一種穩(wěn)定抗壞血酸過(guò)氧化物酶結(jié)構(gòu)與活性的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種穩(wěn)定抗壞血酸過(guò)氧化物酶結(jié)構(gòu)與活性的方法，屬于酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明利用將酶蛋白溶液加熱變性后低溫復(fù)性的方式，穩(wěn)定了抗壞血酸過(guò)氧化物酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)，顯著延長(zhǎng)了抗壞血酸過(guò)氧化物酶失活的時(shí)間。利用本發(fā)明的方法步驟簡(jiǎn)單、操作方便，無(wú)需添加保護(hù)劑或改變酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)，避免了可能存在的外源添加劑干擾或一級(jí)結(jié)構(gòu)改變帶來(lái)的催化活力下降等缺陷。對(duì)抗壞血酸過(guò)氧化物酶性質(zhì)的研究和應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。
【專利說(shuō)明】一種穩(wěn)定抗壞血酸過(guò)氧化物酶結(jié)構(gòu)與活性的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定抗壞血酸過(guò)氧化物酶結(jié)構(gòu)與活性的方法，具體地，將酶蛋白 加熱變性后低溫復(fù)性保存，屬于酶工程領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 抗壞血酸過(guò)氧化物酶也稱維生素 C過(guò)氧化物酶，是植物細(xì)胞中防御外界氧化脅迫 和植物本身活性氧代謝的重要抗氧化酶類，與超氧化物歧化酶和谷胱甘肽還原酶共同參與 抗壞血酸一谷胱甘肽循環(huán)，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)活性氧代謝平衡，從而保護(hù)由于過(guò)量活性氧存在 引起的細(xì)胞內(nèi)成分，如維生素 C含量的改變。
[0003] 十字花科蕓薹屬植物中包括了重要的蔬菜及油料作物，如甘藍(lán)、芥藍(lán)、油菜等，這 些蔬菜和作物中維生素 C含量的高低直接影響到它們的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。而維生素 C含量與胞質(zhì) 中抗壞血酸過(guò)氧化物酶活性密切相關(guān)。對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank中已公布的蕓薹屬植物胞質(zhì)過(guò)氧 化物酶的同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)它們具有高度的同源性。
[0004] 然而抗壞血酸過(guò)氧化物酶極易變性失活，直接影響到對(duì)抗壞血酸過(guò)氧化物酶酶學(xué) 性質(zhì)的研究和應(yīng)用。添加保護(hù)劑和酶修飾技術(shù)是目前常用的酶穩(wěn)定方法（張永帥等.酶修 飾研究進(jìn)展.食品工業(yè)科技，2014 (2) 350-353.)，但是外源物質(zhì)的添加會(huì)影響酶的純度，酶 的結(jié)構(gòu)修飾往往會(huì)影響酶的催化活性。所以開發(fā)一種簡(jiǎn)便的、維持原有抗壞血酸過(guò)氧化物 酶純度和結(jié)構(gòu)的酶穩(wěn)定方法，具有研究與應(yīng)用價(jià)值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)便的、穩(wěn)定抗壞血酸過(guò)氧化物酶結(jié)構(gòu)和活性的方 法。
[0006] 實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下：
[0007] (1)抗壞血酸過(guò)氧化物酶的制備
[0008] 選取芥藍(lán)胞質(zhì)過(guò)氧化物酶基因（GenBank登錄號(hào)：KC894750)，克隆到質(zhì)粒 pET-28b(+)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，37°C培養(yǎng)，至0D6(?達(dá)到0. 6,向培養(yǎng)基中加入質(zhì)量體積 比終濃度為0. 024 %異丙基-β -D-硫代半乳糖苷，誘導(dǎo)表達(dá)4h，收獲菌體，加入質(zhì)量體積 比濃度為 6. 25 % 的 Tris-HCl 緩沖液（0. 02mol/L、pH7. 5)，超聲破碎 15min，lOOOOrpm 離 心25min得到上清液，經(jīng)0. 22 μ m膜過(guò)濾后，上樣于His Trap FF crude層析柱，用結(jié)合緩 沖液（0. 02mol/L、pH7. 4的磷酸緩沖液；質(zhì)量體積比濃度為2. 93% NaCl ;質(zhì)量體積比濃度 為0.14%咪唑）平衡，再用洗脫液（0.02111〇1/1、？!17.4的磷酸緩沖液，質(zhì)量體積比濃度為 2. 93% NaCl，質(zhì)量體積比濃度為3. 5 %咪唑）洗脫，收集抗壞血酸過(guò)氧化物酶組分，冷凍干 燥，得到純酶粉。
[0009] (2)抗壞血酸過(guò)氧化物酶的熱變性
[〇〇1〇] 將步驟⑴得到的純酶粉，用磷酸鹽緩沖液（〇. 〇2mol/L、pH7. 5)配制成質(zhì)量體積 比濃度為0.019% -0. 19%的酶蛋白溶液，80-90°C下溫育20-30min，測(cè)定酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)和
【權(quán)利要求】
1. 一種穩(wěn)定抗壞血酸過(guò)氧化物酶結(jié)構(gòu)與活性的方法，其特征在于，將酶蛋白加熱變性 后低溫復(fù)性保存。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述穩(wěn)定抗壞血酸過(guò)氧化物酶結(jié)構(gòu)與活性的方法，其特征在于，力口 熱溫度為80-90°C，時(shí)間為20-30min。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述穩(wěn)定抗壞血酸過(guò)氧化物酶結(jié)構(gòu)與活性的方法，其特征在于，復(fù) 性溫度為4°C，保存時(shí)間為14-42天。
【文檔編號(hào)】C12N9/08GK104046599SQ201410283548
【公開日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2014年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月19日
【發(fā)明者】唐蕾, 席加富, 張建華, 張宏建, 毛忠貴 申請(qǐng)人:江南大學(xué)