提高植物的脅迫耐性的人工融合基因的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種提高植物的脅迫耐性的人工融合基因及其應用。該基因具有的多核苷酸序列包含：（a）編碼水稻GPDH蛋白的NAD(P)結合功能結構域的多核苷酸序列；和（b）編碼大腸桿菌gpsA蛋白的NAD_Gly3P脫氫酶功能結構域的多核苷酸序列。本發(fā)明的人工融合基因，能夠用于制備水稻等轉基因植物，提高植物的抗脅迫耐性的能力。
【專利說明】提高植物的脅迫耐性的人工融合基因
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術領域】，具體涉及提高植物的脅迫耐性的人工融合基因及其應用。
【背景技術】
[0002] 植物在生長過程中會遭遇到各種各樣的非生物逆境，諸如干旱、高低溫和滯澇等自然災害，常造成農作物大量減產(chǎn)，另外，在我國，耕地缺磷也是一種常見的非生物脅迫環(huán)境(我國有半數(shù)以上的耕地缺磷，生產(chǎn)中經(jīng)常大量施用磷肥以保證糧食產(chǎn)量(李永夫等，應用生態(tài)學報，2005，16 (I):119-124))。因此，植物非生物脅迫生物學是農業(yè)科學技術研究的重要目標之一。例如，當前一個重要的育種手段是嘗試將各種抗逆基因對農作物進行基因工程改造，以獲得抗逆農作物新品種。
[0003]科學研究發(fā)現(xiàn)，為抵抗不良的外界環(huán)境的脅迫，植物體細胞感受外界環(huán)境的變化并將信號傳遞到細胞內，會誘導細胞表達各種應答基因共同來抵御不良環(huán)境對植物體的傷害。信號傳遞分子在植物抗逆/耐受脅迫的過程中發(fā)揮了關鍵作用。例如，甘油-3-磷酸(又稱3-磷酸甘油，Glycerol-3-phosphate, G_3_P)不僅是各種甘油酯物質(諸如膜脂等)合成的前體物，同時也是植物體內信號小分子物質，在植物的抗逆過程中起關鍵性作用。
[0004]甘油-3-磷酸是細胞膜質膜中磷脂的重要前體物，其含量的變化對質膜磷脂的構成有明顯影響。再者，實驗研究已經(jīng)證明，擬南芥細胞內的甘油-3-磷酸的表達水平的高低反映了其抗病能力，證明了甘油-3-磷酸是植物系統(tǒng)獲得抗性的強有力的誘導者，是植物免疫系統(tǒng)中重要的成員。
[0005]由于甘油-3-憐酸脫氧酶(glycerol-3-phosphatedehydrogenase,又稱 GPDH蛋白)是植物產(chǎn)生甘油-3-磷酸的關鍵酶之一。其由兩個結構域組成，在其N端結構域為NAD (P)結合功能結構域，其主要功能是結合NAD+/NADP+，其C端為NAD_Gly3P脫氫酶水解功能結構域，其主要功能是催化利用NADH和二羥基丙酮磷酸酯產(chǎn)生甘油-3-磷酸。
[0006]為提高植物細胞中甘油-3-磷酸的表達水平，一般的做法是提高植物細胞中甘油-3-磷酸脫氫酶的表達水平?？茖W家們嘗試將在植物細胞中不具有反饋作用的細菌來源的甘油-3-磷酸脫氫酶基因來轉化擬南芥,參見文獻Shen W et al, The Journal ofBiological Chemistry, 2010, 285: 22957 - 22965，擬南芥細胞內過量表達 gpsAFK 基因(經(jīng)改造后的細菌來源的甘油-3-磷酸脫氫酶基因)改變了大量的磷脂代謝相關基因表達量，改變了膜磷脂中脂肪酸構成和膜脂成分?？茖W家們也嘗試著將該基因導入油菜的基因組中，發(fā)現(xiàn)該基因在實驗室條件下能夠改善油菜在低磷條件下的生長，并抵抗一定的滲透脅迫，但是僅是在實驗室條件下能夠實現(xiàn)。直接使用細菌來源的基因進行植物改良其效果有限。再者，目前暫未發(fā)現(xiàn)該gpsAFR基因應用于水稻或其他經(jīng)濟作物。
[0007]目前，需要一種新的抗性基因，能夠提高植物的脅迫耐性，并且能夠更廣泛地適用于水稻以及其他經(jīng)濟作物。
【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明一方面提供了一種提高植物的脅迫耐性的人工融合基因，其中，
該基因具有的多核苷酸序列包含:
(a)編碼水稻GPDH蛋白的NAD(P)結合功能結構域的多核苷酸序列；和6)編碼大腸桿菌gpsA蛋白的NAD_Gly3P脫氫酶功能結構域的多核苷酸序列。
[0009]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述的(b)為采用植物偏好性密碼子人工合成的序列。在本發(fā)明的一個更優(yōu)選實施方案中，該人工融合基因的多核苷酸序列包含如SEQID N0.1所示序列。另外，發(fā)明人將SEQ ID N0.1所示核苷酸序列命名為基因。優(yōu)選的，該人工融合基因編碼的氨基酸序列包含如SEQ ID N0.2所示序列。
[0010]本發(fā)明另一方面提供了含有上述人工融合基因的重組載體。
[0011]本發(fā)明的再一方面提供了上述重組載體轉化的宿主細胞。
[0012]本發(fā)明另一方面提供了一種生產(chǎn)脅迫耐性的轉基因植物的方法，其中:
該方法包括以下步驟:
1)將權利要求1所述的人工融合基因可操作地連接于植物表達調控序列，形成植物表達載體；
2)將步驟I)所得的植物表達載體轉入植物細胞；
3)經(jīng)篩選獲得的轉化細胞，再生為植物及其后代，所述的植物包括植物細胞、植物組織或植物種子。
[0013]在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述的植物選自水稻、玉米、小麥、大麥、黍、高粱、大豆、黃瓜、苜蓿、馬鈴薯、蓖麻、花生、棉花、煙草、柑橘或黃瓜中任意一種。
[0014]本發(fā)明另一方面還提供了上述的人工融合基因在制備具有脅迫耐性的轉基因植物方面的用途。
