一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)擬南芥是否為雄性不育株系的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)擬南芥是否為雄性不育株系的方法。本發(fā)明提供了一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)擬南芥是否為雄性不育株系的方法，包括如下步驟：檢測(cè)待測(cè)擬南芥中ACT8基因核苷酸序列第982位核苷酸，若第982位核苷酸為G，則待測(cè)擬南芥為或候選為雄性可育株系，若第982位核苷酸為A，則待測(cè)擬南芥為或候選為雄性不育株系。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了ACT8基因單點(diǎn)突變體fiz1的純合株系，可用ACT8基因第982位核苷酸的多態(tài)性確定待測(cè)擬南芥是否雄性可育。
【專利說明】一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)擬南芥是否為雄性不育株系的方 法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)擬南芥是否為雄性 不育株系的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 植物雄性不育是指植物在有性繁殖過程中，由于受到遺傳或環(huán)境因素的影響造成 雌性器官正常而雄性器官不正常，不能產(chǎn)生正常功能的花粉的現(xiàn)象。植物雄性不育是利用 植物雜種優(yōu)勢(shì)的有效途徑，在生產(chǎn)實(shí)踐上具有重要的利用價(jià)值。如利用雄性不育的品種為 母本，選配好與特定父本品種的雜交組合，就可以免除人工去雄手續(xù)，節(jié)約人力，降低種子 成本，并且可以保證種子的純度，提高雜交種子的生產(chǎn)效率。目前人們已經(jīng)在許多作物中利 用雄性不育性進(jìn)行雜交種子的生產(chǎn)。
[0003] 植物雄性不育是受核不育基因控制，或者受核不育基因和細(xì)胞質(zhì)不育基因相互作 用共同控制的。根據(jù)對(duì)雄性不育的相關(guān)基因和分子機(jī)理的研究，可將雄性不育分為以下幾 類：減數(shù)分裂異常導(dǎo)致的雄性不育、胼胝體代謝異常導(dǎo)致的雄性不育、絨粘層發(fā)育異常導(dǎo)致 的雄性不育、花粉壁發(fā)育異常導(dǎo)致的雄性不育、花藥開裂異常導(dǎo)致的雄性不育以及其他類 型的雄性不育。
[0004] 減數(shù)分裂是真核生物進(jìn)行有性生殖形成生殖細(xì)胞所經(jīng)歷的一個(gè)高度保守的細(xì)胞 分裂過程。親本生殖細(xì)胞染色體只復(fù)制一次，而細(xì)胞連續(xù)分裂兩次，使得最終形成的配子中 染色體數(shù)目減半。減數(shù)分裂是一個(gè)高度復(fù)雜調(diào)控的過程，在此過程中，一系列基因精確而有 序的表達(dá)，確保減數(shù)分裂過程順利完成。然而任一基因發(fā)生突變都有可能影響減數(shù)分裂過 程中染色體的行為和育性。植物中大多數(shù)雄性不育都發(fā)生在減數(shù)分裂的某個(gè)時(shí)期（Bhatia et al. 2001)。
[0005] 微絲，或肌動(dòng)蛋白絲，是組成真核生物細(xì)胞骨架的最纖細(xì)的絲狀結(jié)構(gòu)，在進(jìn)化中 高度保守。它是由單個(gè)肌動(dòng)蛋白單體聚合而成直徑為7nm的線狀結(jié)構(gòu)，具有高度靈活性， 能夠作用于細(xì)胞的胞質(zhì)分裂和變形運(yùn)動(dòng)，改變細(xì)胞形狀，響應(yīng)機(jī)械應(yīng)力等。在減數(shù)分裂過 程中，微絲和微管一起組裝成減數(shù)分裂特有的細(xì)胞骨架裝配，確保核分裂和胞質(zhì)分裂的精 確完成。肌動(dòng)蛋白是一種單體多肽鏈的球狀蛋白質(zhì)，它廣泛的存在于真核細(xì)胞中，一般由 374-377個(gè)氨基酸組成。在擬南芥中，已經(jīng)有10個(gè)ACTIN基因被鑒定出來，但到目前為止， 尚未有人報(bào)道擬南芥中肌動(dòng)蛋白的基因在減數(shù)分裂中的生物學(xué)功能。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)擬南芥是否為雄性不育株系 的方法。
[0007] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：檢測(cè)待測(cè)擬南芥中ACT8基因核苷酸序列第 982位核苷酸，若第982位核苷酸為G，則待測(cè)擬南芥為或候選為雄性可育株系，若第982位 核苷酸為A，則待測(cè)擬南芥為或候選為雄性不育株系。
[0008] 上述方法中，所述檢測(cè)待測(cè)擬南芥中ACT8基因核苷酸序列的方法包括如下步驟： 以所述待測(cè)擬南芥的基因組作為模板，用由序列5所示的單鏈DNA分子和序列表中序列6 所示的單鏈DNA分子組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，測(cè)序PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0009] 上述方法中，待測(cè)擬南芥為野生型擬南芥和/或與野生型擬南芥相比僅在ACT8基 因核苷酸序列第982位核苷酸發(fā)生由G到A的突變的擬南芥。
[0010] 本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)擬南芥是否為雄性不育株系 的試劑盒。
[0011] 本發(fā)明提供的試劑盒，包括比對(duì)卡，所述比對(duì)卡上記載ACT8基因野生型序列和 ACT8基因突變型序列；
[0012] 所述ACT8基因野生型序列為序列表中序列3 ;
[0013] 所述ACT8基因突變型序列為序列表中序列1。
