相關申請的交叉引用本申請基于2017年2月24日提交的申請?zhí)枮?017101046932的在先中國專利申請，并且要求該申請的優(yōu)先權，通過引用將該申請的全部內容合并于此。本發(fā)明屬于環(huán)境環(huán)保
技術領域：
，特別涉及一種假單胞菌，其篩選方法，以及含有該假單胞菌的微生物制劑、該微生物制劑的制備方法和應用。
背景技術：
：隨著我國社會的快速發(fā)展，城市生活垃圾所產(chǎn)生的一系列環(huán)境問題已經(jīng)引起人們的重視，特別是在城市垃圾填埋場和中轉站，由于垃圾堆積產(chǎn)生的惡臭和異味，會使人產(chǎn)生不愉快感覺，嚴重影響附近居民的生產(chǎn)和生活。城市生活垃圾產(chǎn)生的臭氣成分復雜，包含的硫化氫、硫醇、胺類對人身體健康產(chǎn)生危害，對周圍空氣造成污染。此外關于垃圾填埋場惡臭問題的群眾舉報，常年在各類環(huán)保舉報案件中維持較高水平，可見垃圾填埋場惡臭問題不僅僅是環(huán)境保護領域問題，也是一個民生問題。另一方面，近年來，隨著人們生活水平的日益提高，以及城市化進程的加快，出現(xiàn)了越來越多裝修高檔的寫字樓和豪華的居室，室內環(huán)境發(fā)生了巨大變化。許多居室的封閉式裝修和室內所用的裝飾材料引起了嚴重的室內空氣污染問題。其中，揮發(fā)性有機化合物(voc)對人體健康有巨大影響。當居室中的voc達到一定濃度時，短時間內人們會感到頭痛、惡心、嘔吐、乏力等，嚴重時會出現(xiàn)抽搐、昏迷，并會傷害到人的肝臟、腎臟、大腦和神經(jīng)系統(tǒng)，造成記憶力減退等嚴重后果。據(jù)報道，家庭裝飾裝修過程中使用的涂料是室內voc的主要來源之一。所以，各國都對涂料等裝飾裝修材料中的voc含量作了限制。目前，對于垃圾中轉站、填埋場等的臭氣控制方式依賴于噴灑各類除臭劑，主要有植物除臭劑和化學除臭劑。其中，植物除臭劑提取工藝復雜，生產(chǎn)成本較高，處理方式依賴于用一種氣味來掩蓋臭氣和異味，無法從根本解決臭氣產(chǎn)生問題；化學除臭劑生產(chǎn)成本較高，還可能會產(chǎn)生二次污染。利用微生物菌劑作為除臭劑，有生產(chǎn)成本低，不會產(chǎn)生二次污染，有益微生物能夠從源頭對臭氣進行分解，可針對氨氣、胺、硫化物、芳香族、二甲基硫、脂肪胺、硫化氫、硫醇等惡臭氣體進行氧化脫臭凈化處理，可實現(xiàn)標本兼治的效果。目前市場存在的微生物除臭制劑幾乎沒有可以對揮發(fā)性有機化物voc發(fā)揮分解作用的，因此，本領域的技術人員致力于開發(fā)一種環(huán)境除臭微生物制劑，以期有效降低臭氣和揮發(fā)性有機化合物voc的濃度，減少不良環(huán)境對居住質量和人體健康的影響。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明針對現(xiàn)有技術存在的上述不足，提供了一種去除環(huán)境臭氣及揮發(fā)性有機化合物的微生物菌劑及制備方法，以解決垃圾填埋場、垃圾中轉站、新裝修的房屋等場所臭氣問題及揮發(fā)性有機化合物污染問題。具體技術方案如下：本發(fā)明在第一方面提供了一株假單胞菌，為惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)daoduo2，于2017年2月21日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國武漢武漢大學，保藏號為cctccno:m2017053。