[0015]本發(fā)明的人工融合基因，能夠用于制備轉基因植物，提高植物的抗脅迫耐性的能力，尤其是抗旱、高溫、低磷、耐滲透脅迫的能力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為各種植物GPDH蛋白比對圖:
采用ClustalW軟件將各種植物的野生型GPDH蛋白序列進行比對分析；圖中Glycine表不大豆(Glycine max),序列 ID 為 XP_003553315 ；Medicago 表不苜猜(Medicagotruncatula),序列 ID 為 XP_003622291 ；Cucumis 表不黃瓜(Cucumis sativus),序列 ID 為XP_004156696 ；Citrus 表不柑橘(Citrus Clementina),序列 ID為XP_006446670 ；Ricinus表不蓖麻(Ricinus communis),序列 ID 為 XP_002526956 ;Solanum 表不馬鈴薯(Solanumtuberosum),序列 ID 為 XP_006357169 ；Setaria 表不黍(Setaria italic),序列 ID 為XP_004971422 ；Zea 表示玉米(Zea mays)，序列 ID 為 ΝΡ_001150493 ;Sorghum 表示高粱(Sorghum bicolor),序列 ID 為 XP_002459175 ;0razy 表不水稻(Orazy sativa),序列 ID為 0s01g0971600 ；Hordeum 表不大麥(Hordeum vulgare),序列 ID 為 BAK07844 ；Triticum表示小麥(Triticum aestivum),序列ID為AGS79224 ;圖中下劃線，實線表示NAD (P) _b結構域，虛線表示NAD_Gly3P_DH結構域。
[0017]圖2為表達載體PCB4004- OEGD的構建示意圖。[0018]圖3為在轉基因水稻葉片中基因表達水平圖。采用實時RT-PCR方法檢測OEGD基因在轉基因水稻葉片中表達量，其中，橫軸的XQ表示品種湘晴對照(非轉基因水稻)，編號H1G072-094表示不同轉64^?基因株系；縱軸表示=1g2 (轉基因與對照XQ表達量倍數(shù))。
[0019]圖4為轉基因水稻低磷處理后株高圖。(當水稻生長到4葉期時，開始使用無磷配方營養(yǎng)液澆灌水稻，無磷澆灌10天后統(tǒng)計植株的高度；其中，橫軸的XQ表示湘晴對照(非轉基因水稻)；編號H1G072-78為轉^^^基因水稻；縱軸表示:水稻幼苗植株高度(單位為厘米)；*表示與對照的t-test顯著性分析P<0.05, **表示P < 0.01。
[0020]圖5A為滲透脅迫處理后水稻株高圖；圖5B為滲透脅迫處理復水后水稻死亡率圖；當水稻生長到4葉期時，開始使用含20% PEG6000的營養(yǎng)液澆灌水稻，處理7天后使用正常營養(yǎng)液復水處理，3天后統(tǒng)計植株的高度和死亡率；圖5A和圖5B的橫軸中，XQ表示湘晴對照，為非轉基因水稻；編號H1G072-78為轉OEGD基因水稻；圖5A的縱軸表示:水稻幼苗植株高度(單位為厘米)；圖5B的縱軸表示死亡的植株數(shù)占總植株數(shù)的比例；*表示與對照的t-test顯著性分析P < 0.05, **表示P < 0.01。
[0021]圖6為高溫脅迫處理后水稻株高圖；(當水稻生長到4葉期時，將幼苗移置到高溫大棚中，高溫環(huán)境下生長12天后，移植到室溫進行株高統(tǒng)計，單位為厘米；圖6的橫軸中，XQ表示湘晴對照(非轉基因水稻);編號H1G072-78為轉^^^基因水稻；圖6的縱軸表示水稻幼苗植株高度(單位為厘米);*表示與對照的t-test顯著性分析P ( 0.05,**表示P < 0.01。
[0022]圖7為轉64--基因水稻葉片中SOD含量圖；當水稻生長到4葉期時，20% PEG6000處理3天后取幼苗葉片，測定葉片中SOD含量；圖7的橫軸中，XQ表示湘晴對照(非轉基因水稻)，編號H1G072-87為轉OEGD基因水稻；圖7的縱軸表示每毫克鮮重葉片中SOD單位活性；*表示與對照的t-test顯著性分析P < 0.05, **表示P < 0.01。
[0023]圖8為轉64--基因水稻在海南大田干旱脅迫下單株平均產(chǎn)量圖；當水稻進入幼穗分化時期，開始進行旱管種植。成熟后拷種統(tǒng)計產(chǎn)量；湘晴對照為非轉基因水稻；圖7的橫軸中，湘晴為對照(非轉基因水稻)，編號H1G070-87為轉撕似基因水稻；縱軸表示平均每株產(chǎn)量，單位克。
[0024]圖9為轉64--基因水稻在上海大棚干旱脅迫下單株平均產(chǎn)量圖；每個株系單株種植，左右種植對照；當水稻進入幼穗分化時期，開始進行旱管種植；成熟后拷種統(tǒng)計產(chǎn)量；轉基因植株產(chǎn)量與相鄰的對照植株進行產(chǎn)量比較；圖9的橫軸中，湘晴對照(非轉基因水稻)，編號H1G070-87為轉OEGD基因水稻；縱軸表示每株產(chǎn)量，單位克；*表示與其相鄰對照的t-test顯著性分析P^0.05, **表示P ^ 0.010
【具體實施方式】
[0025]在本文，術語“分離的”、“純化的” DNA或基因是指，該DNA或基因片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或基因片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開，而且已經(jīng)與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。 [0026]在本發(fā)明的一個具體實施方案中，一種提高植物的脅迫耐性的人工融合基因，該基因具有的多核苷酸序列包含:
Ca)編碼水稻GPDH蛋白的NAD (P)結合功能結構域的多核苷酸序列；和(b)編碼大腸桿菌gpsA蛋白的NAD_Gly3P脫氫酶功能結構域的多核苷酸序列。
