一種單細(xì)胞克隆培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種單細(xì)胞克隆培養(yǎng)方法，包括：步驟1，制備培養(yǎng)液微滴；步驟2，準(zhǔn)備顯微操作系統(tǒng)；步驟3，篩選單克隆細(xì)胞；步驟4，利用步驟2所述的顯微操作系統(tǒng)將操作針內(nèi)的目標(biāo)細(xì)胞以每個(gè)液滴放一枚細(xì)胞逐一放入步驟1的培養(yǎng)液微滴內(nèi)，然后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；步驟5，將步驟4培養(yǎng)的細(xì)胞在培養(yǎng)2天后進(jìn)行半量換液；步驟6，擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得單細(xì)胞克隆。利用本發(fā)明的方法，培養(yǎng)液微滴之間的石蠟油隔絕了微滴之間的接觸，保證了細(xì)胞克隆的單一性；同時(shí)由于培養(yǎng)液微滴的體積為5μl以下，所培養(yǎng)細(xì)胞分泌的生物因子不被過度稀釋，為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了一個(gè)很好的微環(huán)境。
【專利說明】一種單細(xì)胞克隆培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種單細(xì)胞克隆培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前所用的單細(xì)胞克隆培養(yǎng)方法是將細(xì)胞無限稀釋，達(dá)到一定的稀釋濃度后在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)或加入96孔板培養(yǎng)，以實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞的獨(dú)立生長(zhǎng)成為克隆。培養(yǎng)皿中培養(yǎng)時(shí)，在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的細(xì)胞在貼壁前處于漂浮狀態(tài)，很容易與另一個(gè)細(xì)胞接觸或在同一個(gè)地方貼壁形成一個(gè)克隆，隨著細(xì)胞增殖數(shù)目增多，處于分裂狀態(tài)的細(xì)胞由于貼壁性較差，也會(huì)移動(dòng)到別的細(xì)胞克隆里，不能完全保證克隆的單一來源性；另一方面由于最開始培養(yǎng)時(shí)為了防止細(xì)胞密度太大而導(dǎo)致多個(gè)細(xì)胞接觸成為一個(gè)克隆，細(xì)胞密度很低，使得細(xì)胞所處的環(huán)境非常大，細(xì)胞自身分泌的一些因子被極度稀釋，影響了細(xì)胞的自我調(diào)節(jié)和生長(zhǎng)速度。在96孔板培養(yǎng)時(shí)，由于細(xì)胞的沉降速度存在差異，或者邊緣角落不容易看清楚，以及最少20 μ I的培養(yǎng)體系，存在相同的隱患和不足。此外，在篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞時(shí)，由于部分細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低下，當(dāng)轉(zhuǎn)染后只獲得數(shù)量很少的陽(yáng)性細(xì)胞時(shí)，進(jìn)行常規(guī)藥物篩選和單克隆培養(yǎng)具有很大的難度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提出一種單細(xì)胞克隆培養(yǎng)方法，以解決單細(xì)胞克隆純度無法保證及培養(yǎng)困難的問題和低轉(zhuǎn)染效率細(xì)胞篩選難的問題。
[0004]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案:一種單細(xì)胞克隆培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0005]步驟1，制備培養(yǎng)液微滴:在培養(yǎng)皿的間隔位置逐一地加入第一體積的培養(yǎng)液，形成液滴；隨后用石蠟油覆蓋所述液滴，然后再向每個(gè)液滴內(nèi)補(bǔ)入第二體積的培養(yǎng)液，形成培養(yǎng)液微滴；將其放入培養(yǎng)箱平衡，等待細(xì)胞的放入；
[0006]步驟2，準(zhǔn)備顯微操作系統(tǒng):利用拉針儀拉制出細(xì)胞操作針，并安裝到顯微操作儀上；
[0007]步驟3，篩選單克隆細(xì)胞:將待篩選的細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液并放入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，利用步驟2所述的顯微操作系統(tǒng)根據(jù)篩選要求挑選目標(biāo)細(xì)胞，將目標(biāo)細(xì)胞逐一吸入顯微操作針內(nèi)；