優(yōu)選地，上述惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)daoduo2的篩選方法包括：1)將使用聯(lián)苯的化工廠內污染的土壤樣品加入到基礎培養(yǎng)基中，加入固體聯(lián)苯富集培養(yǎng)；2)培養(yǎng)8-12天后開始傳代培養(yǎng)，每2-5天轉接1次，轉接8-12次后將培養(yǎng)液稀釋后用無機鹽固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，篩選能夠生長的菌株；優(yōu)選地，培養(yǎng)10天后開始傳代培養(yǎng)，每3天轉接1次，轉接10次后將培養(yǎng)液稀釋后用無機鹽固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，篩選能夠生長的菌株；3)經(jīng)過連續(xù)富集培養(yǎng)后，取稀釋后的菌液涂布基礎固體培養(yǎng)基平板，挑取生長迅速的菌株，利用lb平板培養(yǎng)后該菌株的菌落圓滑，呈暗白色。本發(fā)明在第二方面提供了一種微生物制劑，其包括如上所述的惡臭假單胞菌daoduo2。優(yōu)選地，該微生物制劑中的有效活菌總數(shù)≥1.0×109cfu/ml。本發(fā)明在第三方面提供了上述假單胞菌或微生物制劑在除臭和除揮發(fā)性有機化合物中的應用。本發(fā)明在第四方面提供了上述微生物制劑的制備方法，包括以下步驟：步驟1、平板培養(yǎng)：使用固體富營養(yǎng)培養(yǎng)基，平板培養(yǎng)惡臭假單胞菌daoduo2，形成單菌落；步驟2、搖瓶種子液制作：在搖瓶中使用液體糖蜜培養(yǎng)基，培養(yǎng)步驟1中的惡臭假單胞菌daoduo2，形成搖瓶種子液；其中糖蜜為蔗糖糖蜜，為制糖工業(yè)副產(chǎn)品。步驟3、放大培養(yǎng)：使用液體糖蜜培養(yǎng)基，放大培養(yǎng)步驟2中的搖瓶種子液，獲得放大培養(yǎng)種子液；步驟4、發(fā)酵培養(yǎng)：使用發(fā)酵罐，培養(yǎng)步驟3中獲得的放大培養(yǎng)種子液，制備獲得微生物菌劑。優(yōu)選地，上述平板培養(yǎng)的程序為：采用平板劃線方法將惡臭假單胞菌daoduo2接種到固體lb培養(yǎng)基上，于25℃～35℃培養(yǎng)箱中孵育12～24h，形成單菌落。優(yōu)選地，上述搖瓶種子液制作的程序為：用滅菌處理過的接種環(huán)將步驟1中長勢良好的單菌落接種到液體糖蜜培養(yǎng)基中，在溫度25℃～35℃、150～250rpm轉速下振蕩培養(yǎng)12～24h，獲得搖瓶種子液。優(yōu)選地，上述放大培養(yǎng)的程序為：將步驟2獲得的搖瓶種子液按照1％～5％接種量接種到液體糖蜜培養(yǎng)基中放大培養(yǎng)，在溫度25℃～35℃、150～250rpm轉速下振蕩培養(yǎng)12～24h，獲得放大培養(yǎng)種子液。優(yōu)選地，上述發(fā)酵培養(yǎng)的程序為：在發(fā)酵罐中加入水，加入糖蜜，接入泵氣裝置，接入步驟3中的放大種子培養(yǎng)液，持續(xù)發(fā)酵48～72h。優(yōu)選地，上述液體糖蜜培養(yǎng)基含有2～4％的糖蜜。優(yōu)選地，上述微生物制劑的使用方法包括將該微生物制劑按1:10～1:50的比例稀釋，均勻噴灑待除臭對象，每天噴灑一次，連續(xù)噴灑3天～5天。本發(fā)明還提供了一種除臭劑，優(yōu)選為垃圾除臭劑，以及一種裝修污染物處理劑，它們分別含有上述惡臭假單胞菌daoduo2。本發(fā)明的微生物制劑，組成成分清晰，安全穩(wěn)定，無毒無害無二次污染，能夠有效控制臭氣和揮發(fā)性有機污染物產(chǎn)生源，改善環(huán)境，并且生產(chǎn)工藝簡單，成本低。