[0027]所述的(a)和(b)序列包括野生型的多核苷酸序列和能夠編碼相同功能蛋白的變異形式，該變異形式是野生型序列的開放閱讀框部分發(fā)生核苷酸缺失、插入和/或取代后獲得的。這些變異形式包括，但并不限于:若干個(通常為1-90個，較佳的1-60個，更佳的1-20個，最佳的1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內，較佳的為30個以內，更佳的為10個以內，最佳的為5個以內)核苷酸。
[0028]在本發(fā)明的一個具體實施方案中，本發(fā)明的提高植物的脅迫耐性的人工融合基因由(a)和(b)序列組成，即(a)和(b)序列直接連接而成。在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，本發(fā)明的提高植物的脅迫耐性的人工融合基因是(a)與(b)序列通過一段連接子序列連接而成，該連接子序列不影響蛋白的編碼，不影響最后形成的蛋白的功能。
[0029] 在一個優(yōu)選的實施方式中，所述的(b)為采用植物偏好性密碼子人工合成的序列。
[0030]蛋白質中每一個氨基酸對應于不同的密碼(少的一個，多的有6個)，不同物種使用不同密碼的頻率不一樣。植物使用秘碼偏好性有公共數(shù)據(jù)提供Codon Usage Database(http://www.kazusa.0r.jp/codon/)。故改變密碼使用偏好,無法在現(xiàn)存的物種中找到,就必須進行人工合成。采用植物偏好性密碼子人工合成序列是本領域技術人員所熟知的技術手段。
[0031]該人工融合基因的多核苷酸序列包含如SEQ ID N0.1所示序列。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，該人工融合基因的序列如SEQ ID N0.1所示序列。發(fā)明人將SEQ ID N0.1所示核苷酸序列命名為OEGD基因。
[0032]本發(fā)明的人工融合基因的多核苷酸序列還包括能編碼具有OEGD相同功能的蛋白的SEQ ID N0.1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于):若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
[0033]在本發(fā)明的人工融合基因的多核苷酸序列，還包括指編碼具有OEGD相同功能蛋白的SEQ ID N0.1序列的簡并序列。該簡并序列是指所述序列中有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQID N0.1序列同源性低至89%的簡并序列也能夠編碼出SEQ ID N0.2所述的氨基酸序列。該術語還包括能在中度嚴謹條件下，更佳的在高度嚴謹條件下與SEQ ID N0.1核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與SEQ ID N0.1核苷酸序列同源性至少89%，較佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。
[0034]該人工融合基因編碼的氨基酸序列包含如SEQ ID N0.2所示序列。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，該人工融合基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示序列，即
基因編碼的蛋白，發(fā)明人將該蛋白命名為OEGD蛋白。
[0035]在本發(fā)明中，還包括具有與OE⑶相同功能的、SEQ ID N0.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于):若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。
[0036]蛋白的同源性百分比由GAP (Needleman和Wunsh , 1970)分析(GCG程序)確定，其中參數(shù) gap creation penalty = 5，gap extension penalty = 0.3。被分析的序列長度至少為15個氨基酸時，GAP分析就在參與測試的兩個序列的至少為15個氨基酸的區(qū)域進行測試。更優(yōu)選地，被分析的序列長度至少為50個氨基酸時，GAP分析就在參與測試的兩個序列的至少為50個氨基酸的區(qū)域進行測試。更優(yōu)選地，被分析的序列長度至少為100個氨基酸時，GAP分析就在參與測試的兩個序列的至少為100個氨基酸的區(qū)域進行測試。更優(yōu)選地，被分析的序列長度至少為250個氨基酸時，GAP分析就在參與測試的兩個序列的至少為250個氨基酸的區(qū)域進行測試。甚至更優(yōu)選地，被分析的序列長度至少為500個氨基酸時，GAP分析就在參與測試的兩個序列的至少為500個氨基酸的區(qū)域進行測試。
[0037]通過本領域已知的方法可以合成、分離和純化多核苷酸(DNA或RNA)、載體、轉化體和生物體。
[0038]本發(fā)明所分離合成的人工融合基因的多核苷酸，包括但不限于:SEQ ID N0.1編碼OE⑶基因的核苷酸序列；或者該核苷酸序列能與SEQ ID N0.1中從核苷酸第1-1062位的核苷酸序列雜交；或者其 功能相當于SEQ ID N0.1所示序列的亞片段。
[0039]用于本發(fā)明的人工融合基因的重組載體可以是如噬菌體、質粒、粘粒、微型染色體、病毒或逆轉錄病毒載體?？捎糜诳寺『?或表達本發(fā)明的多核苷酸的載體是能在需復制和/或表達多核苷酸的宿主細胞中復制和/或表達多核苷酸的載體。一般說來，攜帶本發(fā)明的核酸序列的重組表達載體可以使用Ti質粒、植物病毒載體，直接DNA轉化、微注射、電穿孔等常規(guī)生物技術方法導入植物細胞(Weissbach, 1998, Method for PlantMolecular Biology VIII， Academy Press, New York, pp.411—463; Geiserson andCorey, 1998， Plant Molecular Biology (2nd Edition)。
