一種無(wú)引物的基因合成方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種無(wú)引物的基因合成方法，屬于基因的人工合成領(lǐng)域。本發(fā)明首先公開(kāi)了一個(gè)pNew載體質(zhì)粒，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO.33所示。本發(fā)明還公開(kāi)了用pNew載體質(zhì)粒構(gòu)建的包含有16384(47)個(gè)質(zhì)粒的載體庫(kù)。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了一種無(wú)引物的基因合成方法，包括以下步驟：(1)將待合成的目標(biāo)基因DNA序列按照每個(gè)片段82bp進(jìn)行分組；(2)將分組的片段分別在構(gòu)建的質(zhì)粒庫(kù)中找到對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒；(3)將對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒酶切，用抗生素篩選，重構(gòu)得到含82bp目的基因序列的質(zhì)粒；(4)通過(guò)金門(mén)克隆反應(yīng)將基因片段拼接成完整的目的基因。本發(fā)明基因合成方法不需要利用引物，合成成本低，突變率極其低，準(zhǔn)確率高，可以合成諸如高度重復(fù)序列、Poly?A等特殊的基因序列，操作簡(jiǎn)單，能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。
【專(zhuān)利說(shuō)明】【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明涉及一種基因合成方法，尤其涉及一種基于庫(kù)的無(wú)引物基因合成方法，屬 于基因合成【技術(shù)領(lǐng)域】。 一種無(wú)引物的基因合成方法 【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)合成生物學(xué)，特別是基因合成技術(shù)的研究進(jìn)展非常迅速。目前，全基因合成 是依照某一蛋白質(zhì)的核苷酸序列，首先設(shè)計(jì)合成相互重疊的單鏈寡核苷酸，再通過(guò)重疊延 伸PCR法拼接出全長(zhǎng)的基因序列，在此基因合成過(guò)程中無(wú)需模板，是目前獲取基因的有效 手段之一。
[0003] 迄今為止，已經(jīng)報(bào)道的基因合成方法都是依賴(lài)于化學(xué)合成的寡核苷酸引物，主要 包括以下幾種方法：（1)化學(xué)合成法，由于化學(xué)合成法的原理本身存在著一定程度的缺陷， 這些缺陷決定了化學(xué)法合成的DNA片段不可能太長(zhǎng)，化學(xué)合成法主要用于寡核苷酸的合 成；（2) PCR介導(dǎo)的合成方法，這種方法可以合成大的DNA片段，而且周期也比較短，但PCR 介導(dǎo)的合成方法錯(cuò)誤率比較高，對(duì)于合成大于2kb以上的DNA其錯(cuò)誤率更高，因此為了得到 大的DNA片段的正確克隆，可能需要多次克隆和測(cè)序的重復(fù)工作，這樣會(huì)額外的增加基因 合成的成本，而且由于是PCR介導(dǎo)的方法，需要DNA高溫聚合酶和dNTP等試劑，這樣也會(huì)增 加基因合成的成本；（3)非PCR介導(dǎo)的方法，到目前為止報(bào)道的基于非PCR的DNA合成方法 主要是DNA的固相合成技術(shù)。這種固相合成技術(shù)，其合成的錯(cuò)誤率大大降低，但是由于在合 成過(guò)程中需要使用經(jīng)過(guò)特殊修飾的引物，這樣就會(huì)導(dǎo)致引物的成本增加，從而導(dǎo)致后續(xù)基 因合成的成本增加。同時(shí)，固相合成技術(shù)依賴(lài)特殊的儀器設(shè)備，無(wú)法滿足普通實(shí)驗(yàn)室和科研 單位的需求。
[0004] 隨著合成生物學(xué)的研究進(jìn)展，特別是基因合成技術(shù)方法研究的不斷深入，目前急 需開(kāi)發(fā)一種新的基因合成方法，建立一種能夠以相對(duì)低廉的價(jià)格，在短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確和高效 的合成長(zhǎng)片段基因的方法，以解決現(xiàn)有基因合成技術(shù)中存在的錯(cuò)誤率高，合成成本高等問(wèn) 題。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的主要目的是提供一種無(wú)引物的基因合成方法；