將其用于垃圾中轉站、垃圾填埋場、新裝修的房屋等場所，可明顯改善被污染環(huán)境感官，能夠有效降低臭氣和揮發(fā)性有機化合物voc的濃度，并能持續(xù)控制臭氣和voc濃度，減小不良環(huán)境對人體健康帶來的危害。附圖說明圖1是本發(fā)明較優(yōu)實施例中噴灑微生物制劑前后臭氣濃度變化對比檢測圖譜(左側為含有惡臭假單胞菌daoduo2的微生物制劑；右側為對照微生物制劑b)；圖2是本發(fā)明較優(yōu)實施例中噴灑微生物制劑前后揮發(fā)性有機化合物濃度變化對比檢測圖譜(左側為含有惡臭假單胞菌daoduo2的微生物制劑；右側為對照微生物制劑b)；圖3是本發(fā)明的惡臭假單胞菌daoduo2的gyrb基因序列測定結果；圖4是本發(fā)明的惡臭假單胞菌daoduo2的16srrna基因序列測定結果。具體實施方式實施例1惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)daoduo2的篩選及鑒定將使用聯(lián)苯的化工廠內污染的土壤樣品加入到基礎培養(yǎng)基中，加入固體聯(lián)苯富集培養(yǎng)，在30℃搖床上200rpm/min培養(yǎng)8-12天后開始傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上，每2-5天轉接一次，轉接8-12次后將培養(yǎng)液適當稀釋后用無機鹽固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，篩選能夠生長的菌株。經(jīng)過連續(xù)富集培養(yǎng)后，取適當稀釋的菌液涂布基礎固體培養(yǎng)基平板，其中一株菌生長迅速。挑取該菌株，利用lb平板培養(yǎng)后這株菌的菌落圓滑，成暗白色。將該菌株送中國科學院微生物研究所進行菌株鑒定，根據(jù)菌株的細胞形態(tài)、生理生化實驗，gyrb基因序列、16srrna基因序列等實驗數(shù)據(jù)綜合分析，參考《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》以及internationaljournalofsystematicandevolutionarymicrobiology有關研究論文，鑒定結果為惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)。1、細胞形態(tài)和理化實驗結果如表1所示：表1篩選菌株的細胞形態(tài)和理化實驗結果2、gyrb基因序列測定結果，如圖3所示。3、16srrna基因序列測定結果，如圖4所示。4、抗生素敏感實驗結果，如表2所示。表2篩選菌株的抗生素敏感實驗結果將篩選獲得的上述菌株命名為惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)daoduo2，于2017年2月21日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為cctccno:m2017053。該菌株的培養(yǎng)方法為：將菌株在lb培養(yǎng)基中(1l)進行富集培養(yǎng)，作為種子液，轉接至含糖蜜2～4％的培養(yǎng)基(其余成分為水)在常溫下進行大規(guī)模培養(yǎng)(800l)，約72～96h有效活菌總數(shù)≥1.0×109cfu/ml。相比于其他培養(yǎng)方法，該方法具有極強的經(jīng)濟效益，成本低廉，菌株生長狀況不亞于富集培養(yǎng)基，同時菌株不容易老化變性，從而最大程度的實現(xiàn)其除臭的功能。實施例2除臭微生物制劑及其制備方法除臭微生物菌劑，包含惡臭假單胞菌daoduo2，能用于解決臭氣和揮發(fā)性有機化合物污染問題。