一株l?丙氨酸高產(chǎn)菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了一株L?丙氨酸高產(chǎn)菌株，命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)EcQLS1，保藏編號為CGMCC No.11764。本發(fā)明采用常溫常壓等離子體誘變并結(jié)合高通量篩選方法獲得上述L?丙氨酸高產(chǎn)菌株腸埃希氏菌(Escherichia coli)EcQLS1，可大幅度提高L?丙氨酸的產(chǎn)量，且穩(wěn)定性較好，菌株連續(xù)傳代5次后L?丙氨酸的產(chǎn)量無明顯變化。利用搖瓶實驗，L?丙氨酸的產(chǎn)量達120g/L。本技術(shù)發(fā)明完全符合工業(yè)L?丙氨酸菌株的誘變和篩選需要，并可應(yīng)用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)，具有重大的經(jīng)濟價值。CGMCC No.1176420151130
【專利說明】
一株L-兩氨酸高產(chǎn)菌株
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了一株L-丙氨酸高產(chǎn)菌株。
【背景技術(shù)】
[0002]L-丙氨酸，又稱α-氨基丙酸，是一種α-氨基酸的左旋異構(gòu)體，為白色結(jié)晶，具有特殊的甜味。廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥、化工、食品、高分子材料等領(lǐng)域，用于制備藥物化合物合成甜味劑、測定肝功等，是一種應(yīng)用范圍廣且具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ闹匾ぎa(chǎn)品，越來越受到人們的歡迎和重視。
[0003]目前，L-丙氨酸可以采用化學(xué)合成法、酶法和發(fā)酵法生產(chǎn)。通過不同的化學(xué)合成途徑來生產(chǎn)各種氨基酸是化工行業(yè)常見的辦法，但是合成方法的產(chǎn)品質(zhì)量差、回收率低、成本高和環(huán)境污染等，所以這種方法基本處于淘汰邊緣。酶法轉(zhuǎn)化，即通過富有L-天冬氨酸-β-脫羧酶活力的微生物(如德阿昆哈假單胞Pseudomonas dacunhae等)細胞催化L-天冬氨酸而得到。這種轉(zhuǎn)化工藝的特點是酶活力高、設(shè)備投資小，提取工藝簡單;但是其原材料L-天冬氨酸價格較貴，使該方法的生產(chǎn)成本較高。微生物發(fā)酵法與酶催化工藝相比有諸多優(yōu)點:主要原料葡萄糖廉價易得，并且屬于可再生資源，成本可以保持穩(wěn)定水平，培養(yǎng)成分簡單，厭氧發(fā)酵動力消耗低，產(chǎn)品收率高、成本低。
[0004]微生物發(fā)酵常用的菌株選育技術(shù)主要分為隨機選育和定向選育。雖然以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的基因工程、代謝工程以及由各種組學(xué)組成的系統(tǒng)生物學(xué)研究為定向構(gòu)建功能細胞株提供了廣闊的前景，但是真正實現(xiàn)以這些功能細胞培養(yǎng)來達到改造目標(biāo)卻很困難。由于微生物體內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性和多節(jié)點性，基因操作后菌株的代謝流往往并不朝著與其設(shè)計的方向轉(zhuǎn)移。因此，在一個復(fù)雜的代謝體系中，想要得到優(yōu)良的生產(chǎn)菌株，主要還是采用隨機選育技術(shù)。長期以來針對菌株改良的隨機選育技術(shù)中主要采用的是紫外誘變和LiCl誘變等傳統(tǒng)的育種手段，且已經(jīng)取得了一定的效果。高理所等報道了利用紫外線和激光燈組合誘變的方法篩選L-丙氨酸的高產(chǎn)菌株(安徽工程科技學(xué)院學(xué)報，2008,,23(1) 19-24)，但是由于紫外線對各種微生物的誘變效應(yīng)不同，加上紫外的劑量大小很難把握，并且突變后存在光修復(fù)作用，所以紫外線誘變的效果不佳，正突變率效率較低，死亡率較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對上述技術(shù)存在的不足，提供了一株L-丙氨酸高產(chǎn)菌株，命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)EcQLSl，保藏編號為CGMCC N0.11764。本發(fā)明采用常溫常壓等離子體誘變并結(jié)合高通量篩選方法獲得上述L-丙氨酸高產(chǎn)菌株腸埃希氏菌(Escherichiacoli)EcQLSl，可大幅度提高L-丙氨酸的產(chǎn)量，且穩(wěn)定性較好，菌株連續(xù)傳代5次后L-丙氨酸的產(chǎn)量無明顯變化。利用搖瓶實驗，L-丙氨酸的產(chǎn)量達120g/L。本技術(shù)發(fā)明完全符合工業(yè)L-丙氨酸菌株的誘變和篩選需要，并可應(yīng)用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)，具有重大的經(jīng)濟價值。