[0008]步驟4，利用步驟2所述的顯微操作系統(tǒng)將操作針內(nèi)的目標(biāo)細(xì)胞以每個(gè)液滴培養(yǎng)一枚細(xì)胞逐一放入步驟I的培養(yǎng)液微滴內(nèi)，然后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；
[0009]步驟5，對(duì)步驟4中所培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)過2天培養(yǎng)后，進(jìn)行半量換液；
[0010]步驟6，擴(kuò)大培養(yǎng):對(duì)步驟4中經(jīng)過4~5天培養(yǎng)形成的細(xì)胞克隆進(jìn)行消化處理，分別將每個(gè)培養(yǎng)液微滴中消化出的細(xì)胞移入96孔板進(jìn)行培養(yǎng)，獲得細(xì)胞數(shù)量更多的單細(xì)胞克隆。
[0011]如上所述的單細(xì)胞克隆培養(yǎng)方法，進(jìn)一步，步驟1，第一體積的培養(yǎng)液的體積為I~2.5 μ 1，第二體積的培養(yǎng)液的體積為I~2.5 μ 1，培養(yǎng)液微滴總體積為2~5 μ 1，形成
培養(yǎng)液微滴。
[0012]如上所述的單細(xì)胞克隆培養(yǎng)方法，進(jìn)一步，在顯微操作系統(tǒng)的顯微鏡觀察下，將目標(biāo)細(xì)胞利用顯微操作系統(tǒng)逐一收集。
[0013]如上所述的單細(xì)胞克隆培養(yǎng)方法，進(jìn)一步，所述半量換液是指吸去培養(yǎng)液微滴一半體積的培養(yǎng)液，重新補(bǔ)入37°C的與吸出體積相同的新鮮培養(yǎng)液。
[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:
[0015]本研究利用顯微操作系統(tǒng)和培養(yǎng)液微滴培養(yǎng)體系，可以在高倍鏡下仔細(xì)的挑選優(yōu)質(zhì)待篩選的細(xì)胞，再逐個(gè)的放入制作好的培養(yǎng)液微滴中，由于培養(yǎng)液微滴之間的石蠟油隔絕了微滴之間的接觸，而且放入細(xì)胞時(shí)是從顯微鏡中明確觀察到，不會(huì)存在多放入的情況，也避免了細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)時(shí)的細(xì)胞相互“串門”，保證了細(xì)胞克隆的單一性；同時(shí)由于培養(yǎng)液微滴的體積為5 μ 1，在細(xì)胞分泌生物因子后能夠很好的保證因子的濃度不擴(kuò)散，為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了一個(gè)很好的微環(huán)境。此外，由于是人為挑選，所以會(huì)對(duì)稀缺細(xì)胞實(shí)現(xiàn)高效篩選。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定。
[0017]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中單細(xì)胞克隆培養(yǎng)方法的缺點(diǎn)，本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思如下:一種單細(xì)胞克隆培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0018]步驟1，制備培養(yǎng)液微滴:在培養(yǎng)皿的間隔位置逐一地加入第一體積的培養(yǎng)液，形成液滴；隨后用石蠟油覆蓋所述液滴，然后再向每個(gè)液滴內(nèi)補(bǔ)入第二體積的培養(yǎng)液，并使液滴總體積不超過5 μ 1，形成培養(yǎng)液微滴；將其放入培養(yǎng)箱平衡，等待細(xì)胞的放入；步驟2，準(zhǔn)備顯微操作系統(tǒng):利用拉針儀拉制出細(xì)胞操作針，并安裝到顯微操作儀上；步驟3，篩選單克隆細(xì)胞:將待篩選的細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液并放入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，利用步驟2所述的顯微操作系統(tǒng)根據(jù)篩選要求挑選目標(biāo)細(xì)胞，將目標(biāo)細(xì)胞逐一放入顯微操作針內(nèi)；步驟4，利用步驟2所述的顯微操作系統(tǒng)將操作針內(nèi)的目標(biāo)細(xì)胞逐一放入步驟I的培養(yǎng)液微滴內(nèi)，然后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；步驟5，對(duì)步驟4形成的細(xì)胞培養(yǎng)微滴進(jìn)行半量換液，即吸出2.5ul原有培養(yǎng)液，重新補(bǔ)入2.5ul溫度為37°C的新培養(yǎng)液；步驟6，擴(kuò)大培養(yǎng):對(duì)步驟4中培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行消化處理，分別將每個(gè)培養(yǎng)液微滴中消化出的細(xì)胞移入96孔板進(jìn)行培養(yǎng)，獲得單細(xì)胞克隆。