[0040]已開發(fā)出多種方法用于經(jīng)由互補的粘性末端或重組酶使多核苷酸與載體可操作地相連。例如，可在欲插入載體DNA內的DNA區(qū)段末端添加特異設計的同聚體序列片段。然后通過互補同聚體尾之間的氫鍵連接載體和DNA區(qū)段以形成重組DNA分子；或者利用DNA重組原理，使用特定的重組酶進行重組反應，形成重組DNA分子。
[0041]術語“可操作地相連”表示如下情況:即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連接于多肽DNA;如果啟動子控制序列的轉錄，那么它是可操作地連接于編碼序列；如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連接于編碼序列。一般，“可操作地連接于”意味著相鄰，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
[0042]多核苷酸插入物應該可操作地連接于同表達多核苷酸的宿主細胞相容的適當啟動子上，啟動子可以是強啟動子和/或誘導型啟動子。列舉的一些啟動子的例子包括噬菌體λ PL啟動子、大腸桿菌lac、trP、phoA、tac啟動子、SV40早期和晚期啟動子以及逆轉錄病毒LTR啟動子；其它適當啟動子是本領域技術人員已知的。表達重組載體進一步含有轉錄起始、終止位點，并在轉錄區(qū)含有用于翻譯的核糖體結合位點。重組載體表達的轉錄物的編碼部分可包括位于起點處的翻譯起始密碼子和適當?shù)匚挥诒环g多肽的末端的終止密碼子(UAA，UGA或UAG)。
[0043]如上所述，表達載體可包括至少一個選擇標記。所述標記包括編碼抗生素的抗性基因，例如:新霉素磷酸轉移酶(Neomycin phosphotransferase)基因npt I1、潮霉素憐酸轉移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因hpt和二氫葉酸還原酶(Dihydrofolate reductase)基因dhfr ;另一類是編碼除草劑抗性基因，例如，草丁膦乙酰轉移酶(Phosphinothricin acetyl transferase)基因bar、5_烯醇丙酮酸草酸_3_憐酸合成酶(5-Enoylpyruvate shikimatr-3-phosphate)基因epsps。適當宿主的代表性例子包括但不限于:原生質體細胞和植物細胞。上述宿主細胞的適當培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件是本領域已知的。
[0044]目的基因或目的多核苷酸的轉化方法:一類是載體介導的轉化方法，即將目的基因插入到農桿菌的質?；虿《镜腄NA等載體分子上，隨著載體DNA的轉移而將目的基因導入到植物基因組中；農桿菌介導和病毒介導法就屬于這種方法。第二類為基因直接導入法，是指通過物理或化學的方法直接將外源目的基因導入植物的基因組中。物理方法包括基因槍轉化法、電激轉化法、超聲波法、顯微注射法和激光微束法等；化學方法有PEG介導轉化方法和脂質體法等。第三類為種質系統(tǒng)法，這包括花粉管通道法、生殖細胞浸染法、胚囊和子房注射法等。本發(fā)明中，使用的術語“轉化體”(transformant),即帶有異源DNA分子的宿主細胞或生物體。
[0045]本發(fā)明還包括含有本發(fā)明的核苷酸序列的宿主細胞,所述核苷酸序列經(jīng)本領域已知的技術與一或多種異源控制區(qū)(如啟動子和/或增強子)可操作相連?？梢赃x擇能調節(jié)插入的基因序列的表達，或能按照所需的特殊方式修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主菌株。在某些誘導物的存在下，某些啟動子啟動的表達會升高。
[0046]通過眾所周知的技術可以鑒定出被成功轉化的細胞，即含有本發(fā)明所述核苷酸序列的重組載體的細胞或生物體。
[0047]在本發(fā)明的一個具體實施方案中，一種生產(chǎn)脅迫耐性的轉基因植物的方法，該方法包括以下步驟:
1)將權利要求1所述的人工融合基因可操作地連接于植物表達調控序列，形成植物表達載體；
2)將步驟I)所得的植物表達載體轉入植物細胞；
3)經(jīng)篩選獲得的轉化細胞，再生為植物及其后代，所述的植物包括植物細胞、植物組織或植物種子。
[0048]上述的“人工融合基因可操作地連接于植物表達調控序列”，是指將人工融合基因序列有效連接至植物組成性表達或脅迫誘導表達啟動子。
[0049]所述的植物選自水稻、玉米、小麥、大麥、黍、高粱、大豆、黃瓜、苜蓿、馬鈴薯、蓖麻、花生、棉花、煙草、柑橘或黃瓜中任意一種。在本發(fā)明的一個具體實施例中，將OEGD基因的載體轉入水稻細胞中獲得轉OEGD基因水稻。
[0050]由于水稻、玉米、小麥、大麥、黍、高粱、大豆、黃瓜、苜蓿、馬鈴薯、蓖麻、花生、棉花、煙草、柑橘和黃瓜的GPDH蛋白序列的高度的同源性，參見下述的實施例1，因此，能夠適用于水稻細胞的人工融合基因，也能夠適用于玉米、小麥、大麥、黍、高粱、大豆、黃瓜、苜蓿、馬鈴薯、蓖麻、花生、棉花、煙草、柑橘和黃瓜，這是本領域一般技術人員根據(jù)本領域公知常識所能夠推測到的。
[0051]以下結合具體實施例，進一步闡明本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0052]實施例1:植物GPDH蛋白序列比對
