一株l-鳥氨酸合成菌的構(gòu)建及其應(yīng)用方法
【專利摘要】本發(fā)明敲除鈍齒棒桿菌(Corynebacteriumcrenatum)SYPA5-5中編碼鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(Ornithinecarbamoyltransferase，OTC)的argF基因，對(duì)獲得的重組菌株進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)L-鳥氨酸的研究，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。首先，構(gòu)建argF基因內(nèi)缺失片段(△argF)，連接至pK18mobsacB中獲得重組質(zhì)粒pK18mobsacB△argF，將其電轉(zhuǎn)入SYPA5-5中，經(jīng)兩次同源重組，篩選獲得重組菌株SYPA5-5△argF。其次，考察不同營養(yǎng)條件對(duì)重組菌株生長及L-鳥氨酸積累的影響，發(fā)現(xiàn)添加0.3g/LL-精氨酸可滿足SYPA5-5△argF的生長及L-鳥氨酸積累所需，利用糖質(zhì)原料，發(fā)酵96h，L-鳥氨酸產(chǎn)量可達(dá)21.5g/L，糖酸轉(zhuǎn)化效率為0.17g(L-ornithine)/g(glucose)。
【專利說明】一株L-鳥氨酸合成菌的構(gòu)建及其應(yīng)用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]敲除純齒棒桿菌iCorynebacteriumcrenatundSWkf^中編碼鳥氨酸乙酸轉(zhuǎn)移酶(Ornithine carbamoyl transferase, 0TC)的基因，并對(duì)獲得的重組菌株進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)L-鳥氨酸的研究，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]L-鳥氨酸(L-ornithine)為非蛋白質(zhì)氨基酸，是尿素循環(huán)的重要中間代謝產(chǎn)物，因具有重要的生理功能而廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及化工領(lǐng)域。微生物發(fā)酵法有節(jié)能環(huán)保、易提取分離等優(yōu)點(diǎn)，具有重要的工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。
[0003]實(shí)現(xiàn)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸的關(guān)鍵在于高產(chǎn)菌株的選育。代謝工程作為理性育種的技術(shù)手段被廣泛應(yīng)用于工業(yè)微生物的改造。目前，該技術(shù)已應(yīng)用于L-鳥氨酸高產(chǎn)菌株的構(gòu)建。Lee YJ 等構(gòu)建的大腸桿菌 W3110 ( AargF AargR Apro^ Δ speV, ParaB-ar^-214)在添加谷氨酸的條件下發(fā)酵，可積累13.2 mg/g (dry cell weight) L-鳥氨酸；Jiang LY等構(gòu)建的谷氨酸棒桿菌ATCC13032 ( Δ argV Δ argR ΔproV> Δ spe^)，經(jīng)生長偶聯(lián)的菌株馴養(yǎng)后，可積累17.2 g/L L-鳥氨酸。但上述L-鳥氨酸生產(chǎn)菌株仍存在產(chǎn)量不高或攜帶外源質(zhì)粒等問題，限制了其工業(yè)化應(yīng)用。
[0004]純齒棒桿菌SYPA5-5是本研究室經(jīng)過多級(jí)誘變篩選獲得的一株L-精氨酸高產(chǎn)菌株，利用葡萄糖為碳源，搖瓶發(fā)酵96 h可積累約30 g/L L-精氨酸。L-精氨酸的生物合成是以L-谷氨酸為前體，先通過5步酶促反應(yīng)生成L-鳥氨酸；再經(jīng)鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶( Ornithine carbamoyltransferase,0TC)將L-鳥氨酸轉(zhuǎn)化為L-瓜氨酸；最后，在精胺琥拍酸合成酶(Argininosuccinate synthase, ASS)和精胺琥拍酸裂解酶(Argininosuccinase,ASL)催化下合成L-精氨酸。前期研究表明，SYPA5-5發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸的過程中，中間代謝物L(fēng)-鳥氨酸的積累量較低。本研究以SYPA5-5為出發(fā)菌株，敲除其編碼鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶的基因阻斷L-鳥氨酸進(jìn)一步合成L-精氨酸的途徑，構(gòu)建了能夠積累L-鳥氨酸的重組菌株SYPA5-5 Λ ar^F，并研究了其發(fā)酵性能，為實(shí)現(xiàn)采用糖質(zhì)原料直接發(fā)酵生產(chǎn)上述氨基酸奠定了基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供合成L-鳥氨酸的鈍齒棒桿菌iCorynebacterium crena turn)SYPA5-5 的構(gòu)建及發(fā)酵生產(chǎn)L-鳥氨酸的方法。