一種快速鑒定致病性香魚假單胞菌的多重pcr檢測(cè)試劑盒及其方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速鑒定致病性香魚假單胞菌的多重PCR檢測(cè)試劑盒及其方法，所述試劑盒包括TaqDNA聚合酶、PCR緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸混合物、重蒸水以及假單胞菌、香魚假單胞菌、致病性香魚假單胞菌的引物對(duì)，而應(yīng)用該試劑盒快速鑒定致病性香魚假單胞菌的多重PCR檢測(cè)方法包括假單胞菌的初步分離及多重PCR擴(kuò)增，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：使用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)就能快速地檢測(cè)出與上述三種假單胞菌的DNA引物相對(duì)應(yīng)的假單胞菌、香魚假單胞菌、致病性香魚假單胞菌，另外本發(fā)明的檢測(cè)方法利用上述的試劑盒能快速、靈敏、特異地測(cè)定假單胞菌的存在，同時(shí)還能區(qū)分致病株與無毒力的環(huán)境分離株。
【專利說明】一種快速鑒定致病性香魚假單胞菌的多重PCR檢測(cè)試劑盒及其方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及香魚假單胞菌的檢測(cè)技術(shù)，尤其一種涉及快速鑒定致病性香魚假單胞菌的多重PCR檢測(cè)試劑盒及其方法。
【背景技術(shù)】
[0002]已經(jīng)報(bào)道對(duì)魚類有致病性的假單胞菌種類有殺鰻假單胞菌(Pseudomonasanguillacida)、突光假單胞菌(P.fIuorescens)、惡臭假單胞菌(P.putida)和香魚假單胞菌(P.plecoglossicida)等,其中后3種同屬于突光型假單胞菌DNA I型,在形態(tài)和部分理化特性上相似，尤其是惡臭假單胞菌與香魚假單胞菌，此兩種菌在分類上同屬于惡臭假單胞菌組，在理化特性上非常接近，16S rRNA基因序列同源性達(dá)99%以上，常規(guī)的理化特性鑒定和16S rRNA基因測(cè)序比對(duì)均不能有效區(qū)分這兩種菌。香魚假單胞菌NB2011是對(duì)大黃魚致病的強(qiáng)毒株，引起大黃魚內(nèi)臟白點(diǎn)?。粚?duì)NB2011株基因組的解悉結(jié)果表明，該菌株存在III型分泌系統(tǒng)(Type III secretion system, TTSS),其基因排列與人類病原菌銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)存在的TTSS相似，但部分結(jié)構(gòu)和功能基因序列上存在較高的特異性，如exoU可能是NB2011TTSS向宿主細(xì)胞分泌的最重要的細(xì)胞毒素，其氨基酸序列與銅綠假單胞菌相應(yīng)蛋白(WP_023097922)的同源性最高，也僅為45%，核苷酸序列上則沒有明顯相似性；exoU的分泌則受到調(diào)節(jié)蛋白exsA的嚴(yán)格調(diào)控，NB2011exsA與銅綠假單胞菌相應(yīng)蛋白(NP_250404)的同源性為65%，核苷酸序列相似性低于70%，這種特異性為鑒別致病菌株提供了良好的基礎(chǔ)。香魚假單胞菌同時(shí)是自然環(huán)境如水體中微生物種群的正常成員，環(huán)境分離株一般對(duì)魚類沒有毒 力；先期的預(yù)備試驗(yàn)結(jié)果表明，環(huán)境分離的香魚假單胞菌株中不存在TTSS和相應(yīng)的毒力因子及調(diào)控蛋白。因此預(yù)先分析、檢測(cè)確定感染菌的種類和致病性就顯得尤為重要。
[0003]目前檢測(cè)香魚假單胞菌感染的方法主要包括:生理生化檢測(cè)、組織病理學(xué)觀察、顯微鏡檢以及PCR等生物技術(shù)診斷方法。對(duì)魚類致病菌香魚假單胞菌的檢測(cè)如一申請(qǐng)?zhí)?01210466878.5 (公布號(hào)為CN102952884A)的中國發(fā)明專利申請(qǐng)《一種魚類致病菌香魚假單胞菌的LAMP檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法》公開了如下的試劑盒:包括反應(yīng)緩沖液、MgS04溶液、dNTP液、Bst DNA聚合酶液、甜菜堿溶液、FIP/BIP引物溶液、F3/B3引物溶液和雙蒸水，該LAMP檢測(cè)試劑盒對(duì)香魚假單胞菌具有高靈敏度、高特異性，但是此方法采用菌株中普遍存在的看家基因rpoD為靶基因序列，不能同時(shí)區(qū)分有毒力的病原株和無毒力的環(huán)境分離株，缺乏足夠的特異性。
[0004]因此，本研究開發(fā)了一種多重PCR法，可以快速鑒別常規(guī)假單胞菌和香魚假單胞菌，同時(shí)檢測(cè)出其中的致病性菌株，區(qū)分無毒力的環(huán)境分離株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問題是提供一種快速鑒定致病性香魚假單胞菌的多重PCR檢測(cè)試劑盒，該檢測(cè)試劑盒可以快速、靈敏、特異地測(cè)定香魚假單胞菌的存在，同時(shí)區(qū)分致病株與無毒力的環(huán)境分離株。
