一種水培液中微生物基因組dna的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種水培液中微生物基因組DNA的提取方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明的提取方法先將水培液中的雜質(zhì)通過(guò)定性濾紙進(jìn)行過(guò)濾去除，進(jìn)一步0.22μm的濾膜收集水體微生物，用液氮/65℃水浴的凍融方法破碎微生物細(xì)胞，再加入SDS及溶菌酶裂解細(xì)胞，CTAB結(jié)合蛋白質(zhì)及多聚糖、游離核酸，加入酚、氯仿混合物萃取后，萃取液用異丙醇沉淀，最終獲得水體微生物基因組DNA。利用該方法提取的核酸純度較高，且產(chǎn)量較高。試驗(yàn)證明，此法提取的水體微生物DNA，完整性好，純度較高，進(jìn)一步純化后可用于下游的基因組文庫(kù)構(gòu)建、qPCR、高通量測(cè)序等。
【專利說(shuō)明】一種水培液中微生物基因組DNA的提取方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種水培液中微生物基因組DNA的提取方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 水培種植法作為無(wú)土栽培的重要形式，具有節(jié)肥、節(jié)水、省工、省藥、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、潔 凈等優(yōu)點(diǎn)。由于其不受時(shí)間限制，可供植物利用的營(yíng)養(yǎng)充分、均勻等優(yōu)點(diǎn)，因而在現(xiàn)代農(nóng)業(yè) 設(shè)施生產(chǎn)過(guò)程中逐漸被大范圍采用。在這些水培種植系統(tǒng)中，微生物也廣泛存在于水培液 中，這些微生物能夠?qū)θ芤褐械牡V質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素以及植物根系釋放的次生物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在 植物與礦質(zhì)養(yǎng)分之間起到了重要的媒介作用，因而是水培種植條件下，植物能夠正常生長(zhǎng) 發(fā)育的重要因子。因此，研究水培液中微生物的結(jié)構(gòu)組成與數(shù)量分布，能夠?yàn)閮?yōu)化植物的最 佳水培種植條件提供重要基礎(chǔ)。然而，由于傳統(tǒng)的微生物研究方法存在著無(wú)法獲得環(huán)境中 全部微生物的限制因素，由此導(dǎo)致對(duì)相應(yīng)環(huán)境中微生物遺傳背景信息的了解也不全面，從 而也限制了水體微生物宏基因組信息的深入發(fā)掘。利用現(xiàn)代生物技術(shù)，如高通量測(cè)序技術(shù)， 以及基于PCR的末端限制性長(zhǎng)度態(tài)性（T-RFLP)技術(shù)、單鏈構(gòu)型多態(tài)性（SSCP)、變性/溫度 梯度凝膠電泳（DGGE/TGGE)技術(shù)，長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP)技術(shù)則克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法所造成的 土壤微生物信息大量丟失的弊端，更加全面、精確地揭示出水體微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的 多樣性。
[0003] 對(duì)于此，如何簡(jiǎn)便快捷地從水培液中獲得微生物的DNA是深入研究水培液中微生 物組成的關(guān)鍵，由于水培液的相對(duì)體積大，微生物分布分散，直接提取往往會(huì)因?yàn)闃悠烦跏?體積、微生物數(shù)量低而導(dǎo)致提取效率低下，因此需要研制適用于水體微生物DNA提取的方 便、快捷、實(shí)用的方法，解決使用常規(guī)方法所獲得的微生物總量少、細(xì)胞裂解率低、DNA產(chǎn)量 低的問(wèn)題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一種水培液中微生物基因組DNA的提取方法，利用該方法提取的核酸 純度較高，且產(chǎn)量較高。