[0014] 本發(fā)明提供的試劑盒，所述試劑盒還包括引物對(duì)，所述引物對(duì)為由序列5所示的 單鏈DNA分子和序列表中序列6所示的單鏈DNA分子組成的引物對(duì)。
[0015] 上述的試劑盒在鑒定或輔助鑒定待測(cè)擬南芥是否為雄性不育株系中的應(yīng)用也是 本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0016] 本發(fā)明第三個(gè)目的是提供一種蛋白。
[0017] 本發(fā)明提供的蛋白，是如下（a)或（b):
[0018] (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0019] (b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
[0020] 編碼上述蛋白的DNA分子也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0021] 上述DNA分子是如下（1)-(3)中任一種的DNA分子：
[0022] (1)編碼區(qū)為序列表中的序列1所示的DNA分子；
[0023] (2)在嚴(yán)格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼且具有相同功能的蛋白的 DNA分子；
[0024] (3)與⑴限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具 有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至 少具有99%同源性且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子。
[0025] 上述嚴(yán)格條件為在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0· 1 % SDS 和 1 X SSC，0· 1 % SDS 各洗膜一次。
[0026] 含有上述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù) 的范圍。
[0027] 擴(kuò)增上述DNA分子全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0028] 上述蛋白、上述DNA分子或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在鑒定 或輔助鑒定待測(cè)擬南芥是否為雄性不育株系中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0029] 本發(fā)明第四個(gè)目的是提供一種培育雄性不育擬南芥的方法。
[0030] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：使野生型擬南芥的基因組中ACT8基因的第 982位核苷酸由G變?yōu)锳，基因組其它序列不變，獲得雄性不育擬南芥。
[0031] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了 ACTS基因單點(diǎn)突變體fizzyl (以下簡(jiǎn)稱fizl)的 純合株系，可用直接測(cè)序法檢驗(yàn)ACT8基因第982位核苷酸的多態(tài)性以確定待測(cè)擬南芥是否 雄性可育，與現(xiàn)有技術(shù)相比，該方法具有高效率、高靈敏度、高準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，它能夠直觀地 得到突變堿基的類型及其準(zhǔn)確位置，并且大大降低了實(shí)驗(yàn)成本。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 圖1為野生型和突變體中ACT8基因的測(cè)序結(jié)果
[0033] 圖2為野生型和突變體的株高比較
[0034] 圖3為野生型和突變體的角果比較
[0035] 圖4為野生型和突變體的花粉掃描電鏡圖像

【具體實(shí)施方式】
[0036] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0037] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0038] 實(shí)施例1、ACT8基因與雄性不育之前關(guān)系的研究
[0039] 1、擬南芥的培養(yǎng)
[0040] 將營(yíng)養(yǎng)土和蛭石以1:1的體積比混合，高壓蒸汽滅菌40min，裝入盆中后用自 來水浸透。經(jīng)過4°C春化處理1天后野生型擬南芥和fizl突變體（記載在如下文獻(xiàn)中： Defects in Dynamics and Functions of Actin Filament in Arabidopsis Caused by the Dominant-Negative Actin fizl-Induced Fragmentation of Actin Filament, Plant Cell Physiol，51 (2) :333-338(2010);公眾可從中國(guó)科學(xué)院植物研究所獲得）的種子，用牙簽均 勻地點(diǎn)在營(yíng)養(yǎng)土的表面，并覆蓋保鮮膜5d。擬南芥的培養(yǎng)條件為22°C，16h光照，8h黑暗。
[0041] 2、擬南芥ACT8基因的鑒定
[0042] 分別提取野生型擬南芥和fizl突變體的基因組DNA，以如下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0043] 正向引物：ACT8-f5' -ATGGCCGATGCTGATGACATTCAAC-3,（序列 5)
[0044] 反向引物：ACT8-r5' -TTAGAAGCATTTTCTGTGGACAATG-3'（序列 6)
[0045] 得到1409bp的PCR產(chǎn)物（野生型）和1409bp的PCR產(chǎn)物（fizl)。
[0046] 測(cè)序PCR產(chǎn)物（野生型），其核苷酸序列為序列表中序列3,編碼序列表中序列4 所示的蛋白；