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供了一種用于基因合成用的pNew載體質(zhì)粒；其核 苷酸序列為SEQ ID N0. 33所示；
[0007] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種構(gòu)建所述pNew載體質(zhì)粒的方法，該方法包括：
[0008] (1)構(gòu)建獲得核苷酸序列為SEQ ID N0. 21所示的線性載體骨架pNew ;
[0009] (2)擴(kuò)增核苷酸序列為SEQ ID NO. 27所示的抗性基因片段5SGCK以及核苷酸序列 為 SEQ ID N0. 32 所示的 3KCGS ;
[0010] (3)將線性載體骨架pNew、抗性基因片段5SGCK和抗性基因片段3KCGS克隆到一 個(gè)完整的載體上，即得所述pNew載體質(zhì)粒。
[0011] 本發(fā)明以pet23a質(zhì)粒為模版，以ori-PF/ori-PR為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到線性 載體骨架pNew(1.9kb)，其核苷酸序列為SEQ ID N0. 21所示；在PCR過(guò)程中通過(guò)引物ori-PR 引進(jìn)限制性?xún)?nèi)切酶BseRI的識(shí)別位點(diǎn)。
[0012] 本發(fā)明分別以質(zhì)粒RNALIC、pDEST32、pet28b和pet23a為模板，設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR 擴(kuò)增 5Spc 片段（656bp)、5Gem 片段（535bp)、5Cam 片段（371bp)、5Kana 片段（556bp)和 Amp 盒式結(jié)構(gòu)（969bp)，擴(kuò)增的上述片段5'或3'端分別引入了適宜的限制性酶切位點(diǎn)；每個(gè) 片段之間都引入了 18_20bp的同源序列，再把這幾個(gè)片段逐次做重疊延伸PCR，即通過(guò)引物 5Spc-PF和5Gem-PR擴(kuò)增將5Spc片段和5Gem片段連接；通過(guò)引物5Spc-PF和5Cam-PR擴(kuò)增 將5Spc5Gem片段與5Cam片段連接；通過(guò)引物5Spc-PF和5Kana-PR擴(kuò)增將5Spc5Gem5Cam 片段與5Kana片段連接；通過(guò)引物5Spc-PF和Amp-PR擴(kuò)增將5Spc5Gem5Cam5Kana片段與 Amp盒式結(jié)構(gòu)連接得到一個(gè)大片段5SGCK(3kb)，其核苷酸序列為SEQ ID N0. 27所示。
[0013] 本發(fā)明分別以質(zhì)粒pet28b、pDEST32和RNALIC為模板，設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增 3Kana 片段（531bp)、3Cam 片段（566bp)、3Gem 片段（279bp)和 3Spc 片段（387bp)，擴(kuò)增的 上述片段5'或3'端分別引入了適宜的限制性酶切位點(diǎn)；每個(gè)片段之間都引入了 18-20bp 的同源序列，再把這幾個(gè)片段逐次做重疊延伸PCR，即通過(guò)引物3Kana-PF和3Cam-PR擴(kuò)增 將3Kana片段和3Cam片段連接；通過(guò)引物3Kana-PF和3Gem-PR擴(kuò)增將3Kana3Cam片段與 3Gem片段連接；通過(guò)引物3Kana-PF和3Spc-PR擴(kuò)增將3Kana3Cam3Gem片段與3Spc片段連 接得到一個(gè)大片段3KCGS(1. 7kb)，其核苷酸序列為SEQ ID N0. 32所示。
[0014] 通過(guò)無(wú)酶克隆的方式（Zhu D, Zhong X，Tan R, Chen L, Huang G, Li J, et al. High-throughput cloning of human liver complete open reading framesusing homologous recombination in Escherichia coli. [J]Anal Biochem. 2010； 397 (2) : 162-167)把3個(gè)片段：線性載體骨架pNew、5SGCK、3KCGS克隆到一個(gè)完整的載體 上。經(jīng)過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶酶切和測(cè)序鑒定得到正確的pNew載體質(zhì)粒，其核苷酸序列為SEQ ID Ν0· 33所示，命名為pNew載體質(zhì)粒。