該菌株是利用SYPA5-5為出發(fā)菌株，以自殺質(zhì)粒pK18mohsacB對(duì)其基因進(jìn)行敲除后獲得,在添加300 mM L-精氨酸條件下，利用糖質(zhì)原料發(fā)酵96 h，積累21.5 g/L L-鳥氨酸，該菌株已經(jīng)保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保存號(hào)為CGMCCN0.8637，保存日期為2013年12月25日。本發(fā)明提供的方法屬于基金項(xiàng)目:國家863資助項(xiàng)目(N0.2012AA022102)的研究內(nèi)容。具體發(fā)明方案如下:
1.重組菌株SYPA5-5 Δ argV的構(gòu)建以SYPA5-5基因組DNA為模板，分別以F1/F2、F3/F4為引物，擴(kuò)增argF上、下游片段，通過crossover PCR擴(kuò)增獲得基因內(nèi)缺失片段(Λ ar^F)。將獲得的Λ 連入pK18mohsacB質(zhì)粒得到重組質(zhì)粒pK18mohsacB arg?。將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入SYPA5-5感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)兩次同源重組，對(duì)獲取的轉(zhuǎn)化子，提取基因組，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并送至上海生工測(cè)序。
[0006]引物序列如下:
【權(quán)利要求】
1.構(gòu)建一株利用糖質(zhì)原料發(fā)酵大量積累L-鳥氨酸的菌株的方法，其特征為:出發(fā)菌株分類命名為純齒棒桿菌iCorynebacterium crenaturn) SYPA5-5 I^arg?,已保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌株保存號(hào)為CGMCC N0.8637，保存日期為2013年12月25日。
2.權(quán)利要求1中所述的方法，其特征為:利用高產(chǎn)L-精氨酸的鈍齒棒桿菌{Corynebac teri um crena turn) SYPA5-5為出發(fā)菌株，以pK18mohsacB質(zhì)粒對(duì)其編碼鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(Ornithine carbamoyl transferase, OTC)的a/yF基因進(jìn)行敲除,篩選獲得的重組菌株可積累L-鳥氨酸。
3.利用糖質(zhì)原料發(fā)酵大量積累L-鳥氨酸的方法，其特征為: (1)種子活化:將斜面保存的菌種劃線于肉湯斜面中，30°C靜置培養(yǎng)24h ;肉湯培養(yǎng)基組分(g/L):葡萄糖20;蛋白胨10;牛肉膏10 ;酵母粉5 ;NaCl 5 ;瓊脂粉20 ;pH 7.0~7.2 ;121 V高壓蒸汽滅菌20 min ； (2)搖瓶種子:將活化后的種子，挑取一環(huán)接種于搖瓶種子培養(yǎng)基中，30°C120 rpm往復(fù)式搖床培養(yǎng)12-16 h，至OD562nm約為15 ;種子培養(yǎng)基組分(g/L):葡萄糖30 ;玉米漿20 ；(NH4)2SO4 20 ；KH2PO41 ；MgS04.7H20 0.5 ;尿素 1.5 ；ρΗ 7.0 ~7.2 ；121 °C 高壓蒸汽滅菌 20m in ； (3)搖瓶發(fā)酵:將液體種子按5%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C120 rpm往復(fù)式搖床培養(yǎng)96 h,發(fā)酵至24 h補(bǔ)加50 g/L葡萄糖；搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基組分(g/L):葡萄糖(分消)100 ;酵母粉 10 ； (NH4)2SO4 50 ；KH2PO41.5 ；MgS04.7H20 0.5 ；FeS04.7H20 0.02 ；MnSO4.H2O0.02;生物素 8 XlO-5 ;L-組氨酸 5Χ10-4 ;CaC03 30 ；pH 7.0 ~7.2; 115 °C高壓蒸汽滅菌 7min。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征為:添加適量L-精氨酸以有利于菌體的生長及L-鳥氨酸的積累。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK104031933SQ201410191782
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年5月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月8日
【發(fā)明者】許正宏, 竇文芳, 史勁松, 趙芹芹, 羅玉常, 張曉梅, 耿燕, 劉雪 申請(qǐng)人:江南大學(xué)