[0006]本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種應(yīng)用試劑盒快速鑒定致病性香魚假單胞菌的多重PCR檢測(cè)方法，用該檢測(cè)試劑盒檢測(cè)致病性香魚假單胞菌的方法，可以為水產(chǎn)養(yǎng)殖中相關(guān)細(xì)菌檢測(cè)及環(huán)境細(xì)菌監(jiān)測(cè)提供技術(shù)手段。
[0007]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:該快速鑒定致病性香魚假單胞菌的多重PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包括TaqDNA聚合酶、PCR緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸混合物、重蒸水以及假單胞菌、香魚假單胞菌、致病性香魚假單胞菌的引物對(duì)；
[0008]其中，假單胞菌RNA聚合酶亞單位gyrB的上下游引物為:
[0009]P1:5，CAACTCSGGCGTTGGCATYCTGCT3，；
[0010]P2:5，CARG ATCGCCTGGGTRCGACGGTT3，；
[0011]香魚假單胞菌gyrB的上下游引物為:
[0012]P3:5， CTGCTGAAGGACGAGCGTTC3，；
[0013]P4:5 ’ GGTCATCTCACGAGCTTTCG3，；
[0014]致病性香魚假單胞菌III型分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)因子exsA的上下游引物為:
[0015]P5:5， TTGCTCAGCGAGATCAAAC3，；
[0016]P6:5 ’ GCTCATCTATCCAAACCCTC3，。
[0017]進(jìn)一步地，所述試劑盒具體由下列試劑組成=TaqDNA聚合酶0.05mL、10 XPCR緩沖液0.5mL、脫氧核糖核苷三磷酸混合物0.25mL、重蒸水5mL以及濃度分別為10 μ M的假單胞菌、香魚假單胞菌、致病性香魚假單胞菌的引物對(duì)200 μ L0
[0018]本發(fā)明還提供了應(yīng)用上述試劑盒快速鑒定致病性香魚假單胞菌的多重PCR檢測(cè)方法，其特征在于包括如下步驟:
[0019]I)假單胞菌的初步分離:從假單胞菌的培養(yǎng)基中提取基因組DNA，備作PCR模板；
[0020]其中，假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基自病魚內(nèi)臟和養(yǎng)殖水樣中無菌分離可疑菌落，以LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，經(jīng)十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB法)提取基因組DNA，備作PCR模板。
[0021]2)多重PCR擴(kuò)增包括:a、多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:反應(yīng)體系為20-30.0 μ L，各反應(yīng)產(chǎn)物分別為TaqDNA聚合酶0.02U/ μ L，PCR緩沖液2.5 μ L，脫氧核糖核苷三磷酸混合物 1.0mmoI/L,引物 Ρ1、Ρ2 各 0.2-0.24ymol/L, P3、P4 各 0.4-0.6ymol/L, P5、P6 各0.32-0.48 μ mol/L，余量用重蒸水補(bǔ)足；b、擴(kuò)增反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性4min，94°C變性30s，60.4°C退火45s，72°C延伸40s，循環(huán)30次，72°C終末延伸IOmin ;c、將步驟b的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)及結(jié)果分析。
[0022]進(jìn)一步地，所述步驟a的多重PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系具體為25.0 μ L，各反應(yīng)產(chǎn)物分別為TaqDNA聚合酶0.25 μ L，10 X PCR緩沖液2.5 μ L，脫氧核糖核苷三磷酸混合物1.0 μ L，引物Ρ1、Ρ2各0.5 μ L，Ρ3、Ρ4各L O μ L，Ρ5、Ρ6各L O μ L，重蒸水補(bǔ)足至總體積25.0 μ L。
[0023]通過電泳檢測(cè)及結(jié)果分析，(I)若發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物只有745bp的一條帶，指示了檢測(cè)菌株為假單胞菌屬惡臭假單胞菌相近種類；(2)若發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物出現(xiàn)745bp和570bp的兩條帶，指示了檢測(cè)菌株為香魚假單胞菌環(huán)境分離株；(3)若發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物有745bp、570bp和446bp的三條帶，指示檢測(cè)菌株為致病性香魚假單胞菌；(4 )若發(fā)現(xiàn)無PCR產(chǎn)物，或無上述特征性條帶，指示非假單胞菌屬其他細(xì)菌。