[0005] -種水培液微生物基因組DNA的提取方法，包括以下步驟： (1) 水體樣品雜質(zhì)的去除：取l〇(T250ml的水培液用定性濾紙過(guò)濾:Γ5次，并收集濾 液；進(jìn)一步用孔徑為〇. 22 μ m的濾膜進(jìn)行超濾，通過(guò)濾膜收集水體中的菌體，剪碎濾膜并置 于10ml的離心管中； (2) 水體微生物細(xì)胞裂解：往步驟（l)10ml的離心管中加入500 μ 1無(wú)菌水，漩渦震蕩， 然后在液氮2?3 min和65°C水浴5min中反復(fù)凍融:Γ5次，凍融結(jié)束后，于4°C 13000rpm 下離心lOmin，棄上清，收集沉淀，加入ΙΟΟμΙ 1XTE，重懸沉淀，加入30μ1 50mg/ml的溶 菌酶，37°C溫浴1?3h，再加入500 μ 1的10% SDS，以及10ul 20mg/ml的蛋白酶K，37°C溫浴 T2h ； (3) 核酸游離及沉淀：步驟（2)溫浴結(jié)束后加入200 μ 1 5M的NaCl，加入100 μ 1 65°C 預(yù)熱的3XCTAB/NaCl，65°C溫浴lh，待冷卻后，加入等體積的酚、氯仿混合液，酚、氯仿的體 積比為（1:1)，4°C llOOOrpm離心lOmin，取上清，再加入等體積的酚、氯仿混合液，酚、氯 仿的體積比為（1:1)，4°C llOOOrpm離心lOmin，將上清移至新管并加入等體積預(yù)冷的異 丙醇，-20°C放置lh，然后4°C llOOOrpm離心20min，棄上清，沉淀用70%乙醇重懸并于 4°C llOOOrpm下離心lOmin，棄上清，沉淀于超凈工作臺(tái)中吹干后溶于3(T50ul的無(wú)菌水 中，-80°C保存。
[0006] 所述水培液微生物基因組DNA的提取方法，優(yōu)選的步驟如下： (1)水體樣品雜質(zhì)的去除：取l〇〇ml的水溶液用定性濾紙重復(fù)過(guò)濾3次，以去除水體中 含有的雜質(zhì)，并收集濾液；進(jìn)一步用孔徑為〇. 22 μ m的濾膜進(jìn)行超濾，通過(guò)濾膜收集水體中 的菌體，剪碎濾膜并置于l〇ml的離心管中。
[0007] 水體微生物細(xì)胞裂解：往離心管中加入500 μ 1無(wú)菌水，漩渦震蕩，液氮凍2min后 置于65°C水浴鍋中溫浴5min，如此反復(fù)凍融3次。凍融結(jié)束后，樣品于4°C 13000rpm下離 心10min，棄上清，收集沉淀。加入100μ1 1XTE，重懸沉淀。加入30μ1 50mg/ml的溶菌 酶，37°C溫浴lh。加入500μ 1的10% SDS，以及10ul 20mg/ml的蛋白酶K，37°C溫浴lh。
[0008] 核酸游離及沉淀：加入200μ 1 5M的NaCl，加入100μ 1 65°C預(yù)熱的3XCTAB/ NaCl，65°C溫浴lh。待冷卻后，加入等體積酚氯仿，酚、氯仿的體積比為（1:1)，4°C llOOOrpm離心10min，取上清，再加入等體積的酚氯仿，4°C llOOOrpm離心10min，將上清 移至新管。加入等體積的預(yù)冷異丙醇，_20°C放置lh，4°C llOOOrpm離心20min，棄上清。 沉淀用70%乙醇于4°C llOOOrpm下離心10min，棄上清，沉淀于超凈工作臺(tái)中吹干后溶于 30ul的無(wú)菌水中。
[0009] 本發(fā)明的提取方法先將水培液中的雜質(zhì)通過(guò)定性濾紙進(jìn)行過(guò)濾去除，進(jìn)一步 0. 22 μ m的濾膜收集水體微生物，用液氮/65°C水浴的凍融方法破碎微生物細(xì)胞，再加入 SDS及溶菌酶裂解細(xì)胞，CTAB結(jié)合蛋白質(zhì)及多聚糖、游離核酸，加入酚、氯仿混合物萃取后， 萃取液用異丙醇沉淀，最終獲得水體微生物基因組DNA。所得的核酸的純度可達(dá)1.758,濃 度達(dá)15. 3 μ g/ μ 1。對(duì)提取的DNA進(jìn)行純化，可進(jìn)行16srDNA的擴(kuò)增和熒光定量PCR分析， 結(jié)果見(jiàn)圖3、4、5,證實(shí)本發(fā)明的方法提取水體微生物DNA的有效性。反復(fù)試驗(yàn)證明，此法提 取的水體微生物DNA，完整性好，純度較高，進(jìn)一步純化后可用于下游的基因組文庫(kù)構(gòu)建、 qPCR、高通量測(cè)序等。