[0015] 本發(fā)明進(jìn)一步用獲得的pNew載體質(zhì)粒構(gòu)建一個(gè)包含有16384(47)個(gè)質(zhì)粒的載體 庫(kù)，該載體庫(kù)中的每個(gè)質(zhì)粒包含有任意7個(gè)堿基對(duì)的任一排列組合序列。
[0016] 因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供一個(gè)載體庫(kù)，該載體庫(kù)用pNew載體質(zhì)粒構(gòu)建得到，該載 體庫(kù)中包含有16384(4 7)個(gè)質(zhì)粒，每個(gè)質(zhì)粒包含有任意7個(gè)堿基對(duì)的任一排列組合序列。
[0017] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種應(yīng)用所述的載體庫(kù)合成目的基因的方法，該方法包括以 下步驟：
[0018] (1)將預(yù)合成的目標(biāo)基因 DNA序列按照每個(gè)片段82bp進(jìn)行劃分，各個(gè)片段從頭至 尾依次進(jìn)行命名為G1、G2、G3、G4、G5……，每個(gè)片段之間有3個(gè)堿基的重復(fù)。
[0019] (2)根據(jù)依次命名的G1、G2等小片段的序列分別在所構(gòu)建的7bp質(zhì)粒庫(kù)中找到對(duì) 應(yīng)的質(zhì)粒，每個(gè)82bp的片段需要16個(gè)帶有7bp堿基的質(zhì)粒；
[0020] (3)將查找得到的對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒分別用AgeI、BsgI和XmaI、BseRI酶切，用Kana (卡 納霉素）抗生素進(jìn)行遺傳篩選，得到含12bp目的基因序列的質(zhì)粒；將對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒分別用 BsgI、SalI和BseRI、XhoI酶切，用相應(yīng)的Cam(氯霉素）抗生素進(jìn)行遺傳篩選，得到含22bp 目的基因序列的質(zhì)粒；將對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒分別用Bsgl、BamHI和BseRI、Bglll酶切，用相應(yīng)的 Gem(慶大霉素）抗生素進(jìn)行遺傳篩選，得到含42bp目的基因序列的質(zhì)粒；將對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒分 別用BsgI、SpeI和BseRI、XbaI酶切，用相應(yīng)的Spc (壯觀霉素）抗生素進(jìn)行遺傳篩選，得到 含82bp目的基因序列的質(zhì)粒；
[0021] (4)要合成大于82bp以上的DNA片段，用XG1、XG2、XG3、XG4、XG5......質(zhì)粒作為供 體質(zhì)粒，再另加切好的受體載體質(zhì)粒puc-Kana，做金門(mén)克隆反應(yīng)，通過(guò)金門(mén)克隆反應(yīng)能夠?qū)?基因片段拼接成完整基因；如果目的基因比較大，則進(jìn)行第二輪金門(mén)克隆以達(dá)到合成較大 片段的目的基因。
[0022] 本發(fā)明方法中合成的含82bp目的基因序列的質(zhì)粒XG1、XG2、XG3、XG4、XG5……為 壯觀霉素抗性，同時(shí)所構(gòu)建的金門(mén)克隆受體載體puc-Kana有g(shù)fp表達(dá)盒式結(jié)構(gòu)，受體質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌落是發(fā)光的，而且puc-Kana受體載體是kana抗性，與供體質(zhì)粒的抗性不一 樣，所以最后轉(zhuǎn)化所得重組子可以通過(guò)Kana抗性的正篩選作用和gfp的負(fù)篩選作用，這樣 可以使后期篩選重組子的工作進(jìn)一步的簡(jiǎn)潔化和效率化。將PCR鑒定正確的重組子送測(cè) 序，就可以得到正確的完整的DNA序列。由于在后期的金門(mén)克隆反應(yīng)中只涉及到酶切連接 反應(yīng)，所以只要合成的小片段DNA是正確的，就不會(huì)突變，這樣拼接準(zhǔn)確率很高。