[0047] PCR產(chǎn)物（fizl)，其核苷酸序列為序列表中序列1，編碼序列表中序列2所示的蛋 白。
[0048] 測(cè)序結(jié)果如圖1所示，與野生型相比，fizl突變體中ACT8基因核苷酸序列為將序 列3自5'末端第982位核苷酸由鳥嘌呤G突變成腺嘌呤A，命名為ACT8m基因，編碼的蛋白 為 ACT8m。
[0049] 上述可以看出，野生型擬南芥和fizl突變體的基因組中，只有ACTS基因核苷酸序 列的第982位核苷酸有差別，猜測(cè)會(huì)帶來表型編號(hào)，因此下面對(duì)野生型和突變體進(jìn)行表型 觀察。
[0050] 3、形態(tài)學(xué)觀察
[0051] 1)地上部生長(zhǎng)發(fā)育比較
[0052] 對(duì)突變體fizl和野生型擬南芥進(jìn)行株型觀察，結(jié)果如圖2所示，其中左側(cè)為野生 型，右側(cè)為突變體，可以看出，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段fizl突變體表現(xiàn)在地上部的卷曲和節(jié)點(diǎn)的結(jié) 節(jié)，野生型生長(zhǎng)直立，莖部無卷曲
[0053] 2)角果比較
[0054] 對(duì)突變體fizl和野生型擬南芥（WT)生殖生長(zhǎng)階段角果大小和角果內(nèi)的種子數(shù)目 進(jìn)行比較，結(jié)果如圖3所示，A為角果大小，B為角果中種子數(shù)目，可以看出，fizl突變體的角 果明顯小于野生型的角果，突變體中每個(gè)角果的種子數(shù)目也少于野生型。
[0055] 由于突變體的每個(gè)角果中的結(jié)實(shí)量均少于野生型，因此推測(cè)fizl突變體中配子發(fā) 育可能存在異常。
[0056] 3)花粉觀測(cè)
[0057]

【權(quán)利要求】
1. 一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)擬南芥是否為雄性不育株系的方法，包括如下步驟：檢測(cè) 待測(cè)擬南芥中ACT8基因核苷酸序列第982位核苷酸，若第982位核苷酸為G，則待測(cè)擬南 芥為或候選為雄性可育株系，若第982位核苷酸為A，則待測(cè)擬南芥為或候選為雄性不育株 系。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述檢測(cè)待測(cè)擬南芥中ACT8基因核苷酸 序列的方法包括如下步驟：以所述待測(cè)擬南芥的基因組作為模板，用由序列5所示的單鏈 DNA分子和序列表中序列6所示的單鏈DNA分子組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物，測(cè)序PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
3. -種鑒定或輔助鑒定待測(cè)擬南芥是否為雄性不育株系的試劑盒，包括比對(duì)卡，所述 比對(duì)卡上記載ACT8基因野生型序列和ACT8基因突變型序列； 所述ACT8基因野生型序列為序列表中序列3 ; 所述ACT8基因突變型序列為序列表中序列1。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括引物對(duì)，所述引物對(duì) 為由序列5所示的單鏈DNA分子和序列表中序列6所示的單鏈DNA分子組成的引物對(duì)。
5. 權(quán)利要求3或4所述的試劑盒在鑒定或輔助鑒定待測(cè)擬南芥是否為雄性不育株系中 的應(yīng)用。
6. -種蛋白，是如下（a)或（b): (a) 由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b) 將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
7. 編碼權(quán)利要求6所述蛋白的DNA分子，其是如下（1)-(3)中任一種的DNA分子： (1) 編碼區(qū)為序列表中的序列1所示的DNA分子； (2) 在嚴(yán)格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼且具有相同功能的蛋白的DNA分 子； (3) 與（1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少 具有99%同源性且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子。
8. 含有權(quán)利要求7所述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌；或擴(kuò)增 權(quán)利要求7所述DNA分子全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)。
9. 權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述DNA分子或權(quán)利要求4所述重組載體、 表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在鑒定或輔助鑒定待測(cè)擬南芥是否為雄性不育株系中的應(yīng) 用。
10. -種培育雄性不育擬南芥的方法，包括如下步驟：使野生型擬南芥的基因組中 ACT8基因的第982位核苷酸由G變?yōu)锳，基因組其它序列不變，獲得雄性不育擬南芥。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104046694SQ201410291448
【公開日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2014年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月25日
【發(fā)明者】林金星, 王菁, 林森 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所