該微生物制劑由惡臭假單胞菌daoduo2經(jīng)過發(fā)酵制備而成，所用發(fā)酵培養(yǎng)基為糖蜜培養(yǎng)基，菌劑中活菌數(shù)不低于1×109cfu/ml。該除臭微生物制劑的制備方法如下：(1)平板培養(yǎng)采用平板劃線方法將惡臭假單胞菌daoduo2接種到固體lb培養(yǎng)基上，于25℃～35℃培養(yǎng)箱中孵育12～24h，形成單菌落。其中固體lb培養(yǎng)基中含有50～100μg/ml的氨芐青霉素。其中固體lb培養(yǎng)基按照下述重量百分比配制：酵母粉0.5％、蛋白胨1％、氯化鈉1％、瓊脂粉1.5％和余量的蒸餾水，121℃滅菌處理20min，冷卻備用。(2)搖瓶種子液制作用滅菌處理過的接種環(huán)將步驟(1)中的長勢良好的單菌落接種到液體糖蜜培養(yǎng)基中，使用250ml錐形瓶在溫度25℃～35℃、150～250rpm轉速下振蕩培養(yǎng)12～24h，獲得搖瓶種子液。其中液體糖蜜培養(yǎng)基按照下述重量百分比配制：2％～4％糖蜜、0.1～1％酵母粉及余量的蒸餾水，121℃滅菌處理20min，冷卻備用。值得注意的是，搖瓶種子液中加入酵母粉是為了在短時間內在種子液中獲得狀態(tài)更好的、數(shù)量更多的活菌數(shù)，以便于后期放大培養(yǎng)。(3)放大培養(yǎng)將步驟(2)獲得的搖瓶種子液按照1％～5％接種量接種到1l的液體糖蜜培養(yǎng)基中放大培養(yǎng)，在溫度25℃～35℃、150～250rpm轉速下振蕩培養(yǎng)12～24h，獲得放大培養(yǎng)種子液。(4)發(fā)酵罐培養(yǎng)在1噸發(fā)酵罐中加入800l水，加入糖蜜重量百分比為2％～4％的糖蜜，接入泵氣裝置，接入步驟(3)中的放大培養(yǎng)種子液，持續(xù)發(fā)酵48～72h，檢測活菌數(shù)在1×109cfu/ml時，收集發(fā)酵液，分裝后陰涼處儲藏，得到用于去除環(huán)境中臭氣和揮發(fā)性有機化合物的微生物制劑。實施例3利用上述微生物制劑在天津一垃圾中轉站進行除臭應用將本發(fā)明除臭菌劑按照1:50比例用自來水進行稀釋，配成工作濃度的除臭菌劑。均勻的噴灑到新舊垃圾表面，通過檢測臭氣濃度和揮發(fā)性有機化合物濃度，同時通過感官來判斷處理效果。臭氣濃度是反映人對惡臭的主觀感受程度的指標，采用三點比較式臭袋法測定，無量綱。氨氣采用溶液吸收-分光光度法測定，揮發(fā)性有機化合物采用氣相色譜法測定，單位均為mg/m3，從定量的角度反映致環(huán)境氣體惡臭變化。分別對垃圾桶及垃圾車上進行噴灑，持續(xù)監(jiān)測數(shù)據(jù)，具體效果如表3-6所示：表3垃圾桶噴灑后檢測結果-舊垃圾時間臭氣濃度揮發(fā)性有機化合物0min13004910min8325.030min5601.43.5h3080.2表4垃圾桶噴灑后檢測結果–新垃圾時間臭氣濃度揮發(fā)性有機化合物0min800510min6672.930min5701.33.5h2580.3表5垃圾車(6噸垃圾)噴灑后檢測結果-舊垃圾(3噸垃圾)時間臭氣濃度揮發(fā)性有機化合物0min14701130min8201.51.0h5590.8表6垃圾車(6噸垃圾)噴灑后檢測結果–新垃圾(3噸垃圾)時間臭氣濃度揮發(fā)性有機化合物0min1190530min6331.01.0h4510.2結論：現(xiàn)場環(huán)境感官得到明顯的改善，臭氣濃度和揮發(fā)性有機化合物濃度明顯降低。實施例4利用上述微生物制劑在南京一垃圾填埋場進行除臭應用南京一垃圾填埋場，利用上述微生物菌劑與對照微生物制劑(由江蘇某公司生產(chǎn)的銀葉微生物除臭劑)進行除臭效果對比。