[0019]由上述步驟可知，通過本發(fā)明方法，單個(gè)的細(xì)胞被置于單個(gè)的分離培養(yǎng)液微滴中培養(yǎng)，這樣就客服了兩個(gè)現(xiàn)有技術(shù)中的難題:其一是，在培養(yǎng)液微滴中培養(yǎng)的細(xì)胞不會(huì)發(fā)生移動(dòng)到別的細(xì)胞克隆里，能夠完全保證克隆的單一來源性；另一方面，細(xì)胞所處的環(huán)境很小，細(xì)胞自身分泌的一些因子被稀釋程度低，有利于細(xì)胞的自我調(diào)節(jié)和快速生長(zhǎng)。
[0020] 本方法所獲得的每一個(gè)單克隆，其細(xì)胞同源性(即遺傳物質(zhì)完全相同)均為100%，無需證明，而用常規(guī)方法所獲得的單克隆，其細(xì)胞同源性從50%~100%，都有可能，需要進(jìn)一步證明其同源性；在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選中本方法可提高正篩選的效率，不需要負(fù)篩選基因的導(dǎo)入，為轉(zhuǎn)染前的載體構(gòu)建節(jié)約了時(shí)間，也避免了進(jìn)行負(fù)篩選時(shí)G418等藥物對(duì)細(xì)胞的損傷。[0021 ] 細(xì)胞在體內(nèi)或體外生長(zhǎng)的時(shí)候會(huì)通過旁分泌的方式向周圍組織液或培養(yǎng)液分泌一些促進(jìn)自我生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)因子和功能因子，能夠更好的調(diào)節(jié)自身生長(zhǎng)；在常規(guī)單克隆篩選時(shí)，一般用IOcm培養(yǎng)皿加IOml培養(yǎng)液培養(yǎng)約100個(gè)細(xì)胞，太多則影響單細(xì)胞克隆的形成，這樣平均每個(gè)細(xì)胞周圍有IOOul培養(yǎng)液，用96孔板篩選時(shí)每孔最少加20ul培養(yǎng)液，平均每個(gè)細(xì)胞周圍20 μ I培養(yǎng)液，而用本培養(yǎng)方法，每個(gè)細(xì)胞周圍最多5 μ I培養(yǎng)液，其自分泌的因子濃度是96孔板培養(yǎng)液的4倍，是培養(yǎng)皿篩選法的20倍，因此更有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。
[0022]用本方法進(jìn)行單克隆培養(yǎng)，在96小時(shí)后一個(gè)細(xì)胞可增殖為近300枚細(xì)胞，120小時(shí)后可增殖為近800枚細(xì)胞，此時(shí)消化后移入96孔板培養(yǎng)，3天后可長(zhǎng)滿，耗時(shí)約8天；而用常規(guī)方法必須進(jìn)行負(fù)篩選，96小時(shí)后非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞還未被全部殺滅，96孔培養(yǎng)方式要使細(xì)胞長(zhǎng)滿也需10~15天，因此為單克隆細(xì)胞的獲得節(jié)約了時(shí)間。
[0023]實(shí)施例1
[0024]利用單細(xì)胞克隆培養(yǎng)方法培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞，包括以下步驟:
[0025]1、用含 20%胎牛血清(FBS)的 DMEM(dulbecco’s modified eagle medium)培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿中制作5μ I的微滴；液滴制作分兩步，首先
[0026]在培養(yǎng)皿的間隔位置逐一地加入2.5 μ I培養(yǎng)液,形成液滴；隨后用石臘油覆蓋所述液滴，然后再向每個(gè)液滴內(nèi)補(bǔ)入2.5μ I培養(yǎng)液，使液滴總體積為5 μ 1，形成培養(yǎng)液微滴；將其放入培養(yǎng)箱平衡，等待細(xì)胞的放入；
[0027]2、準(zhǔn)備顯 微操作系統(tǒng):利用拉針儀(Narishige公司，型號(hào)ΡΝ-30)制作內(nèi)徑為20 μ m前端鈍口的細(xì)胞操作針，安裝到顯微操作儀(Eppendorf公司，型號(hào)NK2)；