[0010] 本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)： 1.適合于不同來(lái)源的水培液以及水體，具有廣譜適用性。
[0011] 2.所得的DNA完整性好、純度較高。
[0012] 3.提取便捷、無(wú)需復(fù)雜的處理工藝，提取的條件不嚴(yán)格。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1為不同水稻水培液中微生物DNA的電泳檢測(cè)結(jié)果，其中1-4泳道為水稻品種 Lemont水培液中的微生物DNA; 5-8為水稻品種PI312777水培液中的微生物DNA。
[0014] 圖2為稗草水培液中水體微生物DNA的電泳檢測(cè)結(jié)果，其中1-3泳道為稗草的酚 酸水培液中的微生物DNA; 4-6為稗草的萜類水培液中的微生物DNA。
[0015] 圖3為以水培液微生物DNA為模板進(jìn)行16srDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果， 其中1表示以水稻品種Lemont水培液中的微生物DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，2表示以水稻 品種PI312777水培液中的微生物DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，3表示lOObp DNA Marker， 4表示以稗草Lemont水培液中的微生物DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0016] 圖4為以水稻水培液微生物DNA為模板進(jìn)行16srDNA的定量PCR檢測(cè)結(jié)果。
[0017] 圖4 (1)表示定量PCR的擴(kuò)增曲線。
[0018] 圖4 (2)表示定量PCR的熔解曲線。
[0019] 圖5為以水稻水培液微生物DNA為模板進(jìn)行ITS的定量PCR檢測(cè)結(jié)果。
[0020] 圖5 (1)表示定量PCR的擴(kuò)增曲線。
[0021] 圖5 (2)表示定量PCR的熔解曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 實(shí)施例1 本發(fā)明的水培液微生物基因組DNA的提取方法，具體步驟如下： (1) 原料：水稻的水培液，來(lái)自福建福州(福建農(nóng)林大學(xué)教學(xué)農(nóng)場(chǎng)）； (2) 水體樣品雜質(zhì)的去除：取100ml的水稻水溶液用定性濾紙進(jìn)行過(guò)濾，以去除水體中 含有的雜質(zhì)，重復(fù)過(guò)濾3次，收集濾液；進(jìn)一步用孔徑為0. 22 μ m的濾膜進(jìn)行超濾，通過(guò)濾膜 收集水體中的菌體，剪碎濾膜并置于l〇ml的離心管中，用于提取基因組DNA。
[0023] ⑶水體微生物細(xì)胞裂解：往離心管中加入500 μ 1無(wú)菌水，漩渦震蕩，液氮凍2min 后置于65°C水浴鍋中溫浴5min，如此反復(fù)凍融3次。凍融結(jié)束后，樣品于4°C 13000rpm下 離心lOmin，棄上清，收集沉淀。加入ΙΟΟμΙ 1XTE，重懸沉淀。加入30μ1 50mg/ml的溶 菌酶，37°C溫浴lh。加入500μ 1的10% SDS，以及10ul 20mg/ml的蛋白酶K，37°C溫浴lh。