[0023] 本發(fā)明合成方法主要利用抗性基因重構(gòu)的遺傳篩選機(jī)制，從已構(gòu)建好的含有7bp 目的基因序列的質(zhì)粒出發(fā)，質(zhì)粒分別用（AgeI、BsgI)和（XmaI、BseRI)酶切，然后再用1\連 接酶16°C連接處理，重構(gòu)Kana抗性基因，轉(zhuǎn)化后得到含12bp目的基因片段質(zhì)粒。再依次 重構(gòu)Cam、Gem、Spc抗性基因，即將對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒分別用（BsgI、SalI)和（BseRI、XhoI)酶切， 用相應(yīng)的Cam抗生素進(jìn)行遺傳篩選；將對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒分別用（BsgI、BamHI)和（B SeRI、BglII) 酶切，用相應(yīng)的Gem抗生素進(jìn)行遺傳篩選；將對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒分別用（Bsgl、Spel)和（BseRI、 Xbal)酶切，用相應(yīng)的Spc抗生素進(jìn)行遺傳篩選。四輪重構(gòu)后得到若干含82bp目的基因 序列的質(zhì)粒，最后以82bp供體質(zhì)粒和puc-Kana受體載體做金門(mén)克隆反應(yīng)（；Engler, C.，R. Kandzia, and S. Marillonnet, A one pot,one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One, 2008. 3 (11) : 36-47)，通過(guò)金門(mén)克隆反應(yīng)將基因片段拼 接成完整的目的基因。如果目的基因比較大，可以進(jìn)行第二輪金門(mén)克隆以達(dá)到合成較大片 段的目的基因。
[0024] 本發(fā)明的基因合成方法與現(xiàn)有的基因合成方法相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0025] (1)本發(fā)明方法不需要利用引物進(jìn)行基因合成，只要構(gòu)建好了包含任意7bp的載 體庫(kù)（16384種）就可以達(dá)到一勞永逸的效果，以后合成基因都可以不用合成引物，合成成 本低。
[0026] (2)突變率極其低。由于整個(gè)合成過(guò)程是從質(zhì)粒出發(fā)，只是經(jīng)過(guò)酶切酶連等操作， 沒(méi)有常規(guī)DNA合成方法中引物引進(jìn)的突變，而且沒(méi)有經(jīng)過(guò)PCR過(guò)程，所以突變率極低，甚至 為零。
[0027] (3)本發(fā)明合成方法在整個(gè)過(guò)程都是進(jìn)行的酶切酶連操作，沒(méi)有引進(jìn)PCR等操作， 而且利用抗性重構(gòu)的原理，用重構(gòu)的相應(yīng)抗生素進(jìn)行遺傳篩選，準(zhǔn)確率高，無(wú)需測(cè)序，進(jìn)一 步降低成本。
[0028] (4)本發(fā)明合成方法可以合成特殊的基因序列，如高度重復(fù)序列，Poly A等Poly 序列，可以用于研究一些復(fù)雜結(jié)構(gòu)或一些調(diào)控序列的機(jī)理，由于該方法是從質(zhì)粒出發(fā)，酶切 酶連，不需要PCR，可以合成PCR方法不能合成的高度重復(fù)序列。
[0029] (5)本發(fā)明合成方法操作簡(jiǎn)單，酶切產(chǎn)物可以直接連接轉(zhuǎn)化，無(wú)需純化。由于是通 過(guò)抗性基因這個(gè)遺傳因素來(lái)篩選，在加入相應(yīng)抗生素后，只有重構(gòu)出相應(yīng)抗性的轉(zhuǎn)化子才 能生長(zhǎng)起來(lái)，而那些沒(méi)有酶切的質(zhì)?；蛘哌B接錯(cuò)誤的產(chǎn)物由于不能得到完整的抗性基因， 不能在加有抗生素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
[0030] (6)本發(fā)明合成方法可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。由于篩選是用抗性基因篩選，不需要涂 平板等操作，故可以進(jìn)行溶液操作，從而實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。
[0031] (7)本發(fā)明合成方法有利于構(gòu)建突變體文庫(kù)，對(duì)于做定點(diǎn)誘變和定向進(jìn)化效率非 常高，篩選工作量比現(xiàn)有的構(gòu)建突變體庫(kù)的方法可以降低2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0032] 本發(fā)明所渉及到的術(shù)語(yǔ)定義
[0033] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。
[0034] 術(shù)語(yǔ)"載體"意指在基因工程重組DNA技術(shù)中將DNA片段（目的基因）轉(zhuǎn)移至受 體細(xì)胞的一種能自我復(fù)制的DNA分子。