[0028]3、篩選單克隆細(xì)胞:將前一天轉(zhuǎn)染紅色熒光蛋白的綿羊成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液吸干，用PBS清洗一遍，然后加入0.2~Iml胰酶消化液(PBS胰蛋白酶和EDTA的混合液，其中胰蛋白酶0.2wt%, EDTA0.02wt% )消化I分鐘左右，加入足量含血清培養(yǎng)液中和消化，再用Iml移液器吹打皿底10次左右后將所得細(xì)胞懸液2000rpm離心5分鐘收集細(xì)胞，離心后吸去上清，最后加入1ml細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，放入直徑6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在安裝有顯微操作系統(tǒng)的倒置顯微鏡上，利用步驟2制作的顯微操作針進(jìn)行篩選細(xì)胞，在熒光顯微鏡下挑選紅色、圓形、白光下胞質(zhì)均勻的細(xì)胞逐個(gè)吸入顯微操作針內(nèi)，在吸入約20個(gè)細(xì)胞時(shí)進(jìn)行下一步操作；
[0029]4、利用步驟2所述的顯微操作系統(tǒng)在視野下逐個(gè)將操作針內(nèi)的綿羊成纖維細(xì)胞放入步驟I制作的培養(yǎng)微滴中，而且每滴只釋放并培養(yǎng)一個(gè)，然后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；
[0030]5、將培養(yǎng)的單細(xì)胞每天進(jìn)行觀察，在生長(zhǎng)達(dá)到30%覆蓋皿底時(shí)(48小時(shí))進(jìn)行半量換培養(yǎng)液(從每個(gè)培養(yǎng)液微滴吸取出2.5 μ 1，再加入2.5 μ I培養(yǎng)箱37°C平衡新培養(yǎng)液)；
[0031]6、擴(kuò)大培養(yǎng):當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%匯合度時(shí)(120小時(shí))，吸去大部分培養(yǎng)液，用37度預(yù)熱的PBS (磷酸緩沖液)輕柔洗滌多次，然后加入胰酶消化處理，將一個(gè)微滴中消化出的細(xì)胞(500~800枚)移入96孔板進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)，3天后長(zhǎng)滿獲得單細(xì)胞克隆。
[0032]實(shí)施例2
[0033]利用單細(xì)胞克隆培養(yǎng)方法篩選培養(yǎng)成肌細(xì)胞，包括以下步驟:
[0034]1、用含 20%胎牛血清(FBS)的 DMEM(dulbecco’s modified eagle medium)培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿中制作5μ I的微滴；液滴制作分兩步，首先[0035]在培養(yǎng)皿的間隔位置逐一地加入2.5μ I培養(yǎng)液，形成液滴；隨后用石蠟油覆蓋所述液滴，然后再向每個(gè)液滴內(nèi)補(bǔ)入2.5μ I培養(yǎng)液，使液滴總體積為5 μ 1，形成培養(yǎng)液微滴；將其放入培養(yǎng)箱平衡，等待細(xì)胞的放入；
[0036]2、準(zhǔn)備顯微操作系統(tǒng):利用拉針儀(Narishige公司，型號(hào)ΡΝ-30)制作內(nèi)徑為12 μ m前端鈍口的細(xì)胞操作針，安裝到顯微操作儀(Eppendorf公司，型號(hào)NK2)；
[0037]3、篩選單克隆細(xì)胞:將肌細(xì)胞培養(yǎng)液吸干，用PBS清洗一遍，然后加入0.2~Iml胰酶消化液(PBS胰蛋白酶和EDTA的混合液，其中胰蛋白酶0.2wt%,EDTA0.02wt% )消化I分鐘左右，加入足量含血清培養(yǎng)液中和消化，再用Iml移液器吹打皿底10次左右后將所得細(xì)胞懸液2000rpm離心5分鐘收集細(xì)胞，離心后吸去上清，最后加入1ml細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，放入直徑6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在安裝有顯微操作系統(tǒng)的倒置顯微鏡上，利用步驟I制作的顯微操作針進(jìn)行篩選細(xì)胞，在熒光顯微鏡下挑選直徑ΙΟμπι圓形、顏色偏深的成肌細(xì)胞，將細(xì)胞逐個(gè)吸入顯微操作針內(nèi)，在吸入約20個(gè)細(xì)胞時(shí)進(jìn)行下一步操作；
[0038]4、利用步驟2所述的顯微操作系統(tǒng)在視野下逐個(gè)將操作針內(nèi)的成肌細(xì)胞放入步驟I制作的培養(yǎng)微滴中，而且每滴只釋放并培養(yǎng)一個(gè)，然后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；
