I倍體積的苔盼蘭溶液，混勻后加入到細(xì)胞計數(shù)板，于倒置顯微鏡下觀察計數(shù)，藍(lán)色染色的為死細(xì)胞，不染色的為活細(xì)胞，細(xì)胞活率達(dá)到98%以上。
[0042]取苔盼蘭染色計數(shù)后的2 X IO6細(xì)胞，分兩組，第一組分別添加到有20 μ LFITC標(biāo)記鼠抗人⑶8單抗和20 μ L PE標(biāo)記鼠抗人NKl.1單抗；第二組為同型對照，分別添加到有20 μ L FITC標(biāo)記鼠IgGl和20 μ L PE標(biāo)記鼠IgGl (BD公司)。置于4°C冰箱染色30分鐘，然后用ImL的IX磷酸鹽緩沖液洗滌三次，最后用0.5mL的I XPBS重懸洗滌后的細(xì)胞，所得洗滌后的細(xì)胞用FACSCalibur基本型流式細(xì)胞儀檢測。經(jīng)檢測流式細(xì)胞結(jié)果見圖一(FLl通路為 FITC-CD8，F(xiàn)L2 通路為 PE-NK1.1) ,NKl.1+/CD8+細(xì)胞為 12.61%, NKl.1+細(xì)胞為 15.72%,CD8+細(xì)胞為52.23%。檢測結(jié)果表明通過本發(fā)明所述方法得到的細(xì)胞為NKT細(xì)胞具有表達(dá)其典型的NKl.1+表型。
[0043]實施例二
[0044]酶聯(lián)免疫斑點實驗(Elispot)檢測NKT細(xì)胞分泌IFN- Y水平
[0045]用IFN-gamma 抗體包被 Elispot96_ 孔板:
[0046]在5ml PBS 中力卩入 lmg/mL 的抗人 IFN-Y 抗體 R4_6A2 (Pharmingen 公司-18181D) 25ul，使?jié)舛冗_(dá)5ug/ml，每孔加入50ul，加蓋4°C過夜。棄去包被抗體，用含10 %胎牛血清的完全培養(yǎng)基(RPM1-10)洗滌一次，每孔加入200ul完全培養(yǎng)基，加蓋于室溫封閉2小時，棄去培養(yǎng)基。
[0047]NKT細(xì)胞激活:
[0048](I)取培養(yǎng)到第14天NKT細(xì)胞，胎盤藍(lán)計數(shù)，用R-5無酚紅培養(yǎng)基稀釋3個稀釋度(1X106、3.3X105和1X105)。分別加入到IFNi抗體包被Elispot96孔板中，使每孔體積為IOOul。
[0049](2)實驗組每孔加入IOOul含MHC-1限制性9肽(終濃度為lug/ml儲存濃度Iug/ul，應(yīng)為 1: 500 稀釋)的 R1640-10。
[0050](3)對照組每孔加入IOOul培養(yǎng)基。[0051](4)陰性對照加入培養(yǎng)基。
[0052]混勻于37 °C，5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。
[0053]ELISP0T試劑盒操作:
[0054](I)用無菌水洗板2次，用I X洗滌緩沖液或PBST洗滌6次，每次洗滌時浸洗I~2min。
[0055](2)將抗體(生物素偶聯(lián)鼠抗人IFN- Y抗體)加至12ml (10組量)的稀釋緩沖液I中，終濃度為2ug/ml。
[0056](3)每孔加入50ul上步混合液，4°C過夜或室溫2小時。
[0057](4)用I X洗滌緩沖液或PBST洗滌3次。
[0058](5)將鏈霉親和素-辣根過氧化酶濃縮液A(BD公司)加至稀釋緩沖液比值為1: 100，每孔加入50ul混合液。
[0059](6) 4 °C過夜，用PBST洗滌4次，用PBS洗滌2次。[0060](7)每孔加50ul Elispot染色液(AEC底物，貨號:551951, 20ul的色原體(chronogen)加入到ImL的AEC底物溶液中)。
[0061](8)避光室溫放置5-60分鐘，棄去染色液，用蒸餾水洗滌
[0062](9)室溫空氣干燥2小時或過夜干燥，保存數(shù)據(jù)。
[0063]96孔Elispot板通過酶聯(lián)斑點圖像自動分析儀檢測斑點數(shù)，圖2中為酶聯(lián)斑點圖像自動分析儀檢測圖和斑點計數(shù)結(jié)果，左側(cè)為相應(yīng)稀釋度的對照組，無IFN-Y Elispot斑點產(chǎn)生；右側(cè)為3個稀釋度的試驗組，IFN- Y Elispot斑點分別為37個、12個和8個；表明本發(fā)明制備的NKT細(xì)胞能分泌出IFN-Y細(xì)胞因子，在IO6的數(shù)量級是IFN-YElispot斑點可達(dá)到30個以上。
[0064]實施例三
[0065]患者外周血來源NKT細(xì)胞的培養(yǎng)
[0066]患者一:乳腺癌患者，女，34歲，血常規(guī)檢測結(jié)果為6.1 X IO9個白細(xì)胞/升。
[0067]患者一:肝癌患者，男，36歲，血常規(guī)檢測結(jié)果為3.6X109個白細(xì)胞/升。
[0068]患者三:黑色瘤患者，男，56歲，血常規(guī)檢測結(jié)果為7.0XlO9個白細(xì)胞/升。