從NCBI基因數(shù)據(jù)庫平臺(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)下載水稻、玉米、小麥、大麥、黍、高粱、大豆、黃瓜、苜蓿、馬鈴薯、柑橘、蓖麻等物種的GPDH蛋白的氨基酸序列(其中，水稻的GPDH蛋白的氨基酸序列為SEQ ID N0.7)，采用ClustalW軟件將植物GPDH蛋白序列進行比對分析，具體結果見圖1。從圖1可以看出，這些來源于雙子葉和單子葉物種的GPDH蛋白十分保守，無論是NAD(P)結合功能結構域還是NAD_Gly3P脫氫酶結構域，其序列相似性十分高，且這些蛋白之間的功能也是極其相似的。
[0053]因此，在基因操作中，相同功能的結構域基因在上述的這些植物物種中互換對基因功能影響很小。
[0054]當然，植物來源的GPDH蛋白與大腸桿菌來源的gpsA蛋白同源性很低，例如，水稻GPDH蛋白和大腸桿菌gpsA蛋白(ID accession: P37606)的一致性僅為21.4%,考慮同性質氨基酸因素，其相似性也僅為35.1%。將植物來源的NAD(P)結合功能結構域與細菌來源的NAD_Gly3P_DH結構域進行 人工融合，無論使用何種植物序列，其對人工融合基因功能影響將十分小。即本發(fā)明中NAD(P)結合功能結構域可以使用不同植物來源的序列，而NAD_Gly3P_DH結構域使用大腸桿菌來源序列，不影響融合基因功能的表現(xiàn)。
[0055]本發(fā)明以水稻作為下面實施例的植物來源。
[0056]實施例2:合成分離克隆OEGD基因
從 NCBI 數(shù)據(jù)庫平臺(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)下載水稻 0s01g0971600 和細菌P37606序列。首先分離克隆水稻GPDH基因。采用TRIzol試劑(GIBCO BRL, USA)抽提水稻葉片總RNA。利用反轉錄酶MLV (Tiangen，China)將其反轉錄成cDNA。用引物GPDF(5， - atggagaacggacacgccaagaatc-3，)和弓丨物 GGR (5， - gctggactccaatgaagtcctctacaacagaaaccagg -3’)，擴增含基因NAD (P)結合功能結構域cDNA的PCR產(chǎn)物。PCR反應條件為:94°C預變性 3min ；94°C 30sec, 60°C 30sec，72°C 90sec 共 35 個循環(huán)；72°C延伸 5min。將擴增獲得的PCR產(chǎn)物連入pGEM-T載體(Promega，USA),篩選陽性克隆并測序，獲得OsGPDH基因的部分cDNA序列(SEQ ID N0.3)。然后參照細菌gpsA蛋白序列(SEQ ID N0.5)，按照水稻密碼子偏好在DNA合成儀上人工合成細菌gpsA的NAD_Gly3P脫氫酶結構域(SEQID N0.4) ο 以合成序列為模板，用引物 GGF (5’_cctggtttctgttgtagaggacttcattggagtccagc-3’)和引物 gpsAR (5，- cagtgactggagcgctcgtcc-3’)，擴增含合成 DNA 片段的 PCR 產(chǎn)物。PCR反應條件同上。隨后將兩個PCR產(chǎn)物混合，進行94°C變性3min，然后以每秒降低1°C使溫度逐漸降低到60°C，加Taq酶在72°C延伸5min。最后添加引物GPDF和gpsAR，擴增包含水稻NAD (P)結合功能結構域和大腸桿菌NAD_Gly3P脫氫酶結構域的人工合成基因。PCR反應條件同上。將PCR產(chǎn)物裝入pGEM-T載體(Promega, USA)，篩選陽性克隆并測序，獲得OEGD基因的cDNA序列(SEQ ID N0.1)。
[0057]實施例3 ,OEGD基因超表達載體的構建和遺傳轉化
3.1含目的基因表達載體的構建:根據(jù)^^^基因的全長序列(SEQ ID N0.1)，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游引物和下游引物上分別引入BP Clonase ?酶重組序列位點，以便通過GATEWAY?技術構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產(chǎn)物為模板，經(jīng)高保真Taq酶pfu酶(Tiangen，China)進行PCR擴增后，將OEGD基因cDNA克隆至中間載體(如pD0NR207)，進一步轉化大腸桿菌DH5a，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定中間載體，然后抽提質粒，使用PCB4004植物表達質粒進行LR Clonase "*酶重組，這樣就將基因兩頭分別加入了 CAMV35S轉錄啟動子和終止子，構成了一個包含64--基因完整表達單元的植物表達載體PCB4004::0E⑶中，轉化農桿菌EHA105，最后進行水稻愈傷組織轉化實驗。
[0058]3.2水稻遺傳轉化 3.2.1種子消毒
成熟的湘晴水稻種子去殼后放入無菌三角瓶中，用75%酒精浸泡1-2 min，無菌水沖洗2次；再用30% NaClO消毒30 min，其間需經(jīng)常搖動，再用無菌水洗3_4次，用無菌濾紙吸干多余的水分，將種子接種到愈傷組織誘導培養(yǎng)基(MS + 2,4- D 2.0 mg/L)上，每皿約30粒，于28 °C暗培養(yǎng)。
[0059]3.2.2繼代培養(yǎng)
經(jīng)過近I月的誘導，水稻長出黃色膨大的愈傷組織，去其盾片，將愈傷轉至新鮮的愈傷組織誘導培養(yǎng)基(MS + 2,4-D 2.0 mg/L)上進行繼代。每2周繼代一次，一般繼代2_4次即可獲得適合轉基因的嫩黃色、顆粒狀的胚性愈傷組織。在繼代培養(yǎng)2周后，挑選胚性顆粒用于遺傳轉化。
[0060]3.2.3農桿菌的培養(yǎng)