[0035] 術(shù)語(yǔ)"質(zhì)粒"意指一類(lèi)存在于細(xì)菌和真菌細(xì)胞中獨(dú)立于DNA而自主復(fù)制的共價(jià)、閉 合、環(huán)狀DNA分子。
[0036] 術(shù)語(yǔ)"基因"意指遺傳的基本單元，是DNA或RNA分子上具有遺傳信息的特定核苷 酸序列。
[0037] 術(shù)語(yǔ)"抗性基因"意指抗性的遺傳因子，如Kana抗性基因。
[0038] 術(shù)語(yǔ)"重疊延伸PCR"意指由于采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊 鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸，將不同來(lái)源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來(lái)。
[0039] 術(shù)語(yǔ)"基因序列"意指使用一串字母表示的真實(shí)的或者假設(shè)的攜帶基因信息的DNA 分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)。
[0040] 術(shù)語(yǔ)"酶切"意指用限制性?xún)?nèi)切酶去切割DNA片斷，由于酶具有專(zhuān)一性，一種酶只 能識(shí)別一種特定的脫氧核苷酸序列，所以可以用特定的這種酶去切割相應(yīng)的DNA片斷，進(jìn) 而達(dá)到定向切割的目的。
[0041] 術(shù)語(yǔ)"DNA測(cè)序"意指分析特定DNA片段的堿基序列，也就是腺嘌呤（A)、胸腺嘧啶 (T)、胞嘧啶（C)與鳥(niǎo)嘌呤的（G)排列方式。 【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0042] 圖1為載體pNew的構(gòu)建過(guò)程。
[0043] 圖2為利用重構(gòu)抗性基因合成82bp片段的過(guò)程。
[0044] 圖3為以82bp供體質(zhì)粒和puc-Kana受體載體做金門(mén)克隆反應(yīng)的原理和流程圖。 【具體實(shí)施方式】
[0045] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0046] 實(shí)驗(yàn)材料
[0047] 商品化的 pet23a、pet28b 和 pDEST32 均購(gòu)于 Invitrogen 公司。
[0048] 實(shí)施例1構(gòu)建pNew載體質(zhì)粒
[0049] 1、構(gòu)建線性載體骨架pNew
[0050] 以商品化載體pet23a質(zhì)粒為模板，以ori-PF/ori-PR為引物（序列見(jiàn)表1)，通過(guò) PCR擴(kuò)增得到線性載體骨架pNew (1. 9kb)(其核苷酸序列為SEQ ID N0. 21所示），在PCR過(guò) 程中通過(guò)引物ori-PR引進(jìn)限制性?xún)?nèi)切酶BseRI的識(shí)別位點(diǎn)。
[0051] 2、構(gòu)建大片段5SGCK
[0052] 設(shè)計(jì)引物5Spc-PF/5Spc-PR(序列見(jiàn)表1)，以RNALIC質(zhì)粒為模板，通過(guò)PCR擴(kuò) 增得到5Spc片段（656bp)(其核苷酸序列為SEQ ID N0. 22所示），擴(kuò)增好的5Spc片段 5'和3'端分別帶上了限制性酶切位點(diǎn)Bsgl和Xbal ;設(shè)計(jì)引物5Gem-PF/5Gem-PR(序列 見(jiàn)表1)，以PDEST32質(zhì)粒為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到5Gem片段（535bp)(其核苷酸序列 為SEQ ID N0. 23所示），擴(kuò)增好的5Gem片段3'端帶上了限制性酶切位點(diǎn)Bglll ;設(shè)計(jì)引 物5Cam-PF/5Cam-PR(序列見(jiàn)表1)，以pDEST32質(zhì)粒為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到5Cam片段 (371bp)(其核苷酸序列為SEQ ID N0. 24所示），擴(kuò)增好的5Cam片段3'端帶上了限制性酶 切位點(diǎn)Xhol ;設(shè)計(jì)引物5Kana-PF/5Kana-PR (序列見(jiàn)表1)，以pet28b質(zhì)粒為模板，通過(guò)PCR 擴(kuò)增得到5Kana片段（556bp)(其核苷酸序列為SEQ ID N0. 