[0006]本發(fā)明提供的一株L-丙氨酸高產(chǎn)菌株，其保藏號為CGMCCN0.11764;其分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)EcQLSl ；
[0007]該菌株是以市場上直接購得的MG1655為出發(fā)菌株獲得的，其主要步驟是:先經(jīng)過常壓常溫等離子體(ARTP)誘變處理獲得突變株，然后通過高通量篩選技術(shù)得到高產(chǎn)突變株，最后通過搖瓶驗證、傳代培養(yǎng)獲得遺傳性穩(wěn)定的L-丙氨酸高產(chǎn)菌株并進行生物保藏；
[0008]更為具體的獲得方法如下:
[0009](I)利用常溫常壓等離子體誘變出發(fā)菌株
[0010]以MG1655作為出發(fā)菌株培養(yǎng)至對數(shù)后期，加無菌水稀釋至細胞密度OD6(K)mm值大于I，在無菌風(fēng)下吹干，然后置于ARTP誘變系統(tǒng)進行等離子體照射0.5-6min;將樣品用生理鹽水洗下，常規(guī)梯度稀釋后涂布在平板LB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)15h;
[0011](2)突變株高通量初篩
[0012]挑取上述步驟所得的單菌落突變菌株，并接種于分別含有0.5mlLB固體培養(yǎng)基的96孔板和0.5ml LB液體發(fā)酵培養(yǎng)基的96孔板中，前者置于35?37°C靜置培養(yǎng)10?18h，后者置于35?37°C、200?300r/min震蕩培養(yǎng)12?20h;培養(yǎng)后檢測各孔發(fā)酵液中L-丙氨酸的含量，挑出產(chǎn)量高于出發(fā)菌株MG1655產(chǎn)量40 %的突變菌株，即為初篩高產(chǎn)菌株；
[0013]發(fā)明人采用這種方法，含有0.5mlLB固體培養(yǎng)基的96孔板和0.5ml LB液體發(fā)酵培養(yǎng)基的96孔板中同一個位置的菌是同一株，而LB固體培養(yǎng)基用于保存菌株，LB液體發(fā)酵培養(yǎng)基則用于檢測產(chǎn)量，這樣經(jīng)過LB液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選出的菌株，可以從同一個位置的LB固體培養(yǎng)基中直接獲得；
[0014](3)突變株高通量復(fù)篩
[0015]將步驟(2)所得的高產(chǎn)突變株的LB固體培養(yǎng)基上的固體培養(yǎng)物接種于裝有
0.5mlLB液體發(fā)酵培養(yǎng)基的96孔板中，35?37°C、200?300r/min震蕩培養(yǎng)12?20h;以10%的接種量轉(zhuǎn)接到裝有0.5mlLB液體發(fā)酵培養(yǎng)基的96孔板中，35?37°C、200?300r/min震蕩培養(yǎng)12?20h;培養(yǎng)后，檢測各孔中發(fā)酵液的L-丙氨酸的含量，挑取L-丙氨酸的含量高于出發(fā)菌株MG1655產(chǎn)量40 %的突變株，即為復(fù)篩高產(chǎn)菌株；
[0016](4)突變株搖瓶驗證
[0017]將步驟(3)所得的高產(chǎn)突變株的LB固體培養(yǎng)基上的固體培養(yǎng)物接種于裝有30?50mlLB液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，35?37°C、200?300r/min震蕩培養(yǎng)12?20h;以10%的接種量轉(zhuǎn)接到裝有30?50mlLB液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，35?37°C、200?300r/min繼續(xù)震蕩培養(yǎng)12?20h;
[0018](5)突變株遺傳穩(wěn)定性驗證
[0019]將經(jīng)搖瓶驗證過的高產(chǎn)菌株經(jīng)步驟(4)中250ml搖瓶連續(xù)培養(yǎng)5代，檢測高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性，選取穩(wěn)定性好且L-丙氨酸產(chǎn)量最高的菌株進行保藏。
[0020]其中檢測各孔發(fā)酵液中L-丙氨酸含量的方法，采用常規(guī)HPLC檢測方法，發(fā)明人在此不再贅述；