在轉化平板上挑取單菌落在Iml農桿菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在50ml農桿菌培養(yǎng)基(含相應抗生素)中加入1ml上述培養(yǎng)物，200rpm，28°C培養(yǎng)5-6hr至0D600為0.6-1.0，培養(yǎng)結束前2hr加入乙酰丁香酮(AS,終濃度IOOuMX取上述菌液在室溫下,4000rpm, IOmin,棄上清，加入MS液體培養(yǎng)基(含AS IOOuM)重懸菌體，在與上相同的條件下培養(yǎng)2hr，使菌液的0D600=0.5-1,此時可用來轉化愈傷組織。AS=acetosringone乙酰丁香酮。
[0061]3.2.4 共培養(yǎng)
將水稻胚性愈傷組織浸入農桿菌菌液20-30min，再用無菌吸水紙吸干水分，將侵染的愈傷組織置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS + 2,4-D 2.0 mg/L + AS 100 uM)上，28°C暗培養(yǎng)三天。
[0062]3.2.5 洗菌
共培養(yǎng)的愈傷組織先用無菌水沖洗3遍，再浸泡在含Cef/CN 400 mg/L的MS液體培養(yǎng)基中20-30min后，將愈傷組織轉入無菌濾紙上吸干。
[0063]3.2.6選擇培養(yǎng)
將吸干水分的愈傷組織接種于選擇培養(yǎng)基(MS + 2,4-D 2.0 mg/L + Hyg 30 mg/L +Cef 400 mg/L)上。3周后，挑選新長出的愈傷接種于選擇培養(yǎng)基(MS + 2,4-D 2.0 mg/L +Hyg 50 mg/L + Cef 250 mg/L)上，再選擇 2 周。
[0064]3.2.7分化培養(yǎng)
將經(jīng)過2次選擇得到的抗性愈傷組織轉入到預分化培養(yǎng)基(N6 + KT 2.0 mg/L + NAA0.2 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L + Hyg 30 mg/L + Cef 200 mg/L + 瓊月旨 9g/L + 鹿糖45g/L)上暗培養(yǎng)10天左右，再轉到分化培養(yǎng)基(N6 + KT 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 6-BA 2.0mg/L + Hyg 30 mg/L + 瓊脂 4.5g/L + 鹿糖 30 g/L)上光照培養(yǎng)。
[0065]3.2.8生根培養(yǎng)
約1-2個月，將2cm左右高的幼苗轉到生根培養(yǎng)基(1/2MS + Hyg 15 mg/L +瓊脂4.5g/L +蔗糖20g/L)上誘導不定根的發(fā)生。
[0066]3.2.9轉基因苗的移栽
當幼苗長至IOcm高時，將幼苗取出，用無菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入泥土中，剛開始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養(yǎng)。
[0067]3.3煙草的遺傳轉化
3.3.1煙草無菌苗的快繁
先將煙草種子用75%乙醇浸泡0.5min，再用2%NaC10浸泡lOmin，無菌水沖洗3_4次，用無菌吸水紙吸干水分，接種于MS培養(yǎng)基上，25°C下光照培養(yǎng)，即可獲得煙草無菌試管苗。切取煙草無菌試管苗的葉片，去掉其主葉脈和葉緣，將其剪成約Icm2見方的小葉片，接種于芽分化培養(yǎng)基MSl中，待芽長出以后，切取單個芽接種于MS培養(yǎng)基中，20天左右即可長成植株。
[0068]3.3.2農桿菌的培養(yǎng)
在轉化平板上挑取單菌落在Iml農桿菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在50ml農桿菌培養(yǎng)基(含相應抗生素)中加入1ml上述培養(yǎng)物，200rpm, 28°C振蕩培養(yǎng)過夜；室溫下4000rpm，IOmin,棄上清夜，菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，在與上相同的條件下培養(yǎng)2hr,使菌液的0D600=0.5左右。
[0069]3.3.3農桿菌侵染
取生長兩周左右的煙草的無菌葉片，去掉其主葉脈和葉緣，將其剪成約Icm2見方的小葉片。將葉片放入制備好的菌液中，浸泡2-5 min 190rpm，在無菌濾紙上吸干多余菌液。
[0070]3.3.4 共培養(yǎng)
將吸干的葉片外植體放在愈傷組織誘導或分化培養(yǎng)基MSKMS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA
0.1 11^/1)，251:暗培養(yǎng)48111.。
[0071]3.3.5選擇培養(yǎng)
將經(jīng)過共培養(yǎng)的葉片外植體轉入加有選擇壓的脫菌分化或愈傷組織誘導培養(yǎng)基MS29MS +6-BA 1.0 mg/L + NM 0.1 mg/L + Hpt 50 mg/L + Cb 250mg/L)上，葉片背面向下，邊緣壓入培養(yǎng)基中，25°C光照下培養(yǎng)。培養(yǎng)7-15天可見愈傷組織的形成，約20天后可見分化芽長出。
[0072]3.3.6生根培養(yǎng)
待芽長大后，切下，置于含有選擇壓的生根培養(yǎng)基MS3(1/2MS + NAA 0.5mg/L + Hpt25mg/L)上進行生根培養(yǎng)，2-7天左右長出不定根。
[0073]3.3.7轉基因煙草的移栽
等根系發(fā)達后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養(yǎng)。
[0074]實施例4 'OEGD基因超量表達轉基因植株表達量分析
4.1材料準備