25所示），擴(kuò)增好的5Kana片段 3'端帶上了限制性酶切位點(diǎn)Xmal ;設(shè)計(jì)引物Amp-PF/Amp-PR(序列見(jiàn)表1)，以pet23a質(zhì)粒 為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到Amp盒式結(jié)構(gòu)（969bp)(其核苷酸序列為SEQ ID N0. 26所示）；每 個(gè)擴(kuò)增的片段之間都引入了 18_20bp的同源序列，再把這幾個(gè)片段通過(guò)5Spc-PF和Amp-PR 引物逐次做重疊延伸PCR (Overlap Extension PCR)，S卩通過(guò)引物5Spc-PF和5Gem-PR擴(kuò)增 將5Spc片段和5Gem片段連接；通過(guò)引物5Spc-PF和5Cam-PR擴(kuò)增將5Spc5Gem片段與5Cam 片段連接；通過(guò)引物5Spc-PF和5Kana-PR擴(kuò)增將5Spc5Gem5Cam片段與5Kana片段連接；通 過(guò)引物5Spc-PF和Amp-PR擴(kuò)增將5Spc5Gem5Cam5Kana片段與Amp盒式結(jié)構(gòu)連接得到一個(gè) 大片段5SGCK(3kb)，其核苷酸序列為SEQ ID N0. 27所示。
[0053] 3、構(gòu)建大片段3KCGS
[0054] 設(shè)計(jì)引物3Kana-PF/3Kana_PR (序列見(jiàn)表1)，以pet28b為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到 3Kana片段（531bp)(其核苷酸序列為SEQ ID N0. 28所示），擴(kuò)增好的3Kana片段5'端帶上 了限制性酶切位點(diǎn)Agel ;設(shè)計(jì)引物3Cam-PF/3Cam-PR(序列見(jiàn)表1)，以pDEST32為模板，通 過(guò)PCR擴(kuò)增得到3Cam片段（566bp)(其核苷酸序列為SEQ ID N0. 29所示），擴(kuò)增好的3Cam片 段5'端帶上了限制性酶切位點(diǎn)Sail ;設(shè)計(jì)引物3Gem-PF/3Gem-PR(序列見(jiàn)表1)，以pDEST32 為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到3Gem片段（279bp)(其核苷酸序列為SEQ ID N0. 30所示），擴(kuò) 增好的3Gem片段5'端帶上了限制性酶切位點(diǎn)BamHI ;設(shè)計(jì)引物3Spc-PF/3Spc-PR(序列見(jiàn) 表1)，以RNALIC為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到3Spc片段（387bp)(其核苷酸序列為SEQ ID NO. 31所示），擴(kuò)增好的3Spc片段5'端帶上了限制性酶切位點(diǎn)Spel ;每個(gè)片段之間都引入 了 18-20bp的同源序列，再把這幾個(gè)片段通過(guò)3Kana-PF和3Spc-PR引物逐次做重疊延伸 PCR (Overlap Extension PCR)，S卩通過(guò)引物 3Kana-PF 和 3Cam-PR 擴(kuò)增將 3Kana 片段和 3Cam 片段連接；通過(guò)引物3Kana-PF和3Gem-PR擴(kuò)增將3Kana3Cam片段與3Gem片段連接；通過(guò) 引物3Kana-PF和3Spc-PR擴(kuò)增將3Kana3Cam3Gem片段與3Spc片段連接得到一個(gè)大片段 3KCGS(1705bp)，其核苷酸序列為SEQ ID N0. 32所示。
[0055] 4、構(gòu)建pNew載體質(zhì)粒
[0056] 通過(guò)無(wú)酶克隆的方式（Zhu D, Zhong X，Tan R, Chen L, Huang G, Li J, et al. High-throughput cloning of human liver complete open reading frames using homologous recombination in Escherichia coli. [J]Anal Biochem. 2010 ； 397(2) : 162-167)把3個(gè)片段：線性載體骨架pNew、5SGCK、3KCGS克隆到一個(gè)完整的載體 上。經(jīng)過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶酶切和測(cè)序鑒定得到正確的pNew載體質(zhì)粒（其核苷酸序列為SEQ ID N0. 33所示），命名為pNew載體質(zhì)粒（構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖1)。