[0039]5、將培養(yǎng)的單細(xì)胞每天進(jìn)行觀察，在生長(zhǎng)達(dá)到30%覆蓋皿底時(shí)(48小時(shí))進(jìn)行半量換培養(yǎng)液(從每個(gè)培養(yǎng)液微滴吸取出2.5 μ 1，再加入2.5 μ I新培養(yǎng)液)； [0040]6、擴(kuò)大培養(yǎng):當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%匯合度時(shí)(120小時(shí))，吸去大部分培養(yǎng)液，用37度預(yù)熱的PBS (磷酸緩沖液)輕柔洗滌多次，然后加入胰酶消化處理，將一個(gè)微滴中消化出的細(xì)胞(500~800枚)移入96孔板進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)，3天后長(zhǎng)滿獲得單細(xì)胞克隆。
[0041]以上實(shí)施例僅為本發(fā)明的示例性實(shí)施例，不用于限制本發(fā)明，本發(fā)明的保護(hù)范圍由權(quán)利要求書限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)本發(fā)明做出各種修改或等同替換，這種修改或等同替換也應(yīng)視為落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種單細(xì)胞克隆培養(yǎng)方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: 步驟I，制備培養(yǎng)液微滴:在培養(yǎng)皿的間隔位置逐一地加入第一體積的培養(yǎng)液，形成液滴；隨后用石蠟油覆蓋所述液滴，然后再向每個(gè)液滴內(nèi)補(bǔ)入第二體積的培養(yǎng)液，形成培養(yǎng)液微滴；將其放入培養(yǎng)箱平衡，等待細(xì)胞的放入； 步驟2，準(zhǔn)備顯微操作系統(tǒng):利用拉針儀拉制出細(xì)胞操作針，并安裝到顯微操作儀上； 步驟3，篩選單克隆細(xì)胞:將待篩選的細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液并放入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，利用步驟2所述的顯微操作系統(tǒng)根據(jù)篩選要求挑選目標(biāo)細(xì)胞，將目標(biāo)細(xì)胞逐一吸入顯微操作針內(nèi)； 步驟4，利用步驟2所述的顯微操作系統(tǒng)將操作針內(nèi)的目標(biāo)細(xì)胞以每個(gè)液滴培養(yǎng)一枚細(xì)胞逐一放入步驟I的培養(yǎng)液微滴內(nèi)，然后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)； 步驟5，對(duì)步驟4中所培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)過2天培養(yǎng)后，進(jìn)行半量換液； 步驟6，擴(kuò)大培養(yǎng):對(duì)步驟4中經(jīng)過4~5天培養(yǎng)形成的細(xì)胞克隆進(jìn)行消化處理，分別將每個(gè)培養(yǎng)液微滴中消化 出的細(xì)胞移入96孔板進(jìn)行培養(yǎng)，獲得細(xì)胞數(shù)量更多的單細(xì)胞克隆。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單細(xì)胞克隆培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟1，第一體積的培養(yǎng)液的體積為I~2.5 μ 1，第二體積的培養(yǎng)液的體積為I~2.5 μ 1，培養(yǎng)液微滴總體積為2~5μ I,形成培養(yǎng)液微滴。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單細(xì)胞克隆培養(yǎng)方法，其特征在于，在顯微操作系統(tǒng)的顯微鏡觀察下，將目標(biāo)細(xì)胞利用顯微操作系統(tǒng)逐一收集。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單細(xì)胞克隆培養(yǎng)方法，其特征在于，所述半量換液是指吸去培養(yǎng)液微滴一半體積的培養(yǎng)液，重新補(bǔ)入37 °C的與吸出體積相同的新鮮培養(yǎng)液。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK103923876SQ201410166605
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年4月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月23日
【發(fā)明者】王立民, 周平, 甘尚權(quán), 唐紅, 郭延華, 張譯元 申請(qǐng)人:新疆農(nóng)墾科學(xué)院