將實施例3.2獲得的轉基因水稻植株T2代種子和對照品種湘晴種子發(fā)芽后，移植于液體培養(yǎng)基(國際水稻所水稻水培營養(yǎng)液,配方見http://irr1.0rg/)。幼苗生長15 d后,剪取葉片快速投入液氮保存，用于RNA的抽提。
[0075]4.2無DNA的總RNA制備
按上海華舜生物技術有限公司提供的植物葉RNA小量抽提試劑盒使用說明書抽提。使用Beckman Coulter ? DU?640紫外分光光度計測定RNA濃度。為除去殘留在RNA中的DNA，每個總RNA樣品取5 μ g，加入I μ L DNAase
I (美國Invitrogen公司)和I μ LlOX反應緩沖液，補足體積至10 μ L，常溫反應30
min，然后每管加入IyL 2 mmol L-1 EDTA終止反應，最后在70°C加熱10 min使DNAase I失活。
[0076]4.3第一鏈cDNA的合成
將上述RNA樣品各取2 μ L,按美國Promega公司反轉錄試劑盒提供的試劑依次添加4μ L 25 mmol L-1 MgCl2, 2 μ LlOXRT 緩沖液，2 μ L dNTP混和液和 I μ L oligo(dT) 15,加水補足體積到18.5 μ L，在70°C加熱變性10 min,快速在冰上冷卻。然后加0.5 μ LRNase inhibitor 和 I yL AMVRTase，在 42 °C 水浴 60 min，70°C 下加熱 10 min 終止反應。
[0077]4.4 定量 PCR
根據(jù)基因見必的序列設計特異性引物RF: 5’- agcttgcccaccgcttcggag _3’，RR:5，-cagtgactggagcgctcgtcc-3?用于突光定量 PCR,根據(jù) Actin (GenBank accessionN0.AY212324)基因的 cDNA 序列設計特異性引物 AF: 5’ -cttcctcatgccatcctgc-3’，ar:5’-gcaagcttctccttgat gtcc-3’用于參照基因的熒光定量PCR。PCR使用美國ABI PRISM?7000定量PCR儀，每一個PCR設置一次重復。反應體系包含SYBR Premix Ex Taq?(2X)10μ L,正反向引物各0.5 μ L,各種處理的cDNA模板I yL,加水補足體積至25 μ L。反應程序為:95°C 30 s，然后在95°C10 s,61°C 34 s下循環(huán)40次，設定在每個循環(huán)中60°C 34s時讀取熒光值，同時進行ROX值校正，最后添加熒光PCR產(chǎn)物融解曲線分析，其他操作詳見儀器使用說明書。為了檢測RNA樣品中是否存在DNA的污染，隨機選取3個樣品，各取Iμ L RNA作為模板進行PCR，方法同上。
[0078]4.5分析方法
Ct是通過7000 system SDS Versionl.2.3軟件在PCR的熒光域值通過手工確定為0.2后產(chǎn)生的，將數(shù)據(jù)輸入到EXCEL進行計算分析。數(shù)據(jù)分析采用方法為2_" "CT，然后利用EXCEL表作表達差異柱狀圖(-Λ ACT)。
[0079]4.6分析結果
從圖3可以看出，6好似基因在轉基因水稻株系H1G072-094中均得到高表達，其表達量與對照相比，均超過100倍，最高表達量甚至超過500 (29)倍，表明這些轉基因植株中OEGD基因在水稻中能夠正常地高表達，可以進一步進行下一步檢測試驗。
[0080] 實施例5 'OEGD基因超量表達轉基因植株在實驗室條件下耐逆試驗
5.1材料準備
將實施例3.2獲得的轉基因水稻T2代種子和對照品種湘晴種子發(fā)芽后，移植于液體培養(yǎng)基(國際水稻所水稻水培營養(yǎng)液，配方見http://irr1.0rg/)。幼苗生長到4葉時,開始進行耐滲透脅迫、耐低磷和高溫試驗。
[0081]5.2脅迫處理
對于低磷處理，將原營養(yǎng)液配方中的NaH2P04-2H20在重新配制營養(yǎng)液時不添加,然后每隔3天換一次營養(yǎng)液，在第10天觀察幼苗生長高度。
[0082]對于滲透脅迫處理，將營養(yǎng)液中添加200克PEG6000每升，PEG6000處理10天后
換正常營養(yǎng)液，觀察幼苗生長和死亡情況。
[0083]對于高溫處理，夏季高溫期間，將幼苗移植到密閉玻璃溫室中，其晝夜溫度范圍在30-55°C之間，營養(yǎng)液水溫最高超過52°C，培養(yǎng)12天后觀察幼苗生長狀況。
[0084]為了了解這些轉基因植株提高植物耐逆性能力的生理生化原因，將20% PEG6000處理3天的幼苗取葉片，測定葉片中SOD (超氧化物歧化酶)含量。液氮研磨葉片，取0.05g樣品粉末，加Iml生理鹽水(0.86%)，勻漿，3500-4000轉/分鐘離心10min，取上清測定。試劑盒采用南京建成生物研究所總超氧化物歧化酶(T-SOD)測定試劑盒(貨號:A001-1羥胺法)。
[0085]5.3分析結果
使用低磷營養(yǎng)液澆灌水稻幼苗10天后，4個轉基因株系中，有3個轉基因株系H1G072、073和074其株高高度顯著或極顯著高與對照植株，表明這3個轉基因株系耐受低磷能力明顯高于對照，見圖4。說明水稻中過量表達64--基因后明顯提高了水稻耐受低磷營養(yǎng)的能力，能夠促進植物在磷營養(yǎng)貧瘠的土地上正常生長。
[0086]使用PEG6000處理幼苗，發(fā)現(xiàn)3天后轉基因植株和對照植株之間呈現(xiàn)明顯差異，處理時間到第7天時，對照植株開始死亡。第10天復水后統(tǒng)計植株的成活率和生長狀況，編號H1G072-74轉基因植株不僅株高極顯著高于對照，而且其死亡率低于5%，而對照死亡率超過30% (見圖5)。說明超表達該基因后明顯提高了水稻的抗?jié)B透脅迫能力，以及復水后恢復生長的能力。
[0087]在高溫培養(yǎng)間中，對照植株的生長開始受到抑制，隨著時間的延長，對照植株生長緩慢甚至停止，但對照轉基因植株依然能夠較好的生長，其株高顯著明顯優(yōu)于對照(見圖6)，說明轉基因植株在高溫條件下有很好的修復功能，能保證植株在有一定的晝夜溫差的條件下維持植株的正常生長。
