一株具有脅迫耐受性的重組釀酒酵母菌株的制作方法
【專利摘要】一株具有脅迫耐受性的重組釀酒酵母菌株（4126-SET5），屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】。該菌株分類命名為Saccharomyces?cerevisiae，菌株的登記入冊編號為CGMCC?No.8724，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期為2014年1月15日。本發(fā)明公開了重組菌株4126-SET5的基因工程構(gòu)建方法，包括基因的獲得、染色體整合載體的構(gòu)建，以及菌株在各種環(huán)境脅迫條件下，包括在含有較高濃度乙酸、過氧化氫、乙醇的平板上和在高溫條件下的生長情況。與整合空載體的對照菌株相比，重組釀酒菌株4126-SET5可以在5g/L乙酸條件下進行快速發(fā)酵，這不僅可以為進一步研究釀酒酵母耐受性機理提供理論支持，還可以作為纖維素乙醇發(fā)酵的良好菌株。
【專利說明】一株具有脅迫耐受性的重組釀酒酵母菌株
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株具有脅迫耐受性的重組釀酒酵母菌株(4126-SET5)，屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]釀酒酵母廣泛應(yīng)用于食品、釀造及生物能源生產(chǎn)等不同領(lǐng)域，良好的細胞活性有利于增加生物量的積累，促進細胞循環(huán)使用，提高發(fā)酵效率，但釀酒酵母在生長和發(fā)酵過程中，尤其是在工業(yè)生產(chǎn)條件下，經(jīng)常受到高濃度乙醇、極端溫度(冷凍或高溫等)，低pH及高滲透壓等環(huán)境脅迫因素的影響，這些環(huán)境脅迫條件抑制細胞生長及代謝，從而影響了生產(chǎn)效率(Journal of Biotechnology, 2009,144:23_30)。因此，釀酒酵母細胞對環(huán)境脅迫因素的反應(yīng)和耐受性機制一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的重點。
[0003]隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展，我國能源短缺問題不斷突出。第二代生物乙醇以纖維素原材料，包括農(nóng)作物秸桿，林業(yè)廢棄物等發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。與第一代生物乙醇不同之處在于，纖維素乙醇避免了與人爭糧，與糧征地的弊端。在纖維素乙醇生產(chǎn)中，原料預(yù)處理過程中產(chǎn)生的弱酸類、醛類和酚類等抑制物對細胞的生長和發(fā)酵具有抑制作用(Biotechnologyfor Biofuels，2009，2:1-11)。為減小抑制劑的影響所采取的一些脫毒策略往往造成糖的損失和生產(chǎn)成本的增加，這在實際生產(chǎn)與經(jīng)濟上是不可行的，因而具有高耐受性的菌株的選育成為必要。近年來，通過細胞全局基因表達分析和各種組學(xué)數(shù)據(jù)分析(Antonievan Leeuwenhoek, 2013,103:1281-1295)，以及對單基因敲除的所有突變體的表型組研究(Microbial Cell Factories, 2010,9:79),對釀酒酵母乙酸耐性的分子機制有了更多新的認識，揭示了很多新的與乙酸毒性的適應(yīng)性反應(yīng)和乙酸耐性提高相關(guān)的基因。本發(fā)明得到的重組釀酒釀酒酵母就是以此獲得，且本菌株具有較強的乙酸耐受性。
[0004]纖維素預(yù)處理的現(xiàn)在多通過物理、化學(xué)和生物方法實現(xiàn)，但是通過化學(xué)、物理方法的預(yù)處理需要消耗太多的能源且處理的過程中產(chǎn)生大量的污染物。生物酶解的過程比較溫和，這一過程需要多種酶的參與，通過內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶把纖維素酶解成酵母細胞能夠利用的糖類。此過程比較復(fù)雜，更重要的是水解產(chǎn)生的糖類對生物酶的活性有明顯的抑制作用，因而同步糖化發(fā)酵(SSF)是必然的一種趨勢，此過程可以減少纖維素乙醇發(fā)酵中的能耗，并且降低菌體污染的可能性。然而在較低的溫度下，纖維素酶的水解效率會非常低，綜合考慮水解和發(fā)酵過程(Biotechnology Advances, 2012, 30:1207 - 1218)，耐高溫酵母是一種必然的需求。本發(fā)明得到的重組釀酒酵母菌株能在較高溫度下良好生長，可用于高溫發(fā)酵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于構(gòu)建一株具有脅迫耐受性的重組釀酒酵母菌株，能在分別含有高濃度乙酸、過氧化氫、乙醇和高溫等環(huán)境脅迫條件下良好生長，并能在較強的環(huán)境脅迫條件下，比如高濃度乙酸條件下具有較高的乙醇發(fā)酵效率。[0006]本發(fā)明涉及一株具有脅迫耐受性的重組釀酒酵母菌株(4126-SET5)，該菌株分類命名為Saccharomyces cerevisiae,菌株的登記入冊編號為CGMCC N0.8724,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2014年01月15日。
[0007]所述菌株SET5基因來源于實驗室模式釀酒酵母S288c，將PCR擴增得到的SET5基因連接到PHO組成型整合表達載體(Applied Energy, 2012, 110:33_40)，線性化后轉(zhuǎn)入工業(yè)釀酒酵母，實現(xiàn)整合表達。