[0069]患者四:卵巢癌患者，女，45歲，血常規(guī)檢測結(jié)果為6.6X IO9個白細(xì)胞/升。
[0070]患者五:肺癌患者，男，49歲，血常規(guī)檢測結(jié)果為4.7X IO9個白細(xì)胞/升。
[0071]與患者均簽署知情同意書。
[0072]采集患者50mL外周血經(jīng)Ficoll-Hypaque密度梯度離心,得到單個核細(xì)胞。患者一、患者二和患者三按照實施例一的方法中藥附子多糖誘導(dǎo)培養(yǎng)NKT細(xì)胞。
[0073]患者四和患者五外周血來源的單個核細(xì)胞應(yīng)用現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，即使用含100ng/mL α -半乳糖神經(jīng)鞘胺醇(a-Galcer)、50IU/mL白介素2和10% (v/v)胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，使用75cm2培養(yǎng)瓶進(jìn)行擴瓶，并連續(xù)培養(yǎng)到第18天。
[0074]采用苔盼蘭染色計算培養(yǎng)到14天的NKT細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活率，以及NKT細(xì)胞通過流式抗體染色和流式細(xì)胞儀檢測，分析細(xì)胞表型；取IO6個NKT細(xì)胞通過Elispot檢測NKT細(xì)胞分泌IFN-Y水平。
[0075]表一
【權(quán)利要求】
1.中藥附子多糖誘導(dǎo)自然殺傷T細(xì)胞(NatureKiller T cell，NKT)增殖的制備方法，其特征在于人外周血、骨髓或臍帶血來源的單個核細(xì)胞，在中藥附子多糖和人重組白介素2條件下連續(xù)培養(yǎng)，獲得大量自然殺傷T細(xì)胞，表達(dá)NKl.1+和⑶8+，并分泌干擾素Y，在第14天時占淋巴細(xì)胞的比例12.15%以上，數(shù)量級可達(dá)5X IO9以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于人外周血、骨髓或臍帶血經(jīng)體外分離純化，去除紅細(xì)胞、血小板和粒細(xì)胞等，獲得單個核細(xì)胞，單個核細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基重懸，苔盼蘭染色計數(shù)，使用RPMI1640完全培養(yǎng)基(含lug/mL-1000ug/mL附子多糖，lIU-400IU/mL IL-2,10% (v/v)胎牛血清)調(diào)整到細(xì)胞濃度為1_5X 106/mL，將細(xì)胞培養(yǎng)液放置到75cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶30ml，于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 于第3、6、9、11、13、15、17天補充一倍體積的新鮮RPMI1640完全培養(yǎng)基(含Iug/mL-1000ug/mL 附子多糖，IIU-400IU/mLIL-2,10% (v/v)胎牛血清)，培養(yǎng)到第 14、16 和 18天收獲NKT細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，誘導(dǎo)培養(yǎng)NKT細(xì)胞使用的RPMI1640完全培養(yǎng)基優(yōu)選為含有10ug/mL-500ug/mL附子多糖，5IU-200IU/mL IL-2,10% (v/v)胎牛血清。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，將所述的NKT細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖和細(xì)胞表型檢測，苔盼蘭計數(shù)細(xì)胞增殖達(dá)到5X IO9以上；其高表達(dá)NKT細(xì)胞表型NKl.1+和CD8+，并分泌干擾素Y (IFNi)，其中，在第14天NKT細(xì)胞中含NKl.1+和CD8+雙陽性細(xì)胞為12.61%以上，酶聯(lián)免疫斑點檢測干擾素Y為30個以上。
5.權(quán)利要求1-4所述 制備NKT滿足在臨床抗腫瘤、抗病毒治療中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N5/0783GK103834614SQ201410087827
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月12日
【發(fā)明者】金光瑞, 王琳 申請人:甘肅中科生物科技有限公司