[0021]綜上所述本發(fā)明采用常溫常壓等離子體誘變并結(jié)合高通量篩選方法獲得上述L-丙氨酸高產(chǎn)菌株腸埃希氏菌(Escherichia coli)EcQLSl，可大幅度提高L-丙氨酸的產(chǎn)量，且穩(wěn)定性較好，菌株連續(xù)傳代5次后L-丙氨酸的產(chǎn)量無明顯變化。利用搖瓶實驗，L-丙氨酸的產(chǎn)量達120g/L，較出發(fā)菌株MG1655提高了 75%。本技術(shù)發(fā)明完全符合工業(yè)L-丙氨酸菌株的誘變和篩選需要，并可應(yīng)用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)，具有重大的經(jīng)濟價值。
[0022]發(fā)明人對L-丙氨酸高產(chǎn)菌株腸埃希氏菌EcQLSl進行了生物保藏，保藏信息如下:
[0023]保藏信息
[0024]保藏時間:2015年11月30日
[0025]保藏單位名稱:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)
[0026]保藏編號:CGMCCN0.11764
[0027]保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號
[0028]分類命名:大腸埃希氏細菌(Escherichia coli)
【附圖說明】
[0029]圖1為L-丙氨酸產(chǎn)生菌的菌落形態(tài)；
[0030]可見本發(fā)明所獲得的L-丙氨酸產(chǎn)生菌菌落形態(tài)，與常規(guī)無顯著變化。
【具體實施方式】
[0031]以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容做進一步的詳細說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0032]實施例1利用常溫常壓等離子體(ARTP)誘變出發(fā)菌株
[0033]以MG1655作為出發(fā)菌株培養(yǎng)至對數(shù)后期，加無菌水稀釋至細胞密度0D6QQmm值大于I，在無菌風(fēng)下吹干，然后置于ARTP誘變系統(tǒng)進行等離子體照射0.5-6min;將樣品用生理鹽水洗下，常規(guī)梯度稀釋后涂布在平板LB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)15h。
[0034]實施例2突變株高通量初篩
[0035]挑取上述步驟所得的單菌落突變菌株，并接種于分別含有0.5mlLB固體培養(yǎng)基的96孔板和0.5ml LB液體發(fā)酵培養(yǎng)基的96孔板中，前者置于35?37°C靜置培養(yǎng)10?18h，后者置于35?37°C、200?300r/min震蕩培養(yǎng)12?20h;培養(yǎng)后檢測各孔發(fā)酵液中L-丙氨酸的含量，挑出產(chǎn)量高于出發(fā)菌株MG1655產(chǎn)量40 %的突變菌株，即為初篩高產(chǎn)菌株。
[0036]實施例3突變株高通量復(fù)篩
[0037]將步驟(2)所得的高產(chǎn)突變株的LB固體培養(yǎng)基上的固體培養(yǎng)物接種于裝有
0.5mlLB液體發(fā)酵培養(yǎng)基的96孔板中，35?37°C、200?300r/min震蕩培養(yǎng)12?20h;以
0.05ml的接種量轉(zhuǎn)接到裝有0.5mlLB液體發(fā)酵培養(yǎng)基的96孔板中，35?37°C、200?300r/min震蕩培養(yǎng)12?20h;培養(yǎng)后，檢測各孔中發(fā)酵液的L-丙氨酸的含量，挑取L-丙氨酸的含量高于出發(fā)菌株MG1655產(chǎn)量40%的突變株，即為復(fù)篩高產(chǎn)菌株。
[0038]實施例4突變株搖瓶驗證
[0039]將步驟(3)所得的高產(chǎn)突變株的LB固體培養(yǎng)基上的固體培養(yǎng)物接種于裝有30?50mlLB液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，35?37°C、200?300r/min震蕩培養(yǎng)12?20h;以10%的接種量轉(zhuǎn)接到裝有30?50mlLB液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，35?37°C、200?300r/min繼續(xù)震蕩培養(yǎng)12?20h。
[0040]實施例5突變株遺傳穩(wěn)定性驗證
[0041 ]將經(jīng)搖瓶驗證過的高產(chǎn)菌株經(jīng)步驟(4)中250ml搖瓶連續(xù)培養(yǎng)5代，檢測高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性，選取穩(wěn)定性好且L-丙氨酸產(chǎn)量最高的菌株進行保藏，保藏編號為CGMCCN0.11764。
[0042]實施例6利用突變株EcQLSl在10L發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸
[0043]將本發(fā)明中保藏號為CGMCC N0.11764的大腸埃希氏細菌(Escherichia coli)活化后制成菌懸液接入種子培養(yǎng)基中，于36°C，200r/min搖床中培養(yǎng)16h,
[0044]再以3vt%接種量接至100L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，發(fā)酵溫度為36°C，轉(zhuǎn)數(shù)200r/min，發(fā)酵過程pH會下降，故而流加濃度10 %的尿素水溶液，維持發(fā)酵液的pH在6?7;發(fā)酵36h后停止發(fā)酵，HPLC檢測發(fā)酵液中L-丙氨酸濃度為120g/L。
[0045]可見利用該保藏菌株生產(chǎn)L-丙氨酸，可大幅度提高L-丙氨酸的產(chǎn)量，且穩(wěn)定性較好，菌株連續(xù)傳代5次后L-丙氨酸的產(chǎn)量無明顯變化；利用搖瓶實驗，L-丙氨酸的產(chǎn)量達120g/L，較出發(fā)菌株MG1655提高了 75%;本技術(shù)發(fā)明完全符合工業(yè)L-丙氨酸菌株的誘變和篩選需要，并可應(yīng)用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)，具有重大的經(jīng)濟價值。
【主權(quán)項】
1.一株L-丙氨酸高產(chǎn)菌株，命名為大腸埃希氏菌EcQLSl，保藏編號為CGMCC N0.11764。2.權(quán)利要求1所述的L-丙氨酸高產(chǎn)菌株的獲得方法，其特征在于:具體步驟如下: (1)利用常溫常壓等離子體誘變出發(fā)菌株 以MG1655作為出發(fā)菌株培養(yǎng)至對數(shù)后期，加無菌水稀釋至細胞密度OD6(X)mffi值大于I，在無菌風(fēng)下吹干，然后置于ARTP誘變系統(tǒng)進行等離子體照射0.5-6min;將樣品用生理鹽水洗下，常規(guī)梯度稀釋后涂布在平板LB固體培養(yǎng)基上，37 °C培養(yǎng)15h; (2)突變株高通量初篩 挑取上述步驟所得的單菌落突變菌株，并接種于分別含有0.5ml LB固體培養(yǎng)基的96孔板和0.5ml LB液體發(fā)酵培養(yǎng)基的96孔板中，前者置于35?37°C靜置培養(yǎng)10?18h，后者置于35?37°C、200?300r/min震蕩培養(yǎng)12?20h;培養(yǎng)后檢測各孔發(fā)酵液中L-丙氨酸的含量，挑出產(chǎn)量高于出發(fā)菌株MG1655產(chǎn)量40%的突變菌株，即為初篩高產(chǎn)菌株； (3)突變株高通量復(fù)篩 將步驟(2)所得的高產(chǎn)突變株的LB固體培養(yǎng)基上的固體培養(yǎng)物接種于裝有0.5mlLB液體發(fā)酵培養(yǎng)基的96孔板中，35?37°C、200?300r/min震蕩培養(yǎng)12?20h;以10%的接種量轉(zhuǎn)接到裝有0.5mlLB液體發(fā)酵培養(yǎng)基的96孔板中，35?37°C、200?300r/min震蕩培養(yǎng)12?20h;培養(yǎng)后，檢測各孔中發(fā)酵液的L-丙氨酸的含量，挑取L-丙氨酸的含量高于出發(fā)菌株MG1655產(chǎn)量40 %的突變株，即為復(fù)篩高產(chǎn)菌株； (4)突變株搖瓶驗證 將步驟(3)所得的高產(chǎn)突變株的LB固體培養(yǎng)基上的固體培養(yǎng)物接種于裝有30?50mlLB液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，35?37°C、200?300r/min震蕩培養(yǎng)12?20h;以10%的接種量轉(zhuǎn)接到裝有30?50mlLB液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，35?37°C、200?300r/min繼續(xù)震蕩培養(yǎng)12?20h; (5)突變株遺傳穩(wěn)定性驗證 將經(jīng)搖瓶驗證過的高產(chǎn)菌株經(jīng)步驟(4)中250ml搖瓶連續(xù)培養(yǎng)5代，檢測高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性，選取穩(wěn)定性好且L-丙氨酸產(chǎn)量最高的菌株進行保藏。
【文檔編號】C12N13/00GK106047740SQ201610021887
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年1月14日 公開號201610021887.1, CN 106047740 A, CN 106047740A, CN 201610021887, CN-A-106047740, CN106047740 A, CN106047740A, CN201610021887, CN201610021887.1
【發(fā)明人】邱磊, 李嬌嬌, 戰(zhàn)偉偉, 趙佩玉, 李敬龍
【申請人】齊魯工業(yè)大學(xué), 常州市金壇釀造機械有限公司