[0057] 表1載體pNew構(gòu)建中使用的引物
[0058]
【權(quán)利要求】
1. 合成基因用的pNew載體質(zhì)粒，其特征在于：其核苷酸序列為SEQ ID NO. 33所示。
2. -種構(gòu)建權(quán)利要求1所述pNew載體質(zhì)粒的方法，其特征在于，包括以下步驟： 構(gòu)建核苷酸序列為SEQ ID NO. 21所示的線性載體骨架pNew ; 擴(kuò)增核苷酸序列為SEQ ID NO. 27所示的抗性基因片段5SGCK以及核苷酸序列為SEQ ID NO. 32 所示的 3KCGS ; 將線性載體骨架pNew、抗性基因片段5SGCK和抗性基因片段3KCGS克隆到一個(gè)完整的 載體上，即得。
3. 用權(quán)利要求1所述的pNew載體質(zhì)粒構(gòu)建得到的載體庫(kù)。
4. 按照權(quán)利要求3所述的載體庫(kù)，其特征在于：包含有16384個(gè)質(zhì)粒。
5. 按照權(quán)利要求4所述的載體庫(kù)，其特征在于：載體庫(kù)中的每個(gè)質(zhì)粒包含有任意7個(gè) 堿基對(duì)的任一排列組合序列。
6. -種無(wú)引物的基因合成方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將預(yù)合成的目標(biāo)基因 DNA序列進(jìn)行分組； (2) 將依次命名的小片段分別在權(quán)利要求3所述的質(zhì)粒庫(kù)中找到對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒；其中，每 個(gè)82bp的片段需要16個(gè)帶有7bp堿基的質(zhì)粒； (3) 將查找得到的對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒分別用AgeI、BsgI和XmaI、BseRI酶切，用Kana(卡納霉 素）抗生素進(jìn)行遺傳篩選，得到含12bp目的基因序列的質(zhì)粒；將對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒分別用Bsgl、 Sail和BseRI、XhoI酶切，用相應(yīng)的Cam(氯霉素）抗生素進(jìn)行遺傳篩選，得到含22bp目的 基因序列的質(zhì)粒；將對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒分別用BsgI、BamHI和BseRI、BglII酶切，用相應(yīng)的Gem(慶 大霉素）抗生素進(jìn)行遺傳篩選，得到含42bp目的基因序列的質(zhì)粒；將對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒分別用 Bsgl、Spel和BseRI、Xbal酶切，用相應(yīng)的Spc (壯觀霉素）抗生素進(jìn)行遺傳篩選，得到含 82bp目的基因序列的質(zhì)粒； (4) 要合成大于82bp以上的DNA片段，用XG1、XG2、XG3、XG4、XG5……質(zhì)粒作為供體質(zhì) 粒，再另加切好的受體載體質(zhì)粒puc-Kana，做金門(mén)克隆反應(yīng)，通過(guò)金門(mén)克隆反應(yīng)能夠?qū)⒒?片段拼接成完整基因。
7. 按照權(quán)利要求6所述的基因合成方法，其特征在于：預(yù)合成的目的基因按每個(gè)片段 82bp進(jìn)行分組。
8. 按照權(quán)利要求6所述的基因合成方法，其特征在于：目的基因分組后的每個(gè)片段之 間有3個(gè)堿基的重復(fù)。
9. 按照權(quán)利要求6所述的基因合成方法，其特征在于：金門(mén)克隆受體載體puc-Kana有 gfp表達(dá)盒式結(jié)構(gòu)和kana抗性基因。
10. 按照權(quán)利要求6所述的基因合成方法，其特征在于：如果目的基因比較大，則進(jìn)行 第二輪金門(mén)克隆以合成較大片段的目的基因直至合成所需要的目的基因。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104109683SQ201410211672
【公開(kāi)日】2014年10月22日 申請(qǐng)日期:2014年5月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月19日
【發(fā)明者】馬立新, 沈鶴霄, 陳晚蘋(píng), 華權(quán)高, 張桂敏, 楊明波, 陳羽西 申請(qǐng)人:武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司, 湖北大學(xué)