[0024]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:使用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)就能快速地檢測(cè)出與上述三種假單胞菌的DNA引物相對(duì)應(yīng)的假單胞菌、香魚假單胞菌、致病性香魚假單胞菌，另外本發(fā)明的檢測(cè)方法利用上述的試劑盒能快速、靈敏、特異地測(cè)定假單胞菌的存在，同時(shí)還能區(qū)分致病株與無毒力的環(huán)境分離株，檢測(cè)耗時(shí)短，操作簡捷，可以節(jié)省大量的勞力和財(cái)力，適合快速檢測(cè)的要求，并對(duì)儀器要求簡單，為香魚假單胞菌病的早期防治提供技術(shù)支持。
[0025]保藏說明
[0026]1、大黃魚致病株NB2011,即香魚假單胞菌Pseudomonas plecoglossicida,于 2014年4月I日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)，保藏編號(hào)為 CGMCCN0.8985。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為多重PCR鑒別香魚假單胞菌相近菌株及致病株與無毒力的環(huán)境分離株的電泳檢測(cè)結(jié)果；
[0028]圖2為多重PCR對(duì)致病株檢測(cè)的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果；
[0029]圖3為多重PCR鑒別假單胞菌屬香魚假單胞菌相近菌株的特異性；
[0030]圖4為多重PCR對(duì)感染魚組織DNA檢測(cè)結(jié)果的電泳圖；
[0031]圖5為多重PCR對(duì)海水樣品的電泳檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0032]以下結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0033]實(shí)施例1
[0034]一種致病性香魚假單胞菌多重PCR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒具體由下列試劑組成: [0035]TaqDNA聚合酶0.05mL、10 X PCR緩沖液0.5mL、脫氧核糖核苷三磷酸混合物0.25mL、重蒸水5mL、濃度分別為10 μ M的3對(duì)特異性引物200 μ L、分別為假單胞菌RNA聚合酶亞單位gyrB上下游引物PU P2,香魚假單胞菌gyrB上下游引物P3、P4以及致病性香魚假單胞菌III型分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)因子exsA上下游引物P5和P6。
[0036]其中，通過基因登錄號(hào)為CP000094.2、KC189956.UAB178859.1的熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌和香魚假單胞菌等菌株的gyrB基因內(nèi)部保守序列設(shè)計(jì)相對(duì)簡并性引物，靶序列長度為745bp ;其中，假單胞菌RNA聚合酶亞單位gyrB的上下游引物為:
[0037]P1:5，CAACTCSGGCGTTGGCATYCTGCT3，；
[0038]P2:5，CARG ATCGCCTGGGTRCGACGGTT3，；
[0039]通過基因登錄號(hào)為AB178862、JN688866.UASJX00000000的gyrB基因內(nèi)部保守序列為模板，設(shè)計(jì)香魚假單胞菌gyrB上下游引物P3、P4，靶序列長度為570bp ;香魚假單胞菌gyrB的上下游引物為:
[0040]P3:5，CTGCTGAAGGACGAGCGTTC3 ’ ；
[0041 ] P4:5，GGTCATCTCACGAGCTTTCG3，；[0042]通過基因登錄號(hào)為ASJX00000000NB2011基因組中III型分泌系統(tǒng)調(diào)控蛋白exsA基因?yàn)槟０澹O(shè)計(jì)exsA上下游引物P5和P6，靶序列長度為446bp ；
[0043]而致病性香魚假單胞菌III型分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)因子exsA的上下游引物為:
[0044]P5:5，TTGCTCAGCGAGATCAAAC3，；
[0045]P6:5 ’ GCTCATCTATCCAAACCCTC3 ’ ；
[0046]引物序列均由Primer premier6.0設(shè)計(jì),經(jīng)上海生工生物工程有限公司合成。
[0047]實(shí)施例2
[0048]應(yīng)用實(shí)施例1的試劑盒快速鑒定致病性香魚假單胞菌的多重PCR檢測(cè)方法:
[0049]1、假單胞菌的初步分離:以假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基自病魚內(nèi)臟及養(yǎng)殖水樣中無菌分離可疑菌落。
[0050]2,DNA模板制備:以Luria Broth (LB)培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，經(jīng)CTAB法提取基因組DNA，備作PCR模板。
[0051]3、多重PCR檢測(cè)的程序:擴(kuò)增體系25.0 μ L，包括TaqDNA聚合酶(Taq酶)0.02U/μ L，10XPCR緩沖液0.5mL,脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPmix) 1.0mmoI/L,取0.5 μ L濃度為
0.2 μ mol/L的特異 性引物P1、P2，1.0 μ L濃度為0.5 μ mol/L的特異性引物P3、P4，LOyL濃度為0.4 μ mol/L的特異性引物P5、P6，DNA模板溶液40ng/ μ L，重蒸水補(bǔ)足至25.0yL0在Eppendorf Mastercycler 上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程序?yàn)轭A(yù)變性 94°C, 4min,變性 94°C, 30s,退火60.4°C，45s，延伸72°C，40s，循環(huán)30次，終末延伸72°C，lOmin，反應(yīng)結(jié)束后取反應(yīng)液各3 μ L進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件:電流50mA,電壓IOOmv,電泳時(shí)間45min,后以Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍攝成像，結(jié)果如圖1所示，其中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，I為香魚假單胞菌NB2011株，2為香魚假單胞菌環(huán)境分離株，3為惡臭假單胞菌環(huán)境分離株，4為陰性對(duì)照。
[0052]實(shí)施例3
[0053]按照實(shí)施例2方法中所提取的DNA模板溶液進(jìn)行倍比梯度稀釋，濃度從1050ng/μ L至lng/μ L，實(shí)施與實(shí)施例2相同的多重PCR檢測(cè)，在> 4ng/μ L濃度范圍內(nèi)均能清晰地?cái)U(kuò)增到3條特異性目的條帶，表明本發(fā)明建立的多重PCR可以檢測(cè)的DNA的靈敏度為4ng/ μ L，結(jié)果如圖2所示，其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，1-10分別為模板DNA濃度為1050ng/μ L、525ng/μ L、258ng/μ L、129ng/μ L、65ng/μ L、32ng/μ L、16ng/μ L、8ng/μ L、4ng/y L、2ng/y LUng/μ L時(shí)多重PCR的檢測(cè)結(jié)果，泳道11為陰性對(duì)照。
[0054]實(shí)施例4
[0055]分別對(duì)銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌、香魚假單胞菌(致病株與環(huán)境分離株，其中環(huán)境分離株由國家海洋局海洋微生物保藏中心提供)、哈維氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌和嗜水氣單胞菌等依實(shí)施例2的方法提取模板DNA，進(jìn)行相同的多重PCR檢測(cè)，電泳結(jié)果如圖3，表明本發(fā)明建立的多重PCR可以特異地檢測(cè)香魚假單胞菌，同時(shí)區(qū)分致病株與環(huán)境分尚株。其中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000,泳道1_9分別代表香魚假單胞菌NB2011、香魚假單胞菌環(huán)境分離株(MCCC1A00022)、惡臭假單胞菌(CGMCC1.8092)、熒光假單胞菌(CGMCC1.6279)、銅綠假單胞菌(CGMCC1.10712)、嗜水氣單胞菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和哈維氏弧菌，泳道10為陰性對(duì)照。
[0056]實(shí)施例5[0057]取發(fā)病區(qū)網(wǎng)箱中無明顯癥狀的大黃魚肝、腎、脾等內(nèi)臟組織以無菌研磨器磨成組織液，取1.5mL組織液于滅菌離心管中，5000rpm,離心5min,棄上清,加滅菌水,6000rpm,離心5min反復(fù)離心洗漆3次,在沉淀中加入TE緩沖液ImL,懸浮,6000rpm,離心5min,收集沉淀，即為細(xì)菌提取物，然后依實(shí)施例2的方法進(jìn)行DNA模板的提取和多重PCR檢測(cè)，電泳結(jié)果如圖4所示，其中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，泳道1_3、4_6分別代表發(fā)病魚和健康魚肝、腎和脾組織提取DNA模板，泳道7為陰性對(duì)照；結(jié)果表明，感染魚內(nèi)臟組織樣品出現(xiàn)3條目的條帶，而健康對(duì)照魚中無，說明本方法可以準(zhǔn)確地檢測(cè)出早期感染。