[0024] (4)核酸游離及沉淀：加入200 μ 1 5M的NaCl，加入100 μ 1 65°C預(yù)熱的CTAB/ NaCl(3X)，65°C溫浴lh。待冷卻后，加入等體積酚氯仿，4°C llOOOrpm離心10min，取上 清，再加入等體積的酚氯仿，4°C llOOOrpm離心10min，將上清移至新管。加入等體積的 預(yù)冷異丙醇，-2〇°C放置lh，4°C llOOOrpm離心20min，棄上清。沉淀用70%乙醇于4°C llOOOrpm下離心10min，棄上清，沉淀于超凈工作臺(tái)中吹干后溶于30ul的無(wú)菌水中。取 5μ1 DNA水溶液，于1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，其中1-4泳道均為水稻 品種Lemont水培液中的微生物DNA; 5-8均為水稻品種ΡΙ312777水培液中的微生物DNA， 從圖中可見(jiàn)各個(gè)泳道中的DNA條帶清晰，條帶亮度，泳道中的雜質(zhì)背景淡，重復(fù)性好，提取 效果佳。以此DNA模板，利用qPCR對(duì)細(xì)菌、真菌的數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)，其中細(xì)菌16srDNA的qPCR 擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖4(1)，圖中A箭頭指示以水稻品種PI312777水培液DNA為模板進(jìn)行qPCR的 擴(kuò)增曲線，B箭頭指示以水稻品種Lemont水培液DNA為模板進(jìn)行qPCR的擴(kuò)增曲線，兩種 DNA模板的擴(kuò)增過(guò)程中CT值重復(fù)性好。圖4(2)表示細(xì)菌16srDNA熔解曲線，箭頭C指示 16srDNA熔解曲線形成的峰。真菌ITS的qPCR擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖5(1)，圖中D箭頭指示以水 稻品種PI312777水培液DNA為模板進(jìn)行qPCR的擴(kuò)增曲線，E箭頭指示以水稻品種Lemont 水培液DNA為模板進(jìn)行qPCR的擴(kuò)增曲線，兩種DNA模板的擴(kuò)增過(guò)程中CT值重復(fù)性好。圖 5(2)表示細(xì)菌ITS熔解曲線，箭頭F指示ITS熔解曲線形成的峰。從圖中可以看出各熔解 曲線主峰單一，并明顯高于基線。上述試驗(yàn)結(jié)果表明運(yùn)用此方法提取得到的DNA能夠用于 下游的試驗(yàn)，進(jìn)一步對(duì)水培液中的微生物數(shù)量進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果顯示每毫升PI312777水培液 中約有細(xì)菌1200個(gè)，真菌1465個(gè)；每毫升Lemont水培液中約有細(xì)菌490個(gè)，真菌190個(gè)。
[0025] 實(shí)施例2 (1) 原料：稗草的水培液，來(lái)自福建福州(福建農(nóng)林大學(xué)教學(xué)農(nóng)場(chǎng)）； (2) 水體樣品雜質(zhì)的去除：取100ml的稗草水溶液用定性濾紙進(jìn)行過(guò)濾，以去除水體中 含有的雜質(zhì)，重復(fù)過(guò)濾3次，收集濾液；進(jìn)一步用孔徑為0. 22 μ m的濾膜進(jìn)行超濾，通過(guò)濾膜 收集水體中的菌體，剪碎濾膜并置于l〇ml的離心管中，用于提取基因組DNA。
[0026] ⑶水體微生物細(xì)胞裂解：往離心管中加入500 μ 1無(wú)菌水，漩渦震蕩，液氮凍2min 后置于65°C水浴鍋中溫浴5min，如此反復(fù)凍融3次。凍融結(jié)束后，樣品于4°C 13000rpm下 離心lOmin，棄上清，收集沉淀。加入ΙΟΟμΙ 1XTE，重懸沉淀。加入30μ1 50mg/ml的溶 菌酶，37°C溫浴lh。加入500μ 1的10% SDS，以及10ul 20mg/ml的蛋白酶K，37°C溫浴lh。