[0008]所述具有脅迫耐受性的重組釀酒酵母菌株(4126-SET5)根據(jù)已有的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，選擇變化顯著的靶點SET5基因，該基因序列的GenBank登錄號為NC_001140.6。PGKl啟動子序列GenBank登錄號為FJ415226.1，CYCl終止子序列GenBank登錄號為EF210198.1。通過基因工程手段在酵母的HO整合載體(NCB1:#AF324728，美國Utah大學(xué)David J.Stillman 惠贈；Nucleic acids research, 2001，29:e59)的基礎(chǔ)上連接 PGKl 強啟動子和CYCl終止子構(gòu)成pHO組成型表達載體。然后把PCR擴增獲得的SET5基因連接在PGKl啟動子和CYCl終止子之間，線性化后電轉(zhuǎn)導(dǎo)入工業(yè)釀酒酵母4126中，進行過表達。導(dǎo)入的質(zhì)粒會在釀酒酵母基因組的HO基因位點(Yeast，1997，13:1563-1573)整合表達。
[0009]本發(fā)明采用釀酒酵母的pHO組成型表達載體進行重組菌株的整合表達，pHO組成型表達載體可以通過同源重組的方式在釀酒酵母的HO基因位點進行整合表達，該載體通過基因工程手段在質(zhì)粒的多克隆位點插入PGKl啟動子和CYCl終止子，用于組成型整合表達，根據(jù)載體含有的遺傳霉素G418抗性進行抗生素篩選。
[0010]本發(fā)明的有益成果是:本發(fā)明的重組釀酒酵母4126-SET5能在分別含有高濃度乙酸、過氧化氫、乙醇和高溫等環(huán)境脅迫條件下良好生長。并能在較強的環(huán)境脅迫條件下，比如高濃度乙酸條件下具有較高的乙醇發(fā)酵效率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1是SET5基因片段的PCR擴增。
[0012]圖2是載體構(gòu)建。
[0013]圖3是陽性轉(zhuǎn)化子PCR鑒定。
[0014]圖4是重組空載酵母4126-H0對照菌株和重組釀酒酵母4126-SET5在含有不同脅迫因素的平板中生長比較。
[0015]圖5是重組空載酵母4126-H0對照菌株和重組釀酒酵母4126-SET5在5g/L乙酸中的生長結(jié)果。
[0016]圖6是重組空載酵母4126-H0對照菌株和重組釀酒酵母4126-SET5在5g/L乙酸中的發(fā)酵結(jié)果。
【具體實施方式】
[0017]實施例1:含組蛋白甲基化酶編碼基因SET5的重組釀酒酵母的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化
[0018]本發(fā)明涉及的組 蛋白甲基化酶編碼基因SET5序列來自于NCBI公共數(shù)據(jù)庫，該基因的GenBank登錄號為NC_001140.6?；虻膯幼佑肞GKl啟動子，用CYCl終止子作為終止子，以酶切連接的方式在PGKl啟動子和CYCl終止子之間插入SET5基因。然后通過酶切位點NotI把構(gòu)建的質(zhì)粒酶切成線性，轉(zhuǎn)化到工業(yè)釀酒酵母4126中表達。
[0019]1.1釀酒酵母基因組DNA提取
[0020](I)將過夜培養(yǎng)的酵母菌液離心，12000rpm, 2min,去上清；
[0021 ] (2)向沉淀加入480 μ L TE溶液(ρΗ8.0)，20 μ L溶菌酶溶液(2mg/mL)，震蕩混勻后放入37°C搖床1.5小時；
[0022](3)加入適量RNase A，再次放入37°C搖床0.5小時；
[0023](4)從搖床中拿出，加入50 μ L20%SDS溶液，5 μ L蛋白酶K (PK濃度為20 μ g/mL)混合震蕩，55°C水浴鍋中放置Ih以上；
[0024](5)離心將管蓋上附著的液體收集到管底；加入500μ L苯酚:氯仿:乙戊醇(25:24:1)，震蕩混勻后，12000rpm離心10分鐘，取上清液，轉(zhuǎn)新管；
[0025](6)加入等體積異丙醇，放入_20°C冰箱I小時以上，沉淀DNA ；
[0026](7)12000rpm離心10分鐘,去上清液，加入lmL70%乙醇,洗沉淀I一2次，12000rpm離心8分鐘，棄上清；
[0027](8) 37°C干燥后加入 TE (ρΗ8.0) 50 μ L 溶解 DNA，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0028]1.2PCR擴增目標基因條帶
[0029]以實驗室酵母S.cerevisiae S288c DNA作為模板擴增基因SET5。引物序列如下:
[0030]
【權(quán)利要求】
1.一株具有脅迫耐受性的重組釀酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae),其特征在于:所述菌株的登記入冊編號為CGMCC N0.8724，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2014年01月15日。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株具有脅迫耐受性的重組釀酒酵母菌株，其特征在于:所述菌株SET5基因來源于實驗室模式釀酒酵母S288c，將PCR擴增得到的SET5基因連接到pHO組成型整合表達載體，·線性化后轉(zhuǎn)入工業(yè)釀酒酵母,實現(xiàn)整合表達。
【文檔編號】C12N15/63GK103849576SQ201410103468
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年3月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月19日
【發(fā)明者】趙心清, 張明明, 白鳳武 申請人:大連理工大學(xué)