[0058]實(shí)施例6
[0059]采集遠(yuǎn)離養(yǎng)殖區(qū)海水、健康養(yǎng)殖區(qū)和大黃魚發(fā)病網(wǎng)箱海水,通過離心富集法濃縮100倍，取1.5mL富集海水，同時(shí)設(shè)置滅菌海水、滅菌海水添加致病株與環(huán)境分離株的對(duì)照，實(shí)施與實(shí)施例2相同的方法進(jìn)行DNA模板提取和多重PCR檢測(cè)，電泳結(jié)果如圖5所示，其中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，泳道1_6分別代表滅菌海水添加環(huán)境分離株、滅菌海水添加致病株NB2011、滅菌海水、遠(yuǎn)離養(yǎng)殖區(qū)海水、健康養(yǎng)殖區(qū)海水和發(fā)病網(wǎng)箱海水，泳道7為不添加模板的陰性 對(duì)照。
【權(quán)利要求】
1.一種快速鑒定致病性香魚假單胞菌的多重PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包括TaqDNA聚合酶、PCR緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸混合物、重蒸水以及假單胞菌、香魚假單胞菌、致病性香魚假單胞菌的引物對(duì)； 其中，假單胞菌RNA聚合酶亞單位gyrB的上下游引物為:
Pl:5，CAACTCSGGCGTTGGCATYCTGCT3，；
P2:5 ’ CARG ATCGCCTGGGTRCGACGGTT3，； 香魚假單胞菌gyrB的上下游引物為:
P3:5 ’ CTGCTGAAGGACGAGCGTTC3，；
P4:5’ GGTCATCTCACGAGCTTTCG3’ ； 致病性香魚假單胞菌III型分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)因子exsA的上下游引物為:
P5:5，TTGCTCAGCGAGATCAAAC3，；
P6:5 ’ GCTCATCTATCCAAACCCTC3，。
2.如權(quán)利要求1所述的一種快速鑒定致病性香魚假單胞菌的多重PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述試劑盒具體由下列試劑組成: TaqDNA聚合酶0.05mLU0XPCR緩沖液0.5mL、脫氧核糖核苷三磷酸混合物0.25mL、重蒸水5mL以及濃度分別為10 μ M的假單胞菌、香魚假單胞菌、致病性香魚假單胞菌的引物對(duì)200 μ L。
3.一種應(yīng)用如權(quán)利要求2所述的試劑盒快速鑒定致病性香魚假單胞菌的多重PCR檢測(cè)方法，其特征在于包括如下步驟: 1)假單胞菌的初步分離:從假單胞菌的培養(yǎng)基中提取基因組DNA，備作PCR模板； 2)多重PCR擴(kuò)增包括:a、多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:取上述DNA模板溶液38_60ng/μ L，用上述試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)體系為20-30.0 μ L，各反應(yīng)產(chǎn)物分別為TaqDNA聚合酶0.02U/yL, PCR緩沖液2.5μ L，脫氧核糖核苷三磷酸混合物1.0mmoI/L,引物Ρ1、Ρ2各0.2-0.24 μ mol/L, P3、P4 各 0.4-0.6 μ mol/L, Ρ5、Ρ6 各 0.32-0.48 μ mol/L,余量用重蒸水補(bǔ)足；b、擴(kuò)增反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性4min，94°C變性30s，60.4°C退火45s，72°C延伸40s，循環(huán)30次，72°C終末延伸IOmin ;c、將步驟b的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)及結(jié)果分析。
4.如權(quán)利要求3所述的快速鑒定致病性香魚假單胞菌的多重PCR檢測(cè)方法，其特征在于:所述步驟a的多重PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系具體為25.0yL,各反應(yīng)產(chǎn)物分別為TaqDNA聚合酶0.25 μ L，10XPCR緩沖液2.5 μ L，脫氧核糖核苷三磷酸混合物1.0 μ L，引物Ρ1、Ρ2各0.5 μ L，Ρ3、Ρ4 各 1.0 μ L，Ρ5、Ρ6 各 1.0 μ L，重蒸水補(bǔ)足至總體積 25.0 μ L。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103993072SQ201410150633
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年4月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月15日
【發(fā)明者】毛芝娟, 李梅芳, 陳吉?jiǎng)? 申請(qǐng)人:浙江萬里學(xué)院