[0027] (4)核酸游離及沉淀：加入200 μ 1 5M的NaCl，加入100 μ 1 65°C預(yù)熱的CTAB/ NaCl(3X)，65°C溫浴lh。待冷卻后，加入等體積酚氯仿，4°C llOOOrpm離心10min，取上 清，再加入等體積的酚氯仿，4°C llOOOrpm離心10min，將上清移至新管。加入等體積的 預(yù)冷異丙醇，-2〇°C放置lh，4°C llOOOrpm離心20min，棄上清。沉淀用70%乙醇于4°C llOOOrpm下離心10min，棄上清，沉淀于超凈工作臺(tái)中吹干后溶于30ul的無(wú)菌水中。取 5 μ 1 DNA水溶液，于1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2,其中1-3泳道為稗草的酚 酸水培液中的微生物DNA; 4-6為稗草的萜類水培液中的微生物DNA，從圖中可見(jiàn)DNA的條 帶清晰，條帶亮度，泳道中的雜質(zhì)背景淡，重復(fù)性好，提取效果佳。以此DNA模板，利用qPCR 對(duì)其中粘細(xì)菌的數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示稗草的酚酸水培液中每毫升最高含有粘細(xì)菌800 個(gè)，稗草的萜類水培液中每毫升最高含有粘細(xì)菌260個(gè)。
[0028] 此外，分別以實(shí)例1、實(shí)例2中的水稻品種PI312777、Lemont以及稗草水培液中微 生物的DNA為模板進(jìn)行細(xì)菌16srDNA的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如 圖3,其中泳道1是以水稻品種Lemont水培液中的微生物DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道 2是以水稻品種PI312777水培液中的微生物DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道是4以稗草 Lemont水培液中的微生物DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，從圖中可以看出16srDNA條帶清晰， 亮度高，此結(jié)果再次說(shuō)明了運(yùn)用此方法提取得到的DNA能夠用于下游的試驗(yàn)。
【權(quán)利要求】
1. 一種水培液中微生物基因組DNA的提取方法，其特征在于：所述方法具體包括以下 步驟： (1) 水體樣品雜質(zhì)的去除：取l〇(T250ml的水培液用定性濾紙過(guò)濾:Γ5次，并收集濾 液；進(jìn)一步用孔徑為〇. 22 μ m的濾膜進(jìn)行超濾，通過(guò)濾膜收集水體中的菌體，剪碎濾膜并置 于10ml的離心管中； (2) 水體微生物細(xì)胞裂解：往步驟（l)10ml的離心管中加入500 μ 1無(wú)菌水，漩渦震蕩， 然后在液氮2?3 min和65°C水浴5min中反復(fù)凍融:Γ5次，凍融結(jié)束后，于4°C 13000rpm 下離心lOmin，棄上清，收集沉淀，加入ΙΟΟμΙ 1XTE，重懸沉淀，加入30μ1 50mg/ml的溶 菌酶，37°C溫浴1?3h，再加入500μ1的10% SDS，以及10ul 20mg/ml的蛋白酶K，37°C溫浴 T2h ； (3) 核酸游離及沉淀：步驟（2)溫浴結(jié)束后加入200 μ 1 5M的NaCl，加入100 μ 1 65°C 預(yù)熱的3XCTAB/NaCl，65°C溫浴lh，待冷卻后，加入等體積的酚、氯仿混合液，酚、氯仿的體 積比為（1:1)，4°C llOOOrpm離心10min，取上清，再加入等體積的酚、氯仿混合液，酚、氯 仿的體積比為（1:1)，4°C llOOOrpm離心10min，將上清移至新管并加入等體積預(yù)冷的異 丙醇，-20°C放置lh，然后4°C llOOOrpm離心20min，棄上清，沉淀用70%乙醇重懸并于 4°C llOOOrpm下離心10min，棄上清，沉淀于超凈工作臺(tái)中吹干后溶于3(T50ul的無(wú)菌水 中，-80°C保存。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104087573SQ201410270513
【公開(kāi)日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月18日
【發(fā)明者】方長(zhǎng)旬, 林文雄, 李程勛, 李穎哲, 林威鵬 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)