將實施例2中制備的含有惡臭假單胞菌daoduo2的微生物制劑與對照微生物制劑都按照1:30相同比例用自來水進行稀釋，配成工作濃度的除臭菌劑。垃圾場作業(yè)面均勻噴霧噴灑，噴灑面(無量綱)，隨機取點4處，進行采樣測試，結果如表7-9所示以及圖1和圖2所示。表7含有惡臭假單胞菌daoduo2的微生物制劑測試數(shù)據(jù)表8對照微生物制劑測試數(shù)據(jù)表9兩種產(chǎn)品平均處理效率比較通過平均處理效率比較，可見本發(fā)明菌劑能有效降低惡臭污染，對揮發(fā)性有機化合物更是有近100％的清除效果。實施例5含有惡臭假單胞菌daoduo2的垃圾除臭劑在去除廚余垃圾中的應用廚余垃圾是指居民日常生活及食品加工、飲食服務、單位供餐等活動中產(chǎn)生的垃圾，包括丟棄不用的菜葉、剩菜、剩飯、果皮、蛋殼、茶渣、骨頭等，其主要來源為家庭廚房、餐廳、飯店、食堂、市場及其他與食品加工有關的行業(yè)。廚余垃圾不同于普通垃圾，具有組分復雜、水分和有機物含量高等特點，很容易腐壞，產(chǎn)生惡臭。其臭氣的主要成分有硫化氫、甲硫醇、1,3-二甲基苯、鄰二甲苯、二甲二硫和對二甲苯等。由于廚余類垃圾的臭氣成分比較特殊，處理時需要的除臭劑濃度較高，需要稀釋10～20倍左右使用。在本實施例中，以南京一垃圾中轉站經(jīng)分類的廚余垃圾為對象，利用上述垃圾除臭劑與對照微生物制劑(由江蘇某公司生產(chǎn)的銀葉微生物除臭劑)進行除臭效果對比。將兩種除臭劑按照1:15的比例用自來水進行稀釋，配成工作濃度的除臭菌劑，平均處理效果如表10所示表10兩種產(chǎn)品平均處理效率比較通過平均處理效率比較，可見本發(fā)明菌劑能有效降低廚余垃圾的惡臭污染，對揮發(fā)性有機化合物更是有近100％的清除效果。實施例6含有惡臭假單胞菌daoduo2的裝修污染物處理劑去除揮發(fā)性有機化合物的應用本實施例中采用以下方法進行室內空氣凈化效果的測定：1、將空白對照試劑(水)和用水稀釋40倍的裝修污染物處理劑以噴霧形式分別均勻噴灑在空白試驗艙a和樣品試驗艙b中，噴灑量相同。2、將裝有配好的voc污染物釋放源的容器分別放置于空白試驗艙a和樣品試驗艙b中，立即關閉艙門。3、開啟空白試驗艙a及樣品試驗艙b的風扇，攪拌1min，使艙內空氣與釋放源釋放的污染物混勻后，同時關閉風扇，對空白艙內進行空氣采樣，測定空白艙內空氣中污染物濃度為初始濃度，記作c0。3、0.5h、1h、2h、4h、12h、72h后分別對兩艙內空氣污染物的濃度進行采樣，分析測試，即為某一時間段內a、b艙的濃度值，記作ca與cb。去除率可按下式計算：y＝(cacb)/ca×100式中：y去除率，％；ca空白試驗艙污染物濃度值，mg/m3；cb樣品試驗艙污染物濃度值，mg/m3。試驗結果如表11所示：表11裝修污染物處理劑對voc的去除率時間0.5h1h2h4h12h72h去除率89.1％91.7％93.2％93.9％94.1％96.5％從上述結果可以看出，本發(fā)明提供的含有惡臭假單胞菌daoduo2的裝修污染物處理劑對去除揮發(fā)性有機化合物voc有顯著效果，其起效快速，持續(xù)時間長，去除率接近100％，效果遠遠好于市場上的同類產(chǎn)品，將其應用于新裝修的房屋內，可大大減輕乳膠漆等裝修材料對人體帶來的危害。以上詳細描述了本發(fā)明的較佳具體實施例及對比例。應當理解，本領域的普通技術無需創(chuàng)造性勞動就可以根據(jù)本發(fā)明的構思作出諸多修改和變化。因此，凡本
技術領域：
中技術人員依本發(fā)明的構思在現(xiàn)有技術的基礎上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術方案，皆應在由權利要求書所確定的保護范圍內。當前第1頁12