[0088]PEG6000處理后檢查水稻植株葉片中SOD含量，發(fā)現(xiàn)轉基因植株中含量均顯著高于對照植株(見圖7)，說明轉基因植株在脅迫來臨后積極改變植株體內的生理生化反應，來抵抗不良的外界環(huán)境。
[0089]實施例5 ,OEGD基因超量表達轉基因水稻在田間抗旱試驗
選取了實施例3.2中所獲得的基因超量表達轉基因T2代家系植株(編號H1G070、71、72、81、83、85和87)進行了穗期干旱脅迫試驗，本實驗分別在海南和上海進行。首先將轉基因植株T2代種子和對照品種湘晴種子催芽后在田間播種。3個星期后將幼苗移栽。海南省冬季干旱脅迫試驗如下:每份材料種植3行，每行7株，當群體內大部分材料進入幼穗分化時期(水稻對水分最敏感時期)，開始排空田間水分，大約2個星期以后，田間開始出現(xiàn)部分植株卷葉，表明開始出現(xiàn)干旱脅迫癥狀。當大部分植株結實并成熟，收獲種子稱重，統(tǒng)計單株平均產(chǎn)量。結果表明，干旱脅迫下，對照品種湘晴單株產(chǎn)量僅為7.27克/株，本發(fā)明克隆的OEGD基因超表達的轉基因植株單株產(chǎn)量大部分超過9克/株，最高的達到10.3克/株，說明在干旱逆境脅迫處理后其產(chǎn)量表現(xiàn)要明顯地優(yōu)于對照(見圖8 )。
[0090]為了提高試驗的精度，在上海大棚中進行了干旱脅迫試驗。將幼苗移栽到大棚水泥池中，每個轉基因株系種植5株，在田間隨機分布，在轉基因植株左右同時種植2株對照植株。當群體內大部分材料進入幼穗分化時期，排空水分進行干旱處理。大約3個星期以后，田間開始出現(xiàn)部分植株卷葉，表明開始出現(xiàn)干旱脅迫癥狀。隨著脅迫程度的加重，部分植株葉片開始枯黃死去，但有部分轉基因植株仍然葉片保持綠色。當大部分植株結實并成熟，收獲種子稱重，統(tǒng)計單株平均產(chǎn)量。將轉基因植株與緊挨的對照植株產(chǎn)量的平均數(shù)進行比較，發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫下，轉基因植株單株產(chǎn)量明顯優(yōu)于對照品種湘晴單株產(chǎn)量(見圖9)，其中對照湘晴植株平均單產(chǎn)為6.2-10.8克/株，而本發(fā)明克隆的OEGD基因超表達的轉基因植株!116072、73、74、87平均單產(chǎn)在17.6-22.6克/株之間，顯著優(yōu)于對照，但株高統(tǒng)計沒有差異。說明在干旱逆境脅迫處理后64--基因的表達可以緩解水稻在進入生殖生長后干旱脅迫造成的植株生長受阻，能有效保護水稻免于非生物脅迫的損壞，提高了植株的結實率和種子灌漿，增強轉基因水稻對非生物逆境的抗性而減少產(chǎn)量的損失。
[0091]實施例6:0E⑶基因超量表達轉基因煙草在田間抗旱試驗 將獲得的轉基因煙草抽提DNA，將PCR檢測陽性的煙草植株進一步繁殖獲得T2代種子。將轉基因煙草陽性T2代種子和對照非轉基因煙草種子直接播種于營養(yǎng)缽中。當煙草苗生長到5片葉時，停止水分灌溉。7天后對照煙草植株葉片開始萎皺，而轉基因煙草植株葉片仍十分舒展。兩個星期后，對照煙草已停止生長，并有一半葉片已經(jīng)枯死，而對照植株葉片才開始萎皺。一個月后，對照植株完全枯死，轉基因煙草仍有2片葉保持綠色。復水三天后，對照煙草無法成活，而轉基因煙草又開始復活，葉片舒展開來，并長出新葉。從以上結果可以看出，在煙草中超表達OE⑶基因，能顯著提高煙草對干旱脅迫的耐受性，提高煙草的成活率。說明該改造基因能應用于多種植物中提高植物對逆境脅迫的抵抗力。
[0092]本發(fā)明的范圍不受所述具體實施方案的限制，所述實施方案只作為闡明本發(fā)明各個方面的單個例子，本發(fā)明范圍內還包括功能等同的方法和組分。實際上，除了本文所述的內容外，本領域技術人員參照上文的描述和附圖可以容易地掌握對本發(fā)明的多種改進。所述改進也落入所附權利要求書的范圍之內。上文提及的每篇參考文獻皆全文列入本文作為參考。
【權利要求】
1.一種提高植物的脅迫耐性的人工融合基因，其特征在于: 該基因具有的多核苷酸序列包含: (a)編碼植物GPDH蛋白的NAD(P)結合功能結構域的多核苷酸序列；和 (b)編碼大腸桿菌gpsA蛋白的NAD_Gly3P脫氫酶功能結構域的多核苷酸序列。
2.如權利要求1所述的人工融合基因，其特征在于: 所述的(b)為采用植物偏好性密碼子人工合成的序列。
3.如權利要求2所述的人工融合基因，其特征在于:該人工融合基因的多核苷酸序列包含如SEQ ID N0.1所示序列。
4.權利要求3所述的人工融合基因編碼的蛋白，其特征在于:該人工融合基因編碼的氨基酸序列包含如SEQ ID N0.2所示序列。
5.含有權利要求1所述的人工融合基因的重組載體。
6.采用權利要求5所述的重組載體轉化的宿主細胞。
7.—種生產(chǎn)脅迫耐性的轉基因植物的方法，其特征在于: 該方法包括以下步驟: 1)將權利要求1所述的人工融合基因可操作地連接于植物表達調控序列，形成植物表達載體； 2)將步驟I)所得的植物表達載體轉入植物細胞； 3)經(jīng)篩選獲得的轉化細胞，再生為植物及其后代，所述的植物包括植物細胞、植物組織或植物種子。
8.權利要求7所述的方法，其特征在于:所述的植物選自水稻、玉米、小麥、大麥、黍、高粱、大豆、黃瓜、苜蓿、馬鈴薯、蓖麻、花生、棉花、煙草、柑橘或黃瓜中任意一種。
9.權利要求1所述的人工融合基因在制備具有脅迫耐性的轉基因植物方面的用途。
【文檔編號】C12N5/10GK103911386SQ201410153854
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月16日 優(yōu)先權日:2014年4月16日
【發(fā)明者】余舜武, 李天菲, 陳晨, 吳金紅, 羅利軍 申請人:上海市農業(yè)生物基因中心